一种光交联双改性的丝素蛋白-明胶复合生物墨水及其制备方法和应用与流程

本发明属于组织工程支架领域，特别涉及一种光交联双改性的丝素蛋白-明胶复合生物墨水及其制备方法和应用。

背景技术：

组织工程技术具有从根本上解决组织器官的损伤、实现其功能重建的潜力，是骨替代物移植常见的治疗策略之一，而病人个体化差异是影响修复效果的关键因素之一，故制备具有能适应和匹配损伤部位的具有功能性的组织工程支架，是该策略的重要一环。3d打印技术是基于精准化、快速化的一门增材制造技术，3d打印技术是基于精准化、快速化的一门增材制造技术，3d打印技术能很好地解决植入支架与患者损伤部位不匹配的问题，可通过ct对患者部位进行扫描来建立匹配的模型文件，然后使用3d打印机和相适应的优良的生物材料来进行精确化的组织工程支架的构建。而目前应用于软骨组织工程领域的3d打印“生物墨水”材料种类的匮乏，限制了这一策略的发展及应用，故开发一种适于组织工程3d打印生物墨水变得尤为重要。

丝素蛋白是从天然蚕丝中提取的天然的纤维蛋白，无毒害作用，且对细胞黏附和增殖具有促进作用，在药物缓释、医用生物支架、皮肤敷料等多个领域获得广泛应用。其水凝胶形态因具有众多优良的理化性能、多样化的成胶方式以及内部丰富的水环境可模拟细胞的三维微环境等优点而被广泛应用和开发，但同时也因其成胶脆性大、凝胶结构特殊等因素，限制了其在多种领域的应用。

明胶是以动物皮、骨内的蛋白质即胶原经过水解制成的蛋白质，具有抵抗原性、促进细胞增殖和分化、促进血小板凝结、可加工性强等多种其他合成材料无法比拟的优点。明胶水解后，还保留了胶原具有的含精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸(rgd)序列的细胞粘附肽以及蛋白酶降解位点，且由于其特有的温敏特性被广泛应用于组织工程的研究。明胶分子链上具有丰富的活性基团，目前采用接枝改性的方式制备改性明胶成为明胶水凝胶研究的热点。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种光交联双改性的丝素蛋白-明胶复合生物墨水及其制备方法和应用，克服了将纯丝素蛋白应用于3d打印技术的不适宜性。

本发明提供了一种光交联双改性的丝素蛋白-明胶复合生物墨水，其特征在于：通过将丝素蛋白与明胶分别进行甲基丙烯酰化改性，再经过光交联制备而得。

本发明还提供了一种光交联双改性的丝素蛋白-明胶复合生物墨水的制备方法，包括：

(1)将再生丝素蛋白纤维用libr溶解后，再加入甲基丙烯酸缩水甘油酯gma反应，随后透析、冷冻干燥，得到甲基丙烯酰化丝素蛋白silma；

(2)将明胶溶于去离子水中搅拌溶解，再加入甲基丙烯酸酐反应，随后透析、冷冻干燥，得到甲基丙烯酰化明胶gelma；

(3)将silma和gelma分别溶于去离子水中，混合均匀后在避光条件下加入光引发剂搅拌，得到混合溶液，真空除泡，得到复合生物墨水。

所述步骤(1)中甲基丙烯酸缩水甘油酯gma溶液的加入浓度为140～800mm。

所述步骤(1)中明胶与甲基丙烯酸酐的质量体积比为2g:1ml。

所述步骤(1)和(2)中的反应温度为50～60℃。

所述步骤(3)中silma和gelma的混合浓度比为5:8～15:8。

所述步骤(3)中的光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐lap；光引发剂的加入量为0.4w/v％。

所述步骤(3)中的silma和gelma溶解和混合温度为37～60℃。

本发明还提供了一种光交联双改性的丝素蛋白-明胶复合生物墨水的应用，应用于3d打印制备大孔支架。

具体步骤如下：

在pam式3d打印机的控制下，使用复合生物墨水进行3d打印；在打印针筒的运动过程中，使用弱紫外灯对支架进行辅助固化，在打印完成后，使用强紫外灯对成型支架强化交联，即得3d打印silma-gelma复合大孔支架。

所述3d打印的参数为：环境温度为4～25℃；所用针头直径为0.26±0.02mm～0.51±0.02mm；每层层高为所用针头直径的90～110％，网格填充宽度为1～2mm；轴速度为3mm/s，气压值为0.2～0.4mpa。

所述辅助固化的弱紫外灯强度为1～2mj/cm²；进一步强化交联的强紫外灯强度为3～5mj/cm²，固化时间为3～5min。

本发明对丝素蛋白进行改性修饰且与gelma复合的方法，赋予该复合打印墨水温敏性、可挤出性和可光交联固化特性，且双组分光交联改性进一步增强了该支架的机械性能，使丝素蛋白能在3d打印领域有进一步的应用。获得的光交联双改性的丝素蛋白-明胶复合墨水可根据个性化需求在计算机的辅助下构建个性化大孔支架，该方法操作简单，成本低廉，自动化程度高。得到的大孔支架具有良好的抗压能力和弹性、良好的生物相容性，对机体无毒副作用，并且在体内可被生物降解且无明显异常炎症反应，避免对病人造成二次伤害，达到更好的治疗效果。

有益效果

(1)本发明使用的材料均为天然大分子蛋白，无毒无害，具有良好的生物相容性，可生物降解，且其中丰富的水环境可模拟细胞外基质，为细胞提供良好的生长环境；

(2)本发明采用甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)对丝素蛋白进行改性，相较于对丝素蛋白修饰效果十分不理想的传统甲基丙烯酰化方法，即使用甲基丙烯酸酐修饰光交联基团的方法，可最大化利用丝素蛋白分子链上含量仅为0.2％的赖氨酸中可反应的活化自由氨基，且gma还具有与丝素蛋白上的羧基和羟基的次要反应，大大提高了丝素蛋白甲基丙烯酰化效果。

(3)本发明制备的复合生物墨水可作为打印墨水用于3d打印技术构建个性化复杂支架，避免了制备繁复模具的步骤，从而可以满足各种需要；

(4)本发明制备的复合生物墨水采用双组份交联的修饰方式，增强了交联固化效果，且同时在一定程度上减轻了打印效果对单组分的浓度依赖；

(5)本发明中制备的大孔支架孔隙直径可通过计算机设置控制，且微观也具有一定的孔隙，该制备方法简单，自动化高；

(6)本发明中制备的大孔支架生物相容性好，不产生细胞毒性，对细胞后期增殖有一定的促进效果，在体内无明显异常炎症反应，可生物降解，并有一定的力学强度，在组织工程领域中有应用前景。

附图说明

图1分别是实施例1中合成的silma和gelma材料红外光谱图；

图2是实施例1中制备的15％silma-8％gelma复合水凝胶的流变曲线图(图中a.b.c三个区域代表不同的条件。第一阶段a：温度从37℃变化至4℃，时间设置为300s，不加紫外光照射；第二阶段b：温度保持4℃不变，时间设置为300s，不加紫外光照射；第三阶段c：温度保持4℃不变，时间设置为300s，加紫外光照射)；

图3a、b分别是实施例1中所构建的3d打印15％silma-8％gelma复合水凝胶宏观支架图和15％silma-8％gelma复合水凝胶的微观sem图；

图4是实施例1中构建的3d打印支架的应力-应变曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)将煮好的丝素蛋白纤维用libr溶解后，将424mm的gma溶液加入到混合物溶液中，以300rpm的速度在60℃下反应3h，使之产生高产率反应。过滤后，使用分子量为12-14kda的透析袋透析4天，每4h更换去离子水，然后置于-80℃冰箱中过夜，冷冻干燥后得到甲基丙烯酰化丝素蛋白(silma)，置于-4℃下以备使用；

(2)将10g明胶溶于100ml的去离子水中，室温静置1h，然后于60℃恒温水浴锅中搅拌直至完全溶解。在避光条件下，将5ml甲基丙烯酸酐在60℃下以1ml/min的速度滴加到明胶溶液中，搅拌速度为300rpm。混合均匀后，在50℃的恒温摇床中震荡反应3h，然后加入400ml50℃的去离子水稀释反应液。将溶液装入分子量为8-14kda的透析袋中，于50℃的去离子水中透析1周，每4h更换去离子水。然后置于-80℃冰箱中过夜，冷冻干燥，得到甲基丙烯酰化明胶(gelma)，置于-4℃下以备使用；

(3)将silma以30w/v％的比例溶于5ml去离子水中，置于37℃的水浴锅中搅拌至完全溶解。将gelma以16w/v％的浓度溶于5ml去离子水中，置于60℃的水浴锅中搅拌至完全溶解。直至所有材料完全溶解后，将两者混合，于37℃水浴锅中搅拌均匀。在避光条件下，分别加入0.4w/v％的光引发剂(lap)继续搅拌。待所有材料充分溶解后，在4℃下将混合溶液置于避光打印针筒内，制得15％silma-8％gelma打印墨水，抽真空除泡后，置于4℃下，静置成胶备用；

(4)使用外部计算机控制打印系统，调整适于打印的气压，通过气推的方式预挤材料使样品出料均匀以备打印。计算机打开绘制的尺寸为10*10*5立方体的stl打印模型文件，打印参数有：层高为0.55mm、总层高为5层、网格填充宽度为1.8mm、轴速度为3mm/s、压力值为0.3mpa。使用21g(内径为500μm)针头作为喷嘴。在打印过程中，打开打印头处的紫外led灯，强度为1.5mj/cm²。在支架打印完成后，再放置3.5mj/cm²强度的紫外光下交联5分钟，然后置于4℃冰箱中备用。

由图1可知，在silma的ft-ir光谱中，酰胺i(1639cm^-1)、酰胺ⅱ(1512cm^-1)和酰胺iii(1234cm^-1)是丝素蛋白的三个典型酰胺特征峰。在951cm^-1处显示为rr'c＝ch2特征峰，峰的明显增大说明丝素蛋白分子链上双键含量的明显增加和甲基丙烯酸基团的成功接枝。在gelma的ft-ir光谱中，在3318cm^-1和3075cm^-1处分别为酰胺a带和酰胺b带特征峰，主要由n-h伸缩振动引起；在1654cm^-1处为酰胺i带的特征峰，主要由c＝o伸缩振动引起；在1542cm^-1处为酰胺ii带的特征峰，主要由n-h弯曲振动和c-h伸缩振动耦合引起，而在951cm^-1处显示为rr'c＝ch2特征峰。由于明胶与甲基丙烯酸酐反应生成酰胺键，故gelma在酰胺i带(1654cm^-1)和酰胺ii带(1542cm^-1)处明显强于gel相应特征峰，且rr'c＝ch2(951cm^-1)的引入，均说明在明胶分子链上引入了甲基丙烯酸基团。

由图2可知，第一阶段a随着温度的逐步下降，g'和g"的变化不大，说明在此过程中各样品的性能均较为稳定。在第一阶段a和第二阶段b的交汇处，即4℃左右，含有15％silma-8％gelma的样品向凝胶转变，这是由于其具有温敏特性。在第三阶段c增加了紫外光照后，新的成胶点出现，g"和g'都有大幅度的增加，说明在紫外光的交联下，所有样品的弹性和刚性均明显提升。

由图3可见该生物墨水构建的支架有良好的成型效果，宏观微观均可见其具有良好的孔洞结构。

由图4可知，15％silma-8％gelma生物墨水构建的支架具有良好的力学性能。