一种提高食源性致病微生物LAMP扩增反应效率的方法及应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高食源性致病微生物lamp扩增反应效率的方法及其应用。

背景技术：

环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification,lamp）是2000年发明的一种等温核酸体外扩增技术，近年来该技术针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌等食源性致病微生物的lamp检测方法已初步建立，以快速检测食品中是否含有这些致病微生物。该技术依赖于一种具有链置换特性的dna聚合酶（如bst酶），利用一对外引物（f3/b3）和一对内引物（fip/bip）与靶基因的6个不同区域退火杂交，使产物自我配对形成一种特殊的哑铃状结构，再通过内引物与哑铃状结构的互补配对，在等温条件下进行，扩增15min-1h即可产生10⁹～10¹⁰倍的扩增子。由于该技术灵敏度高，若实验环境被气溶胶污染，则很容易产生假阳性结果。另外，由于lamp扩增反应过程中涉及到多条引物，引物间难免发生非特异性结合产生引物二聚体，会消耗反应体系中的反应底物，从而降低了反应的效率，降低检测灵敏度降低，同时又容易导致结果假阳性，使得结果误判。因此，如何建立一种既有更高检测灵敏度、又抑制非特异性扩增的lamp扩增反应体系，一直是包括食源性致病微生物等检测对象在内的lamp扩增技术领域急需解决的技术难题。

胶体金是由氯金酸（haucl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小（一般在1nm-150nm之间）的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称为胶体金。近年来，胶体金在应用于核酸扩增反应方面有零星报道，如李海阔等（2004，2005）公开了胶体金在提高pcr反应效率方面的应用。zhouetal.（2013）在lamp扩增反应结束后，将胶体金作为显色剂，添加到反应产物中，用于指示扩增反应结果。kumvongpinetal.（2016）和yeetal.（2018）则报道了胶体金在提高高危型人乳头瘤病毒以及轮状病毒病毒和ß-actin基因lamp扩增反应效率方面的研究，但尚未有将胶体金应用于食源性致病微生物lamp扩增反应效率的报道。

本发明提供了一种提高食源性致病微生物lamp扩增反应效率的方法，能够进一步提高检测的灵敏度、抑制非特异性扩增，可以很好的解决食品安全领域在lamp扩增检测方面遇到的技术难题。

技术实现要素：

针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌等食源性致病微生物在现有lamp扩增技术中所遇到的由于灵敏度高、实验环境易被气溶胶污染以及多条引物间发生非特异性结合而容易产生假阳性和灵敏度降低的问题，本发明目的在于提供一种提高食源性致病微生物lamp扩增反应效率的方法。

本发明的再一目的在于：提供一种上述方法在检测中的应用。

本发明目的通过下述方案实现：一种提高食源性致病微生物lamp扩增反应效率的方法，以环介导等温扩增lamp为基础，将胶体金添加在食源性致病微生物lamp扩增反应体系中，实现对lamp扩增的优化，包括如下：

（1）lamp扩增反应体系优化：将胶体金加入食源性致病微生物lamp扩增反应体系当中，然后进行lamp扩增，其中用量为：在25µl的食源性致病微生物lamp扩增反应体系中加入胶体金的终浓度为0.25-15nmol/l；

（2）lamp扩增产物检测：可通过电泳检测、浊度检测或显色检测。

其中，胶体金制备：胶体金试剂利用现有技术制备。

所述食源性致病微生物lamp扩增反应体系包括外引物f3和b3，内引物fip和bip，环引物lf和lb，bstdna聚合酶，10×聚合酶缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸（dntp），镁盐（mg²⁺），甜菜碱，胶体金。

本发明提供一种上述方法在检测食源性致病微生物中的应用。

本发明提供一种上述方法在检测金黄色葡萄球菌中的应用。

本发明提供一种上所述方法在检测沙门氏菌中的应用。

本发明提供一种上述方法在检测单核细胞增生李斯特菌中的应用。

所述食源性致病微生物lamp扩增反应体系包括外引物f3和b3，内引物fip和bip，环引物lf和lb，bstdna聚合酶，10×聚合酶缓冲液，dntp，mg²⁺，甜菜碱，胶体金，双蒸水中的一种或多种。

本发明通过向食源性致病微生物lamp扩增反应体系中添加胶体金材料来实现对lamp扩增的优化，提供了一种提高食源性致病微生物lamp扩增反应效率的方法。采用本发明的检测方法检测食源性致病微生物，具有高灵敏度和高特异性的优点。

本发明中，所述食源性致病微生物lamp扩增反应体系包括外引物f3和b3，内引物fip和bip，环引物lf和lb，bstdna聚合酶，10×聚合酶缓冲液，dntp，mg²⁺，甜菜碱，胶体金，双蒸水中的一种或多种。

本发明方法中，在一具体实施方案（含环引物）中，所述lamp扩增反应体系包括外引物f3和b3，内引物fip和bip，8ubstdna聚合酶，1×聚合酶缓冲液，1.0-1.6mmol/ldntp，2-9mmol/lmg²⁺，0-1.5mol/l甜菜碱，0.25-15nmol/l胶体金，包括环引物lf和/或lb；所述外引物和内引物的浓度之比为1:（2-8）；所述外引物和环引物的浓度之比为1:（2-8）；在另一具体实施方案（不含环引物）中，所述lamp扩增反应体系包括外引物f3和b3，内引物fip和bip，8ubstdna聚合酶，1×聚合酶缓冲液，1.0-1.6mmol/ldntp，2-9mmol/lmg²⁺，0-1.5mol/l甜菜碱，0.25-15nmol/l胶体金，所述外引物和内引物的浓度之比为1:（2-8）。

环引物有助于提高反应效率，例如，1×bstdna聚合酶反应缓冲液可以选用1×thermopol反应缓冲液，包含20mmol/ltris-hcl(ph8.8)，10mmol/lkcl，10mmol/l(nh4)2so4，0.1%tritonx-100，2mmmgso4；1×bstdna聚合酶反应缓冲液中的mgso4和酶反应体系中的镁离子mg²⁺做合并处理。

本发明方法中，所述恒温扩增反应的反应程序为①60～65℃孵育10～90min；②80℃终止反应2~20min。本发明不限制通过其他适宜反应程序来实现本发明检测方法。

本发明方法中，检测方法包括但不限于电泳检测、浊度检测或显色检测（包括肉眼直接观察或借助仪器进行扩增曲线判断）等。

本发明还提出了所述方法在检测食源性致病微生物中的应用，其中所述食源性致病微生物包括但不限于细菌、病毒及其他可致病的食源性微生物。其中，所述细菌，包括但不限于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、以及其他食源性致病微生物。

本发明有益效果包括：采用本发明食源性致病微生物检测方法具有特异性强、灵敏度高、的优点。与目前常用lamp扩增检测方法相比，本发明通过向食源性致病微生物lamp扩增反应体系中添加胶体金材料来实现对lamp扩增的优化，操作简单，效果极佳，非常适于食品生产及安全检测等机构推广使用。基于本领域常识可将上述各优选条件进行任意组合，均属本发明保护范围。

本方法可有效提高lamp扩增反应的灵敏度，并且能够抑制假阳性结果的出现、减少非特异性扩增，从而提高食源性致病微生物的检测效率。该方法可以被应用于食品安全检测领域，具有广泛应用前景。

附图说明

附图1表明本发明实施例1胶体金对金黄色葡萄球菌lamp扩增反应体系优化的显色检测结果；

附图2表明本发明实施例1胶体金对金黄色葡萄球菌lamp扩增反应体系优化的电泳检测结果；

附图3表明本发明实施例2胶体金对沙门氏菌lamp扩增反应体系的优化；

附图4表明本发明实施例3胶体金对单核细胞增生李斯特菌lamp扩增反应体系的优化。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1

一种提高食源性致病微生物lamp扩增反应效率的方法，以环介导等温扩增lamp体系为基础，包括：外引物f3和b3，内引物fip和bip，bstdna聚合酶，10×聚合酶缓冲液，将胶体金添加在金黄色葡萄球菌lamp扩增反应体系中，实现对lamp扩增的优化，按如下步骤：

（1）制备lamp扩增反应体系，组成如下表：

终浓度为0.25-15nmol/l

其中，引物lf、fip、bip、f3和b3为金黄色葡萄球菌特异性lamp扩增引物，模板为金黄色葡萄球菌dna，来源于中国普通微生物菌种保藏中心cgmcc1.2465，菌株经培养后使用北京天根生物工程公司的细菌核酸提取试剂盒提取基因组dna；

（2）向以上体系中加入优化材料胶体金，每个25µl的体系中加入1.8µl的胶体金溶液，同时做不加优化材料的相应对照实验，然后在62℃条件下进行lamp反应60min，80℃终止反应2min；

（3）在扩增产物中加入sybrgreeni进行显色检测，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测：

扩增结果如图1和图2所示，分别为显色检测结果和电泳检测结果，样品1-2：不加入本发明优化材料胶体金，样品1为加入模板金黄色葡萄球菌dna，样品2为不加入模板金黄色葡萄球菌dna的阴性对照；样品3-4：加入本发明优化材料胶体金，样品3为加入模板金黄色葡萄球菌dna，样品4为不加入模板金黄色葡萄球菌dna的阴性对照；m：分子量标记（takara公司dl2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）；从图中可以看出，未加入优化材料胶体金的体系（样品2）显色为亮绿色，电泳呈现特征性的梯形条带，显示有非特异性扩增；而加入优化材料胶体金的体系（样品4）显色为橙色，电泳未出现特征性的梯形条带，显示消除了非特异性扩增。加入模板金黄色葡萄球菌dna的体系（样品1和样品3）显色均为亮绿色，电泳呈现特征性的梯形条带。该lamp扩增结果显示，本发明可以消除非特异性扩增，避免假阳性，优化效果显著。

实施例2

一种提高食源性致病微生物lamp扩增反应效率的方法，将胶体金添加在沙门氏菌lamp扩增反应体系中，实现对lamp扩增的优化，按如下步骤：

（1）制备lamp反应体系，组成如实施例1，不同之处在于引物lf、fip、bip、f3和b3为沙门氏菌特异性lamp扩增引物，模板为沙门氏菌dna（来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心cicc21560），模板量做了系列稀释，胶体金加样量为0.3µl，终浓度为1.0nm；

（2）向以上体系中加入处理过的优化材料胶体金，每个25µl的体系中加入0.3µl的胶体金溶液，同时做不加优化材料的相应对照实验，然后在63℃条件下进行lamp反应60min，80℃终止反应10min；

（3）在扩增产物中加入sybrgreeni进行显色检测：

扩增结果如图3所示，从左至右每个反应体系中模板量分别为1000fg、100fg、10fg、5fg和0（即阴性对照），可以看出在没有添加胶体金的处理中，模板量为1000fg和100fg的反应体系呈亮绿色，判断为阳性；模板量为10fg、5fg和0的反应体系呈橙色，判断为阴性，表明不添加优化材料胶体金的反应体系最低可检测到100fg的模板（相当于20个细菌），在添加胶体金的处理中，模板量为1000fg、100fg、10fg、5fg的反应体系呈亮绿色，判断为阳性，模板量为0的反应体系呈橙色，判断为阴性，表明添加优化材料胶体金的反应体系最低可检测到5fg的模板（相当于1个细菌），该lamp扩增结果显示，本发明可以提高反应灵敏度，优化效果显著。

实施例3

一种提高食源性致病微生物lamp扩增反应效率的方法，将胶体金添加在单核细胞增生李斯特菌lamp扩增反应体系中，实现对lamp扩增的优化，按如下步骤：

（1）制备lamp反应体系，组成如实施例2，不同之处在于引物lf、fip、bip、f3和b3为单核细胞增生李斯特菌特异性lamp扩增引物，模板为单核细胞增生李斯特菌dna（来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心cicc21635）；

（2）向以上体系中加入处理过的优化材料胶体金，每个25µl的体系中加入0.3µl的胶体金溶液，同时做不加优化材料的相应对照实验，然后在63℃条件下进行lamp反应60min，80℃终止反应5min；

（3）在扩增产物中加入sybrgreeni进行显色检测：扩增结果如图4所示，从左至右每个反应体系中模板量分别为0（阴性对照）、1000fg、100fg、10fg和5fg。可以看出在没有添加胶体金的处理中，模板量为1000fg和100fg的反应体系呈亮绿色，判断为阳性；模板量为10fg、5fg和0的反应体系呈橙色，判断为阴性，表明不添加优化材料胶体金的反应体系最低可检测到100fg的模板（相当于20个细菌）。在添加胶体金的处理中，模板量为1000fg、100fg和10fg的反应体系呈亮绿色，判断为阳性，模板量为0的反应体系呈橙色，判断为阴性，表明添加优化材料胶体金的反应体系最低可检测到10fg的模板（相当于2个细菌）。该lamp扩增结果显示，本发明可以提高反应灵敏度，优化效果显著。