检测烟草eIF4E-1基因单碱基插入突变的Bi-PASA标记引物及方法与流程

本发明属于植物生物
技术领域：
，具体涉及一种检测烟草eif4e-1基因单碱基插入突变的bi-pasa标记引物，本发明还涉及一种检测烟草eif4e-1基因单碱基插入突变的方法。
背景技术：
：烟草是重要的经济作物之一，烟草马铃薯y病毒病，又称为脉斑病，是由马铃薯y病毒(potatovirusy，pvy)引起的一种烟草系统性侵染病害，常年造成烟叶产量和质量损失。选育和种植抗病品种是防治该病最经济有效的方法。研究显示，烟草pvy的抗源分为两大类，一类是以vam(ti1406)及其衍生种质tn86为代表的隐性基因位点(vam和va)控制的抗性，另一类是以非洲烟草(nicotianaafricana)为代表的对pvy免疫的抗性。目前，受va位点控制的抗源被广泛应用于烟草抗病育种。为了提高va位点的育种利用效率，国内外研究者相继开发了与va位点相关的分子标记，如randomlyamplifiedpolymorphicdna(rapd)和sequencecharacterizedamplifiedregion(scar)标记。这些标记与va位点间的遗传距离较远，导致利用标记数据判断抗性表型误差较大，进而限制了这类分子标记在育种中的实际应用。在抗性获得的研究中，noguchis等认为va基因型烟草植株的抗性是由于对pvy感病的基因片段的缺失造成的。2014年，julio等采用新一代测序技术比较烟草抗感pvy近等基因系转录组，明确了烟草eif4e-1基因为烟草pvy隐性抗病基因，即感pvy基因，该基因属于真核细胞翻译起始因子(eukaryoticinitiationfactor，简称为eif)的一种类型。2015年，刘勇等根据烟草eif4e-1基因及其家族基因的序列信息，开发出一个与eif4e-1野生型等位基因紧密连锁的显性标记，由于该标记不能作为eif4e-1等位基因缺失的共显性标记，限制了其在实际育种的应用。2018年，dluge等利用rna测序的方法比较了ti1406、k326-va和k326三种烟草中的基因表达差异，发现在具有pvy抗性的ti1406和k326-va中，真核翻译起始因子eif4e-1基因所在的染色体区段发生大范围的缺失，由于建立eif4e-1等位基因缺失的共显性标记需要了解该基因缺失连接片段的序列特点，而eif4e-1基因及其侧翼序列的大范围缺失，造成研究者未能有效地克隆到该基因的缺失连接片段、获得序列信息，从而未能开发出等位基因缺失的共显性标记。此前，本单位通过对烟草品种开阳小黑烟中的eif4e-1等位基因进行测序和序列比对鉴定到1个基因内特异性单碱基插入位点，随后针对该突变位点开发出共显性分子标记并已向国家专利局提出名为“烟草eif4e-1突变位点特异性共显性分子标记及其应用”的发明专利申请，申请号为“201810989309.6”，该发明公开了一种烟草eif4e-1单碱基插入突变位点特异性共显性分子标记，标记检测由2个单一pcr扩增反应组成。与野生型位点检测相关的标记命名为asm-w，扩增引物对为fw/rwm，扩增片段大小543bp；与突变型位点检测相关的标记命名为asm-m，扩增引物对为fm/rwm，扩增片段片段大小543bp。利用该标记和引物可以对pvy抗性供体亲本的回交转育后代单株的基因型进行准确选择，但每个单株基因型的检测都需要进行2个单一pcr扩增，操作步骤较为复杂。双向等位基因特异pcr(bi-directionalpcramplificationofspecificalleles,bi-pasa)能够在一个pcr反应体系里同时检测两个不同长度的等位基因片段，是一种更为简捷的等位基因分型方法，其通过1次pcr反应即可检测已知突变位点的类型。最近几年，利用双向等位基因特异pcr在人类疾病、花生和大麦等生物检测上已经收到越来越多的研究者重视。但双向等位基因特异pcr要求在同一反应体系中同时对不同的基因类型进行特异性扩增，因而影响其扩增效果的因素较多，不同引物之间是否形成二聚体、退火温度差、引物的配比、反应温度等不同参数均具有较高的要求，因此，将检测不同基因类型的特异性引物混合，利用双向等位基因特异pcr在同一反应体系中进行检测，未必能够获得理想效果，只能退而求其次，利用不同基因类型的特异性引物单独检测各自对应的基因类型。本试验在开阳小黑烟中检测到突变型eif4e-1等位基因的基础上，探索通过双向等位基因特异pcr在同一反应中完成两个eif4e-1等位基因分子标记的扩增，为烟草抗性育种分子标记相关研究提供一种更加省时、省力、经济有效的方法。技术实现要素：本发明的目的是提供一种检测烟草eif4e-1基因单碱基插入突变的bi-pasa标记引物。本发明的另一目的是提供一种检测烟草eif4e-1基因单碱基插入突变的检测试剂盒。本发明的再一目的是提供一种检测烟草eif4e-1基因单碱基插入突变的方法，该方法基于bi-pasa的四个引物的核苷酸序列，以及该引物在检测携带突变型eif4e-1等位基因的抗pvy烟草(rr型)、携带野生型eif4e-1等位基因的感pvy烟草(rr型)及同时含有突变型和野生型eif4e-1等位基因的杂合型烟草(rr型)的用法本发明的技术方案是：第一方面，本发明提供一种检测烟草eif4e-1基因单碱基插入突变的bi-pasa标记引物，其特征在于，所述引物序列如下：外引物p的核苷酸序列如seqidno.1所示，具体为：5’-caagtacccttttcctactaaaatctataactaag-3’；外引物q的核苷酸序列如seqidno.2所示，具体为：5’-gccggacagaattagtgtcacataaaattgaagattttac-3’；内引物a的核苷酸序列如seqidno.3所示，具体为：5’-cggcactttttccactgtcgaagattttag-3’；内引物b的核苷酸序列如seqidno.4所示，具体为：5’-gaatatgaaataacttacccccaaaaact-3’；上述引物序列中带下划线的碱基为引入的错配碱基，小写字母碱基为非互补富含g+c序列。第二方面，本发明提供一种含有所述标记引物的检测试剂盒。包括以下步骤：步骤1、提取烟草品种基因组dna；步骤2、利用所述的引物或检测试剂盒扩增烟草品种基因组dna，获得pcr扩增产物；步骤3、将pcr扩增产物进行电泳，对基因型进行判定。可选地，步骤3中将pcr扩增产物进行电泳，对基因型进行判定具体按照以下步骤实施：将扩增产物于琼脂糖凝胶电泳分离，100v恒定电泳50min检测，如果扩增产物为713bp和440bp两种片段，显示标记个体基因型为rr型，为纯合野生型个体，电泳条带为两条带；如果扩增产物为714bp和325bp两种片段，显示标记个体基因型为rr型，为纯合突变型个体，电泳条带为两条带；如果扩增产物为713/714bp，440bp和325bp三条带，显示标记个体基因型为rr型，为杂合突变型个体，电泳条带为三条带。可选地，步骤1中烟草品种基因组dna为采用axyprep基因组dna小量制备试剂盒提取烟草品种基因组dna得到。可选地，所述pcr反应程序为：(1)94℃预变性3min(2)94℃变性30sec；(3)58℃退火30sec；(4)72℃延伸30sec；重复(2)→(4)30个循环；(5)终延伸10min；(6)4℃保存。本发明的有益效果是：本发明是在突变位点附近设计两个外引物和两个内引物，内引物的3’终末端为突变位点，同时在内引物3’末端引入错配碱基，当引物错配时，延伸效率降低，最后根据扩增片段的数量和大小检测突变是否发生。采用本发明的四个引物，结合一次pcr和电泳，便可以准确地检测出eif4e-1单碱基插入突变等位基因回交转育过程中回交和自交后代的基因型，提高分子标记辅助轮回选择效率，加快育种进程。本发明将原来利用2对引物分管扩增抗感等位基因的2个单一的pcr扩增反应简化为四引物单管pcr扩增，操作简便、省时省力。附图说明图1：两份烟草材料eif4e-1基因的gdna扩增(琼脂糖凝胶电泳)，其中1、2分别代表k326和开阳小黑烟两份烟草材料，m为dna分子量标准dl15000；图2：两份烟草材料eif4e-1基因的cdna扩增(琼脂糖凝胶电泳)，其中1、2分别代表k326和开阳小黑烟两份烟草材料，m为dna分子量标准100bpladder；图3：来自开阳小黑烟、k326和红大的eif4e-1基因组dna序列和cdna序列比对。(a)烟草eif4e-1基因的dna序列包含5个外显子和4个内含子。黑色方框代表外显子，水平线代表内含子。k326、开阳小黑烟(kai)和红花大金元(hongda)的基因组序列比对，大写字母代表外显子序列，小写字母代表内含子序列，位于开阳小黑烟eif4e-1基因第一外显子中的单一插入碱基(t)以灰色背景显示。(b)开阳小黑烟eif4e-1基因的两种剪接模式。kai-1：连续剪接模式；kai-2：可变剪接模式。白色方框代表外显子。位于kai-1和kai-2第一外显子中的单一插入碱基(t)和位于kai-1第二外显子10-12nt位置的提前终止密码子均以箭头标出。图4：bi-pasa遗传标记内引物(a和b)结合位点和序列(内引物a与eif4e1.s等位基因的反义链特异结合，内引物b与eif4e1.kai等位基因的正义链特异结合)；图5：bi-pasa遗传标记引物对抗感材料基因组dna扩增情况。m：dl2000marker；1：开阳小黑烟；2：k326×开阳小黑烟；3：红花大金元×开阳小黑烟；4：云烟87×开阳小黑烟；5：k326；6：红花大金元；7：云烟87；(a)a/q引物扩增结果；(b)b/p引物扩增结果；(c)a/q/b/p引物扩增结果；图6：bi-pasa遗传标记在f2群体和亲本中的扩增。p1：开阳小黑烟；p2：k326；1-21：f2代单株。2、6、9、13、20和21单株为纯合突变型(rr)，扩增产物电泳带型与亲本1开阳小黑烟相同，为两条电泳条带；7、8、11、17、18和22单株为纯合野生型(rr)，扩增产物电泳带型与亲本2k326相同，为两条电泳条带；其余单株为杂合突变型(rr)，扩增产物电泳条带为三条带。具体实施方式1、烟草eif4e基因位点差异分析和验证基于前人对pvy抗病相关基因的研究，申请人通过基因组重测序技术，对高抗、高感pvy烟草品种全基因组进行测序并对eif4e和eif(iso)4e基因家族成员进行深入的序列比较。结果发现：与高感品种的保守性相比，高抗品种在eif4e-1基因区域存在不同程度的碱基插入或缺失突变。为进一步验证全基因组重测序所获得候选突变位点，根据eif4e-1的基因组序列和eif4e家族成员的序列设计烟草eif4e-1的上下游引物，上游引物4-s：ctaaaatctataactaagtacatagaaaacacacg；下游引物4-a：ggtacttaaactgtcaagtggcagc，如seqidno.5、6所示；以感pvy烤烟品种k326和抗pvy晒烟品种开阳小黑烟为材料，分别通过pcr和rt-pcr技术扩增烟草eif4e-1的gdna和cdna全序列(图1、图2)。将扩增得到的基因组序列进行测序，与中国烟草基因组数据库中的红花大金元(含有野生型eif4e-1基因的pvy感病材料)数据进行比对发现，烟草eif4e-1基因的dna序列包含5个外显子和4个内含子，在开阳小黑烟eif4e-1基因的第一外显子区域存在一个保守的单碱基插入突变(图3a)。此外，cdna扩增产物的测序结果显示，在开阳小黑烟中扩增出的两个片段为eif4e-1基因的两种剪接模式，包括一个连续剪接(kai-1)和一个可变剪接(kai-2)，其中位于第一外显子中的单一插入碱基(t)在两种剪接模式的转录物中依然存在(图3b)。在开阳小黑烟eif4e-1基因的连续剪接模式中，由于第一外显子中单碱基的插入，造成其后序列发生移码突变，在第二外显子10-12nt位置出现一个假定的终止密码子，推测可能产生一个截短蛋白。相比，在可变剪接模式中，由于剪接受体点的改变，造成kai-2转录物的长度变短，其中第2外显子完全消失。2、检测烟草eif4e-1基因单碱基插入突变的bi-pasa标记引物2.1分子标记引物设计此前，为了将无效等位基因eif4e-1.kai与其野生型基因区分开来，申请人已经针对该无效等位基因建立了一个共显性标记，该标记检测由2个单一pcr扩增反应组成(请参阅申请人提交的已公开的申请号为201810989309.6、名称为“烟草eif4e-1突变位点特异性共显性分子标记及其应用”的发明专利申请，文中与野生型位点检测相关的标记命名为asm-w，与突变型位点检测相关的标记命名为asm-m)。为了进一步简化上述标记检测操作步骤，建立一种更加省时、省力、经济有效的标记检测方法，本申请根据双向等位基因特异性pcr扩增原理，对eif4e-1.kai基因的单碱基插入突变位点设计1套特异引物，包括2个内引物(a和b)和2个外引物(p和q)(请参考图4)。在引物设计过程中，为提高延伸反应的特异性，在内引物的3'端倒数第2位人为引入1个错配碱基；为消除pb和aq两个片段的不对称扩增现象，在a/q引物5'端添加非互补富含g+c序列。表1bi-pasa遗传标记引物序列a大写字母碱基为互补序列，小写字母碱基为非互补富含g+c序列。序列中带下划线的碱基为引入的错配碱基。2.2烟草品种基因组dna提取采用axyprep基因组dna小量制备试剂盒提取烟草品种基因组dna，具体方法如下：1)、取100mg烟草的幼嫩叶片置于2ml离心管中，于55℃开盖烘干24h，利用geno/grinder2010spex高通量动植物组织研磨机振荡研磨成细粉状后，一次性加入350μlpbs、0.9μlrnasea、150μlbufferc-l、20μlproteinasek，立刻漩涡振荡1min混合均匀，56℃水浴30min；2)、加入350μlbufferp-d，漩涡振荡30s混合均匀，12000rpm离心10min；3)、将dna制备管置于2ml离心管中，将步骤1.2的离心后上清液移至制备管中，12000rpm离心1min；4)、弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入500μlbufferw1，12000rpm离心1min；5)、弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入700μlbufferw2，12000rpm离心1min，以同样的方法，用700μlbufferw2再洗涤一次。6)、弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，12000rpm离心1min；7)、将dna制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加100μleluent或去离子水，室温静置10min，12000rpm离心1min洗脱dna。2.3利用引物或包含引物的检测试剂盒扩增烟草品种基因组dna，获得pcr扩增产物pcr扩增1)pcr反应体系(20μl)：premixtaqtmhotstartversion10μl外引物q0.4μm内引物a0.4μm外引物p0.15μm内引物b0.15μm模板dna100-200ngddh2o加至终体积20μl2)pcr反应循环程序：3)取5ul扩增产物在2％的琼脂胶上进行电泳检测。pcr反应在c1000touchtmpcr仪中进行。扩增产物于2.5％琼脂糖凝胶电泳分离，100v恒定电泳50min检测，请参考图5，如果扩增产物为713bp和440bp两种片段，显示标记个体基因型为rr型，为纯合野生型个体，电泳条带为两条带；如果扩增产物为714bp和325bp两种片段，显示标记个体基因型为rr型，为纯合突变型个体，电泳条带为两条带；如果扩增产物为713/714bp，440bp和325bp三条带，显示标记个体基因型为rr型，为杂合突变型个体，电泳条带为三条带。2.4f2代群体pvy抗性鉴定苗期采用病毒汁液摩擦接种法对开阳小黑烟和k326构建的500个单株的f2群体进行pvy抗性鉴定，接种20天后调查单株抗病情况，经鉴定群体内感病单株为371株，抗病单株为129株，符合3:1的分离比率，证明开阳小黑烟的pvy抗性受隐性单基因控制(以r基因表达)。2.5利用bi-pasa遗传标记鉴定f2代群体单株基因型采用axyprep基因组dna小量制备试剂盒提取f2代单株基因组dna(方法同上)，使用bi-pasa遗传标记引物对f2代群体内不同单株的dna进行pcr扩增(方法同上)，结果如图6所示，p1为亲本1开阳小黑烟，p2为亲本2k326，1-21为f2代单株。2、6、9、13、20和21单株的基因型与亲本1开阳小黑烟相同，即纯合突变型(rr)，抗性鉴定结果显示这些单株具有pvy抗病性。7、8、11、17、18和22单株的基因型与亲本2k326相同，即纯合野生型(rr)，抗性鉴定结果显示这些单株具有pvy感病性。其余单株为杂合突变型(rr)，抗性鉴定结果显示这些单株同样具有pvy感病性。由此可见，利用bi-pasa遗传标记区分eif4e1基因纯合野生型、纯合突变型和杂合突变型的准确率为100％。sequencelisting序列表<110>贵州省烟草科学研究院<120>检测烟草eif4e-1基因单碱基插入突变的bi-pasa标记引物及方法<160>6<210>1<211>35<212>dna<213>人工序列<400>1caagtacccttttcctactaaaatctataactaag35<210>2<211>40<212>dna<213>人工序列<400>2gccggacagaattagtgtcacataaaattgaagattttac40<210>3<211>30<212>dna<213>人工序列<400>3cggcactttttccactgtcgaagattttag30<210>4<211>29<212>dna<213>人工序列<400>4gaatatgaaataacttacccccaaaaact29<210>5<211>35<212>dna<213>人工序列<400>5ctaaaatctataactaagtacatagaaaacacacg35<210>6<211>35<212>dna<213>人工序列<400>6ggtacttaaactgtcaagtggcagc25当前第1页12