具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用和培育方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用和培育方法。

背景技术：

草铵膦(glufosinate，glufosinateammonium，商品名称basta)是由安万特公司(现为拜耳公司)开发的谷氨酰胺合成酶(gs)抑制剂，其有效成分为phosphinothricin(简称ppt)，化学名称为(rs)-2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸铵。该产品于1986年上市，销售额逐年上升。草铵膦的靶标酶是gs，在正常情况下，gs可以由atp及glutamate形成λ-glutamylphosphate。但在ppt处理后，ppt先与atp结合，磷酸化的ppt占据gs分子的8个反应中心，使gs的空间构型发生变化，从而gs的活性受到抑制。ppt能抑制gs所有已知的形式。草铵膦抑制gs的结果，可以导致植物体内氮代谢紊乱，铵的过量积累，叶绿体解体，从而光合作用受抑制，最终导致植物死亡。

目前培育抗草铵膦品种的主要方法是应用基因工程手段将来自细菌的抗草铵膦基因导入农作物中，从而培育出转基因抗草铵膦作物新品种。目前农业上应用最广的抗草铵膦基因是来源于菌株streptomyceshygroscopicus的bar基因和菌株s.viridochromogenes的pat基因。bar基因和pat基因具有80％的同源性，都可以编码草铵膦乙酰化酶，而该酶可以使草铵膦乙酰化而失活。抗草铵膦品种具有极大的使用价值，其中抗性油菜、玉米等已大面积商业化种植。

但是由于反转基因浪潮，转基因作物在全世界的接受程度仍然较低，即使在转基因作物种植面积最大的美洲，转基因也主要局限于玉米、大豆、棉花等几个作物。特别是bar基因和pat基因来源于微生物，而不是来源于农作物本身，更容易造成消费者的抵触心理。

bar基因和pat基因编码的草铵膦乙酰化酶可以使草铵膦乙酰化而失活，但是在草铵膦接触gs之前，该酶很难使草铵膦完全失活，因为很多gs分布在细胞膜上，因此草铵膦在转bar基因和pat基因农作物上应用时，会不同程度的干扰植物的氮代谢，同时影响植物正常的生长和发育。在植物中过量表达野生型gs可以降低转基因植物对草铵膦的敏感程度，但其耐性程度不足以商业化应用。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用和培育方法，该谷氨酰胺合成酶突变体可以赋予植株草铵膦抗性，在农作物应用该谷氨酰胺合成酶突变体，植物可以正常的生长和发育。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，将上述谷氨酰胺合成酶突变体的氨基酸序列与参考序列比对，上述谷氨酰胺合成酶突变体具有如下突变中的一种或两种的组合：

(1)上述谷氨酰胺合成酶突变体对应于上述参考序列的第59位氨基酸位点突变为x1；其中，x1＝a、c、d、e、f、g、h、i、k、p、t、v或y；

(2)上述谷氨酰胺合成酶突变体对应于上述参考序列的第296位氨基酸位点突变为；x2＝a、d、e、g、i、k、m、p、q、r、s、t、或v；

优选地，上述参考序列为来源于第一植物的野生型谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列，上述第一植物为水稻。

本发明的研究发现，将任意一种植物来源的目标野生型谷氨酰胺合成酶对应于水稻野生型谷氨酰胺合成酶的第59位或/和第296位作如上突变后(即单独地以第59位或第296位，或者同时将第59位和第296位作如上突变)，得到的谷氨酰胺合成酶突变体具有草铵膦抗性，同时该谷氨酰胺合成酶可以保持其自身正常的生物酶催化活性，转化该谷氨酰胺合成酶突变体的植株可以在草铵膦存在的条件下正常生长。

因此，该谷氨酰胺合成酶突变体可以用于培育草铵膦抗性的植物新品种，只要使植物体内表达该谷氨酰胺合成酶突变体即可产生草铵膦抗性。

本发明所述的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体可以通过如下方法得到：

将任意一种植物来源的目标野生型谷氨酰胺合成酶与来源水稻的野生型谷氨酰胺合成酶进行序列比对，在目标野生型谷氨酰胺合成酶对应于水稻野生型谷氨酰胺合成酶的第59位或/和第296位进行突变，例如将目标野生型谷氨酰胺合成酶对应于水稻野生型谷氨酰胺合成酶的第59位氨基酸残基突变为a、c、d、e、f、g、h、i、k、p、t、v或y，或/和是将第296位氨基酸残基突变为a、d、e、g、i、k、m、p、q、r、s、t或v，即得到本发明所述的谷氨酰胺合成酶突变体；上述参考序列如seqidno.1所示。

seqidno.1为来源水稻的野生型谷氨酰胺合成酶。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述谷氨酰胺合成酶突变体来源于第二植物，所述第二植物为水稻、大豆、小麦、大麦、黍稷、向日葵、花生、燕麦、萝卜、绿豆、胡萝卜、蚕豆、甘薯、马铃薯、芜菁、甜菜、白菜、芥菜、甘蓝、甜瓜、番茄、茄子、菜豆、豇豆、毛豆、韭菜、豌豆、大葱、花椰菜、芥蓝、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、辣椒、茼蒿、黄花菜、棉花、扁豆、油菜、芝麻、苋菜、莴苣、黄瓜、西葫芦、南瓜、绿豆、苦瓜、玉米、高粱、谷子、荞麦、丝瓜、菜瓜、西瓜、苜蓿、牧草、草坪草、茶、木薯、葡萄、草莓、冬瓜、烟草、甜菜或甘蔗。

需要说明的是，所述谷氨酰胺合成酶突变体对应的野生型谷氨酰胺合成酶来源于第二植物，所述谷氨酰胺合成酶突变体在对应于所述参考序列的第59位和第296位之外的其他氨基酸位点上不具有完全消除第59位和第296位提供的草铵膦抗性的突变。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述谷氨酰胺合成酶突变体在对应于上述参考序列的第59位和第296位之外的其他位点上不具有使其草铵膦抗性低于来源上述第二植物的野生型谷氨酰胺合成酶的草铵膦抗性的突变，而是具有增强其草铵膦抗性的突变。

需要说明的是，在本发明揭示了上述突变具有草铵膦抗性加强的基础上，本领域技术人员容易想到在除第59和296位点之外的其他位点上进行再次突变，以获得草铵膦抗性不低于相同来源的野生型谷氨酰胺合成酶的草铵膦抗性的二次突变体，无论这些二次突变体是通过何种方式(例如可以是在野生型谷氨酰胺合成酶的基础上在第59位和第296位之外的其他位点中的一个或多个位点进行突变)突变得到的，只要其具有上述突变中的任意一者，且其草铵膦抗性不低于野生型谷氨酰胺合成酶的草铵膦抗性，这次二次突变体也是属于本发明的保护范围。

基于本发明所揭示的内容，本领域技术人员只需要将来源于任意植物的目标野生型谷氨酰胺合成酶与seqidno.1所示的水稻野生型谷氨酰胺合成酶进行序列比对，将目标野生型谷氨酰胺合成酶对应于seqidno.1的第59位或/和第296位的氨基酸残基进行突变，即可得到具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体。

需要说明的是，如果目标野生型谷氨酰胺合成酶与seqidno.1相比较，在除59位和296位之外的其他位点上还具有不同的氨基酸残基差异时，这种情形下，保留目标野生型谷氨酰胺合成酶初始的氨基酸序列。也就是说，本发明所述的野生型谷氨酰胺合成酶突变体不要求其除59位和296位之外的其他位点的氨基酸残基类别与seqidno.1完全一致，可以是完全一致或部分一致，在特殊情况下，可以是完全不一致。

需要说明的是，本发明所涉及的蛋白序列比对所使用的比对方式为clustal在线比对，其网站地址为：http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/。采用其他的序列比对工具(例如dnaman，相关参数设置按默认设置)所得到结果与clustal在线比对得到的结果基本一致。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述第二植物为水稻、大豆、小麦、大麦、黍稷、向日葵、花生、燕麦、萝卜、绿豆、胡萝卜、蚕豆、甘薯、马铃薯、芜菁、甜菜、白菜、芥菜、甘蓝、甜瓜、番茄、茄子、菜豆、豇豆、毛豆、韭菜、豌豆、大葱、花椰菜、芥蓝、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、辣椒、茼蒿、黄花菜、棉花、扁豆、油菜、芝麻、苋菜、莴苣、黄瓜、西葫芦、南瓜、绿豆、苦瓜、玉米、高粱、谷子、荞麦、丝瓜、菜瓜、西瓜、苜蓿、牧草、草坪草、茶、木薯、葡萄、草莓、冬瓜、烟草、甜菜或甘蔗。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述谷氨酰胺合成酶突变体在对应于上述参考序列的第59位具有突变s59x1(即由氨基酸残基s突变为x1)，上述谷氨酰胺合成酶突变体的长度和其余位点的氨基酸残基与seqidno.1相同。

需要说明的是，在一些实施例中，上述谷氨酰胺合成酶突变体在对应于上述参考序列的第59位也可以是由其他非s和非x1的氨基残基突变为x1。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述谷氨酰胺合成酶突变体在对应于上述参考序列的第296位具有突变h296x2(即由氨基酸残基h突变为x2)，上述谷氨酰胺合成酶突变体的长度和其余位点的氨基酸残基与seqidno.1相同。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述谷氨酰胺合成酶突变体在对应于上述参考序列的59位具有突变s59g，第296位具有突变h296r，上述谷氨酰胺合成酶突变体的长度和其余位点的氨基酸残基与seqidno.1-3中的任意一者相同。

在本发明揭示了上述谷氨酰胺合成酶突变体的基础上，本发明的技术人员容易理解到，采用本领域常规的技术例如转基因组织培养技术、基因编辑技术、诱变育种技术、有性或无性杂交育种技术等即可培育得到体内表达该谷氨酰胺合成酶突变体的植株。

具有上述两个突变位点中的任意一个突变或两个突变均可以提高多种植物谷氨酰胺合成酶突变体对草铵膦的抗性，同时保持自身的生物酶催化活性。转化本发明提供的植物谷氨酰胺合成酶突变体的植株或重组菌均能够在草铵膦存在的条件下正常生长，该谷氨酰胺合成酶突变体不仅用于转基因作物培育外，也可应用于培育抗草铵膦非转基因植物例如水稻、烟草、大豆、玉米、小麦、棉花和高粱等，具有广阔的应用前景。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，谷氨酰胺合成酶突变体的氨基序列选自如下序列中的任意一种：

(1)由seqidno.2在其第59位由s突变为g和第296位由h突变为r得到；

(2)由seqidno.3在其第59位由s突变为g和第296位由h突变为r得到。

第二方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码上述的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体。

进一步地，上述核酸分子的碱基序列由seqidno.4-6中任意一者通过如下碱基突变得到：

(1)由seqidno.4作如下任意一种突变得到：

(a):第175-176位由ag变为gc；

(b):第175位由a变为t；

(c):第175-177位由agc变为gat；

(d):第175-177位由agc变为gag；

(e):第175-176位由ag变为tt；

(f):第175位由a变为g；

(g):第175-176位由ag变为ca；

(h):第176位由g变为t；

(i):第176位由g变为a；

(j):第175-176位由ag变为cc；

(k):第175-176位由ag变为gt；

(l):第175-176位由ag变为ta；

(m):第886-887位由ca变为gc；

(n):第886和第888位由c变为g；

(o):第886-887位由ca变为gg；

(p):第886-887位由ca变为at；

(q):第886位由c变为a和第888位由c变为g；

(r):第886-888位由cac变为atg；

(s):第888位由c变为g；

(t):第887位由a变为g；

(u):第886-888位由cac变为tct；

(v):第886-887位由ca变为ac；

(w):第886-887位由ca变为gt；

(x):第175位由a变为g和第887位由a变为g；

(2)由seqidno.5在其第175位由a变为g和第887位由a变为g得到；

(3)由seqidno.6在其第175位由a变为g和第887位由a变为g得到。

应当容易理解到，对本领域技术人员而言，根据密码子的简并性，容易在上述核酸分子的序列基础进行一个或多个核苷酸的替换，得到相应的衍生序列，以使编码出本发明提供的上述gs突变体。因此，在上述编码基因的序列基础进行一个或多个核苷酸的替换，得到相应的编码出本发明提供的植物gs突变体的衍生序列也属于本发明的保护范围。

第三方面，本发明提供了一种载体，其含有上述的核酸分子。

第四方面，本发明提供了一种重组菌或重组细胞，其含有上述的核酸分子或上述的载体。

第五方面，本发明提供了上述的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、上述的核酸分子、上述的载体或上述的重组菌或重组细胞在培育具有草铵膦抗性的植物中的应用。

第六方面，本发明提供了一种具有草铵膦抗性的植物品种的培育方法，其包括：在目标植物的体内表达上述的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，通过如下方法中的任意一种或几种的组合实现在上述目标植物的体内表达上述谷氨酰胺合成酶突变体：

(a)：将编码上述谷氨酰胺合成酶突变体的核酸分子导入上述目标植物的细胞内，培养上述细胞使其分化、发育形成具有草铵膦抗性的植株，以获得具有草铵膦抗性的植物品种；

(b)：通过基因编辑技术编辑上述目标植物的内源谷氨酰胺合成酶基因，使其编码上述谷氨酰胺合成酶突变体，以获得具有草铵膦抗性的植物品种；

(c)：采用诱变技术，对上述目标植物的细胞或组织，或者上述目标植物个体或群体进行诱变，筛选出体内编码上述谷氨酰胺合成酶突变体的细胞、组织或个体，以获得具有草铵膦抗性的植物品种；

(d)：通过有性或无性杂交获得体内编码上述谷氨酰胺合成酶突变体的植株，以获得具有草铵膦抗性的植物品种；

优选地，上述目标植物为水稻、大豆、小麦、大麦、黍稷、向日葵、花生、燕麦、萝卜、绿豆、胡萝卜、蚕豆、甘薯、马铃薯、芜菁、甜菜、白菜、芥菜、甘蓝、甜瓜、番茄、茄子、菜豆、豇豆、毛豆、韭菜、豌豆、大葱、花椰菜、芥蓝、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、辣椒、茼蒿、黄花菜、棉花、扁豆、油菜、芝麻、苋菜、莴苣、黄瓜、西葫芦、南瓜、绿豆、苦瓜、玉米、高粱、谷子、荞麦、丝瓜、菜瓜、西瓜、苜蓿、牧草、草坪草、茶、木薯、葡萄、草莓、冬瓜、烟草、甜菜或甘蔗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的水稻gs突变体osa、osc、osd、ose、osf、osg、osh、osi、osk、osp、ost、osv、osy和野生型水稻gsosgs_wt的氨基酸序列部分比对结果。

图2为本发明实施例2提供的水稻野生型gsosgs_wt、水稻gs突变体osgr、小麦野生型gstags_wt、小麦gs突变体tagr、大豆野生型gsgmgs_wt、大豆gs突变体gmgr的氨基酸序列部分比对结果。

图3为本发明实施例3提供的水稻野生型gsosgs_wt和水稻gs突变体oa、od、oe、og、oi、ok、om、op、oq、or、os、ot、ov的氨基酸序列部分比对结果。

图4为本发明实验例1提供的padv7载体的结构示意图。

图5为本发明实验例1提供的转化实施例1提供的水稻gs突变体osa、osc、osd、ose、osf、osg、osh、osi、osk、osp、ost、osv、osy和野生型水稻gsosgs_wt的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果。

图6为本发明实验例2提供的转化实施例2提供的水稻gs突变体osgr、小麦gs突变体tagr、大豆gs突变体gmgr和对照osgs_wt、tags_wt、gmgs_wt的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果。

图7为本发明实验例3提供的转化实施例3提供的水稻gs突变体oa、od、oe、og、oi、ok、om、op、oq、or、os、ot、ov和野生型水稻gsosgs_wt的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果。

图8为本发明实验例4提供的水稻gs突变体osc、osf、osg、osp、or、osy、osh、小麦gs突变体tagr、野生型水稻gsosgs_wt和野生型小麦gstags_wt的酶动力学参数和草铵膦抗性参数ic50。

图9为本发明实验例5提供的转化提供的水稻gs突变体or和野生型水稻在喷施1x田间剂量草铵膦后的表现。

图10为水稻野生型gs(seqidno.1)、小麦野生型gs(seqidno.2)和大豆野生型gs(seqidno.3)三者的序列比对部分结果。

图11为pgvp1载体的结构示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了来源于水稻(oryzasativa)的多个谷氨酰胺合成酶(以下简称gs)突变体，这些gs突变体分别命名为：osa、osc、osd、ose、osf、osg、osh、osi、osk、osp、ost、osv、osy；将这些gs突变体与水稻野生型gs(即参考序列，seqidno.1)相比较，对应于水稻野生型gs的第59位具有突变，具体的突变类型见下表1和图1，这些gs突变体的长度和其余位点的氨基酸残基类型与水稻野生型gs相同。

表1

实施例2

本实施例提供了来源水稻的另外一种gs突变体，命名为osgr，将osgr与水稻野生型gs(即参考序列，seqidno.1)相比较，对应于水稻野生型gs的第59位和第296位具有突变，具体的突变类型见表2和图2；osgr的长度和其余位点的氨基酸残基与水稻野生型gs(seqidno.1)相同。即将水稻野生型gs(seqidno.1)自身的第59位突变为g和第296位突变为r，得到osgr。

本实施例还提供了来源小麦(triticumaestivum)的gs突变体，命名为tagr，将tagr与水稻野生型gs(即参考序列，seqidno.1)相比较，对应于水稻野生型gs的第59位和第296位具有突变，具体的突变类型见表2和图2；tagr的长度和其余位点的氨基酸残基类型与小麦野生型gs(seqidno.2)相同。即将小麦野生型gs(seqidno.2)自身的第59位突变为g和第296位突变为r，得到tagr。

本实施例还提供了来源大豆(glycinemax)的gs突变体，命名为gmgr，将gmgr与水稻野生型gs(即参考序列，seqidno.1)相比较，对应于水稻野生型gs的第59位和第296位具有突变，具体的突变类型见表2和图2；gmgr的长度和其余位点的氨基酸残基类型与大豆野生型gs(seqidno.3)相同。即将大豆野生型gs(seqidno.3)的自身的第59位突变为g和第296位突变为r，gmgr。

水稻野生型gs(seqidno.1)、小麦野生型gs(seqidno.2)和大豆野生型gs(seqidno.3)三者的序列比对部分结果见图10，图10显示了小麦野生型gs和大豆野生型gs两个不同植物来源的gs其自身的第59位和第296位均对应于水稻野生型gs的第59位和第296位。

水稻野生型gs(seqidno.1)、小麦野生型gs(seqidno.2)和大豆野生型gs(seqidno.3)三者的序列同一性(identity)和相似性(similarity)如下：

当然，需要说明的是，不同植物来源的野生型gs对应水稻野生型gs的第59位的位点s，可能不是其自身的第59位，该位点s也可能是其自身的55位、58位、60位、65位等非59位的位置。根据实际的野生型gs进行确定，无论如何，只要其对应到水稻野生型gs的第59位和/第296位的位置按表2的突变类型突变，得到的gs突变体即属于本发明的保护范围。

表2

实施例3

本实施例提供了来源水稻的另外的多种gs突变体，这些gs突变体命名为：oa、od、oe、og、oi、ok、om、op、oq、or、os、ot、ov。将这些gs突变体与水稻野生型gs(即参考序列，seqidno.1)相比较，对应于水稻野生型gs的第296位具有突变，具体的突变类型见下表3和图3，这些gs突变体的长度和其余位点的氨基酸残基类型与水稻野生型gs(seqidno.1)相同。

表3

实施例4

本实施例提供了编码上述实施例1-3中gs突变体的核酸分子。

编码水稻野生型gs(seqidno.1)的核酸序列如seqidno.4所示；编码小麦野生型gs(seqidno.2)的核酸序列如seqidno.5所示；编码大豆野生型gs(seqidno.3)的核酸序列如seqidno.6所示。

编码实施例1-3中gs突变体的核酸分子的序列均可以在编码相同植物来源的野生型gs的核酸序列上对应于第59位或第296位的碱基位置进行适应性的碱基突变(见表4)即可得到，得到的突变核酸序列编码出对应的gs突变体。根据密码子的简并性，本领域技术人员可以理解到，在编码第59位或第296位突变位点的碱基位置的密码子可以存在多种情况。无论是何种密码子，只要是编码上述的gs突变体的氨基酸，其均属于本发明的保护范围。

实施例1-3中的gs突变体及其编码的核酸分子均可以通过常规的化学合成的方式获得。

本实施例中，编码实施例1-3中gs突变体的核酸分子的序列见下表4。

表4

实验例1

检测实施例1提供的水稻gs突变体osa、osc、osd、ose、osf、osg、osh、osi、osk、osp、ost、osv、osy的草铵膦抗性，方法如下：

根据实施例4提供的核酸分子的序列，采用化学合成的方法合成编码水稻gs突变体osa、osc、osd、ose、osf、osg、osh、osi、osk、osp、ost、osv、osy的核酸序列，两端引入酶切位点(pac1和sbf1)，酶切后，在连接酶的作用下连接至经相同酶切处理后的表达载体(例如padv7载体，其结构如图4所示)上，然后分别转化谷氨酰胺合成酶缺陷型大肠杆菌，经验证后，挑取阳性克隆，接种至含不同浓度草铵膦的m9培养基上生长，观察缺陷型大肠杆菌生长情况。

以含有野生型水稻gs(氨基酸序列如seqidno.1所示，编码基因如seqidno.4所示)为负对照，检测含有gs突变体osa(s59a，水稻gs的第59位的氨基酸s突变为a)、osc(s59c)、osd(s59d)、ose(s59e)、osf(s59f)、osg(s59g)、osh(s59h)、osi(s59i)、osk(s59k)、osp(s59p)、ost(s59t)、osv(s59v)、osy(s59y)的草铵膦抗性。结果如图5所示。

根据图5的结果可看出：

在含0mm草铵膦的培养基上，转化编码野生型水稻gs(osgs_wt)及水稻gs突变体osa、osc、osd、ose、osf、osg、osh、osi、osk、osp、ost、osv、osy的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由osa、osc、osd、ose、osf、osg、osh、osi、osk、osp、ost、osv、osy编码的gs都具有正常gs酶活力；

在含10mm草铵膦的培养基上，转化野生型水稻gs的大肠杆菌基本不能生长，但转化水稻gs突变体osa、osc、osd、ose、osf、osg、osh、osi、osk、osp、ost、osv、osy的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含osa、osc、osd、ose、osf、osg、osh、osi、osk、osp、ost、osv、osy的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型；在更高草铵膦浓度(50mm/100mm)的培养基上，转化水稻gs突变体osc、osd、osf、osg、osh、osi、osk、osp、osy的大肠杆菌都还有明显生长。

这些结果说明osa、osc、osd、ose、osf、osg、osh、osi、osk、osp、ost、osv、osy的单突变体都具有抗草铵膦的能力，且水稻gs突变体osc、osd、osf、osg、osh、osi、osk、osp、osy抗草铵膦能力更强。

实验例2

参考实验例1的检测方法，验证实施例2提供的水稻gs突变体osgr(s59g和h296r，水稻gs的第59位的氨基酸s突变为g和第296位的氨基酸h突变为r)、小麦gs突变体tagr(s59g和h296r，小麦gs的第59位的氨基酸s突变为g和第296位的氨基酸h突变为r)、大豆gs突变体gmgr(s59g和h296r，大豆gs的第59位的氨基酸s突变为g和第296位的氨基酸h突变为r)的草铵膦抗性。结果如图6所示。

根据图6的结果可看出：

在含0mm草铵膦的培养基上，转化编码野生型水稻gsosgs_wt、野生型小麦gstags_wt、野生型大豆gsgmgs_wt和水稻gs突变体osgr、小麦gs突变体tagr、大豆gs突变体gmgr的编码基因的谷氨酰胺合成酶缺陷型菌株均能正常生长，表明由水稻gs突变体osgr、小麦gs突变体tagr、大豆gs突变体gmgr编码的gs都具有正常gs酶活力；

在含2mm、5mm、10mm和20mm草铵膦的培养基上，转化野生型小麦gstags_wt和野生型大豆gsgmgs_wt的大肠杆菌基本不能生长，但转化小麦gs突变体tagr、大豆gs突变体gmgr的大肠杆菌明显生长，说明小麦gs突变体tagr和大豆gs突变体gmgr抗草铵膦的能力明显优于野生型；

在含10mm、20mm和300mm草铵膦的培养基上，转化野生型水稻gsosgs_wt的大肠杆菌基本不能生长，但转化水稻gs突变体osgr的大肠杆菌明显生长，说明水稻gs突变体osgr抗草铵膦的能力明显优于野生型；

在含300mm草铵膦的培养基上，只有转化水稻gs突变体osgr的大肠杆菌明显生长。

这些结果说明水稻gs突变体osgr、小麦gs突变体tagr和大豆gs突变体gmgr都具有抗草铵膦的能力，而水稻gs突变体osgr抗草铵膦能力更强。

实验例3

检测实施例3提供的水稻gs突变体oa、od、oe、og、oi、ok、om、op、oq、or、os、ot、ov的草铵膦抗性，方法如下参照实验例1。

以野生型水稻gs为负对照，检测含有gs突变体oa(h296a，水稻gs的第296位的氨基酸h突变为a)、od(h296d)、oe(h296e)、og(h296g)、oi(h296i)、ok(h296k)、om(h296m)、op(h296p)、oq(h296q)、or(h296r)、os(h296s)、ot(h296t)、ov(h296v)的草铵膦抗性。结果如图7所示。

根据图7的结果可看出：

在含0mm草铵膦的培养基上，转化编码野生型水稻gsosgs_wt及水稻gs突变体oa、od、oe、og、oi、ok、om、op、oq、or、os、ot、ov的编码基因的谷氨酰胺合成酶缺陷型菌株，均能正常生长，表明由oa、od、oe、og、oi、ok、om、op、oq、or、os、ot、ov编码的gs都具有正常gs酶活力；

在含10mm草铵膦的培养基上，转化野生型水稻gs的大肠杆菌基本不能生长，但转化水稻gs突变体oa、od、oe、og、oi、ok、om、op、oq、or、os、ot、ov的大肠杆菌生长明显优于野生型，说明含oa、od、oe、og、oi、ok、om、op、oq、or、os、ot、ov的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型；在含20mm草铵膦的培养基上，转化水稻gs突变体oa、od、oe、oi、ok、or、ot、ov的大肠杆菌都还有明显生长；在含50mm草铵膦的培养基上，转化水稻gs突变体oa、or的大肠杆菌都还有明显生长。

这些结果说明oa、od、oe、og、oi、ok、om、op、oq、or、os、ot、ov的单突变体都具有抗草铵膦的能力，而突变体oa、or抗草铵膦能力更强。

实验例4

检测实施例1提供的osc、osf、osg、osh、osp、osy、实施例3提供的or、实施例2提供的osgr水稻gs突变体和tagr小麦gs突变体的酶动力学参数和在有草铵膦时的酶动力学参数，以野生型水稻gsosgs_wt和野生型小麦gstags_wt为对照，方法如下：

载体构建：

将编码上述突变体的核酸序列克隆到原核表达载体pet32a中，测序验证克隆。

6his蛋白纯化：

通过6his和用标准方法纯化突变体酶蛋白，用bradford法蛋白浓度测定试剂盒测定浓度，蛋白保存在蛋白贮存液中。

酶活测定：

1.仪器和试剂：酶标仪(德铁：hbs-1096a)，草铵膦，底物l-谷氨酸钠(cas:6106-04-3)。

2.操作步骤：

(1)谷氨酰胺合成酶酶活测定反应液组分为：100mmtris-hcl(ph7.5)，10mmatp，20mml-谷氨酸钠，30mmhydroxylamine，20mmmgcl2。100μl反应液混匀后35℃预热5min后，加入10μl突变体蛋白液(蛋白浓度为200ug/ml)开始反应，35℃反应30min后，加入110μl显色液(55g/lfecl3·6h2o，20g/l三氯乙酸，2.1％浓盐酸)终止反应。测定在540nm的光吸收值。

结果如图8所示。

根据图8的结果可看出：

相对于野生型对照osgs_wt和tags_wt，gs突变体的km值都与之相近或偏高，说明gs突变体在降低对草铵膦抑制剂的敏感度的同时，保持或略为降低了对正常底物的敏感度。除or外，其他突变体的vmax均高于野生型对照，说明这些突变体的酶催化能力有所提高。野生型对照对草铵膦很敏感，ic50分别为0.7和0.6mm，突变体的ic50均明显高于野生型对照，osh、osy、or和osgr的ic50远远高于野生型对照。这些数据从酶动力学上说明了突变体的抗草铵膦机制。

实验例5

检测实施例3提供的or突变体在转基因水稻中提供的草铵膦抗性，方法如下：

按常规方法将编码or的核酸序列插入至pgvp1载体上(见图11)，得到pgvp1-or载体。

将pgvp1-or载体转化eha105(根癌农杆菌、agrobactriumtumefaciens)感受态细胞，挑取单克隆进行菌落pcr检测，得到阳性菌株；再将阳性菌株接种到1ml的含50μg·ml-1卡那霉素和50μg·ml-1利福平的yep培养中扩繁，保存于-80℃，或用于后续实验。

水稻转化：

把-80℃保存的含pgvp1-or载体的菌种400ul加进有yep+50μg/ml利福平+50μg/ml卡那的固体培养基的培养皿中，28℃暗中培养24小时，再将该菌加入浸染培养基，调该菌液到od600＝0.2作为浸染液。

消毒和预培养：取成熟水稻(日本晴)种子，人工脱壳，挑选饱满无菌斑的种子，按以下步骤消毒：将种子放入50ml无菌离心管中，加入70％酒精消毒30秒，倒去酒精，使用无菌水清洗一次；加入10-20ml的2.6％次氯酸钠溶液，浸泡消毒20分钟。倒去次氯酸钠溶液，用无菌水浸泡清洗6-7次，每次3分钟。

诱导与继代培养：种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿12颗；操作完毕用封口膜封好培养皿，在30℃暗中培养21-28天，将愈伤组织转接到新鲜培养基上，继续培养7-14天左右，取1-2mm大小的球型愈伤组织，作为浸染受体。

浸染与共培养：

将愈伤组织接入离心管或培养杯中，加入调制好的农杆菌悬浮液浸染10分钟，期间摇动数次；倒去菌液，将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上吸干表面菌液(30分钟左右)；将愈伤组织置于培养皿中无菌滤纸上，25℃暗中培养2-3天。

恢复培养：将共培养后的愈伤组织接种于恢复培养基上，30℃暗中培养5-7天。

第一轮筛选：将愈伤转入筛选培养基1(s1)，30℃暗中培养14天。

第二轮筛选：然后将愈伤转到筛选培养基2(s2)，30℃暗中培养14天。

第一轮分化：将经过筛选后的抗性愈伤组织转接到分化培养基上，30℃光照19小时，培养21天左右。

第二轮分化：挑选新生的幼小嫩芽移至新的分化培养基，继续培养21天左右。

待新生幼苗长至2cm左右时，移至生根培养基中，30℃光照(16/8h)培养3～4周，待诱导出根并且幼苗长至7～10cm时，从培养基中取出，洗净根部沾染的培养基，移至育秧盘中，继续培养10d左右后移入温室或大田。

其中，所用培养基的配方参考申请号为2018110706423，名称为一种含a138t突变的植物epsps突变体及其编码基因和应用的中国专利申请。

转基因植株的检测：

采用pcr法检测出转or突变体基因的水稻植株，根据pgvp1-or载体序列和水稻内参基因设计正反向检测引物，pcr扩增产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳，在452bp位置和629bp位置有条带的则为转基因植株。

本实施例验证or突变体在水稻转基因植株中的草铵膦抗性。实验方法如下：

将移栽后的转基因水稻苗均匀地排放在同一实验区域(避免叶片重叠)。计算实验组和对照组的占地区域面积，根据区域面积，按450克/公顷(0.045g/m2)为1x剂量来喷施草铵膦。

用市售的30％草铵膦，根据上述的喷洒浓度，取相应体积的草铵膦，然后用20倍体积水稀释后，均匀喷施在实验组和对照组的植株上。待叶面干燥后，将植株移入温室或室外培养。

喷施1x草铵膦7天后的结果如图9所示。

根据图9的结果可看出：水稻野生型对照在喷施1x草铵膦后很快停止生长，并在7天内死亡、干枯。而含or突变体的转基因水稻苗则未明显受草铵膦影响，继续生长，说明or突变体能够为水稻植株提供草铵膦抗性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>四川天豫兴禾生物科技有限公司

<120>具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用和培育方法

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