一类具有蛋白质标记功能的荧光化合物及应用的制作方法

本发明涉及一类具有蛋白质标记功能的荧光化合物及应用，其属于精细化工领域。

背景技术：

蛋白质是组成人体一切细胞和组织的重要成分，机体组织的重要生理过程都需要有蛋白质的参与，例如，蛋白质作为抗体参与机体的防御，作为酶参与催化代谢反应，作为某些激素和神经递等调节物质代谢和生理活动。蛋白质是生命的物质基础，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者，可以说没有蛋白质就没有生命，因此研究蛋白质的活动过程具有重要意义。

随着荧光分析法在生命科学、化学、临床医学等领域中的飞速发展，荧光成像技术在生命科学领域得到了显著的发展，具有蛋白质标记功能的荧光探针应用于蛋白质的检测、定量分析及生理活动监控，特别是在考察生命活动中蛋白质构象复杂的变化机制中具有显著的优势。研究具有蛋白质标记功能的荧光探针，不仅使得蛋白质的生理活动可视化，同时为活体蛋白质的研究及相关疾病的诊断提供一种可能，对于生命科学、临床医学及药物化学等领域的发展都具有重要意义。

目前，snap-tag在细胞内蛋白质标记、体外分析及靶向荧光探测的研究中获得了非常广泛的应用，snap-tag具有蛋白标签与底物的反应速度快且特异性高，通过共价键的结合蛋白标记的稳定性好等优点。不过这一方法也存在一定的不足：标签特异性底物与染料结合后存在溶解分散性能差的问题，限制了其在生物组织或细胞中靶点目标蛋白质的应用。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一类具有蛋白质标记功能的荧光化合物及应用。

本发明采用的技术方案为：一类具有蛋白质标记功能的荧光化合物，该化合物的结构通式如下：

通式中：

其中：n＝0-18的整数，m＝0-18的整数，e＝0-18的整数，n1＝0-18的整数，n2＝0-18的整数；x^-为阴离子，所述阴离子为bf4^-、cl^-、br^-、i^-、no3^-、so4^2-、clo4^-、ch3coo^-、ch3so3^-或cf3so3^-；

所述所带正电荷总数等于阴离子所带负电荷总数，r1和r2可为不同基团,r5和r6可为不同基团；

r3和r4可为不同基团；

n3＝0-11的整数，n4＝0-5的整数，m1＝0-11的整数，n5＝0-11的整数，m2＝0-11的整数，n6＝0-5的整数，m3＝0-11的整数。

所述一类具有蛋白质标记功能的荧光化合物的制备方法，首先磺酸罗丹明通过酰胺化合成带叠氮基的化合物a，化合物a与化合物b再通过click反应生成目标化合物；

其中，r1、r2、r3、r4和y同结构通式中的定义。

所述一类具有蛋白质标记功能的荧光化合物的应用，该化合物应用于专一性标记目标蛋白质及检测蛋白质所处微环境的ph值。

本发明的有益效果是：一类具有蛋白质标记功能的荧光化合物及应用，这类具有蛋白质标记功能的荧光化合物的制备方法简单，利用炔基和叠氮基在温和条件下进行连接的特性，将与蛋白质特异性结合的o⁶位置修饰的苄基鸟嘌呤连接到磺酸罗丹明的酰胺链上。由于磺酸罗丹明较普通羧酸罗丹明以及其它荧光染料的水溶性好，因此该化合物克服了因苄基鸟嘌呤基团引入而引起蛋白质标记化合物水溶性差的问题。该化合物能够通过o⁶位置修饰的苄基鸟嘌呤与经基因修饰的目标蛋白质发生专一性反应而标记蛋白质，进而通过荧光示踪进行蛋白质的检测、定量分析及生理活动监控。

具体实施方式

本发明用以下实例加以说明但不局限于此，其中除非另有说明，所有的份数和百分数均以重量计。

以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例。

实施例1

称取磺酸罗丹明(0.96g，2mmol)于反应瓶中，加入1，2-二氯乙烷充分搅拌，缓慢滴加三氯氧磷，95℃回流反应，硅胶板监测反应进度，待磺酸罗丹明反应完全后，冷却、减压蒸出溶剂得罗丹明磺酰氯备用；将叠氮基胺(0.34g，4mmol)、三乙胺和乙腈加入反应瓶室温搅拌，将罗丹明磺酰氯溶于乙腈中缓慢加入反应液，室温反应，薄层色谱监测反应进度。产物水洗萃取，减压蒸出溶剂，经柱色谱分离提纯，产物结构通过hrms鉴定。

实施例2

氩气保护下，将化合物a1(20mg，36μmol)与化合物b(13mg，43μmol)加至反应瓶中，加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴n,n-二异丙基乙胺，室温下反应24h，减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离，得到紫色固体。产物结构通过hrms鉴定。

实施例3

称取磺酸罗丹明(1g，2mmol)于反应瓶中，加入1，2-二氯乙烷充分搅拌，缓慢滴加三氯氧磷，95℃回流反应，硅胶板监测反应进度，待磺酸罗丹明反应完全后，冷却、减压蒸出溶剂得罗丹明磺酰氯备用；将叠氮基胺(0.52g，4mmol)、三乙胺和乙腈加入反应瓶室温搅拌，将罗丹明磺酰氯溶于乙腈中缓慢加入反应液，室温反应，薄层色谱监测反应进度。产物水洗萃取，减压蒸出溶剂，经柱色谱分离提纯，产物结构通过hrms鉴定。

实施例4

氩气保护下，将化合物a2(22mg，36μmol)与化合物b(13mg，43μmol)加至反应瓶中，加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴n,n-二异丙基乙胺，室温下反应24h，减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离，得到紫色固体。产物结构通过hrms鉴定。

实施例5

称取磺酸罗丹明(1.26g，2mmol)于反应瓶中，加入1，2-二氯乙烷充分搅拌，缓慢滴加三氯氧磷，95℃回流反应，硅胶板监测反应进度，待磺酸罗丹明反应完全后，冷却、减压蒸出溶剂得罗丹明磺酰氯备用；将叠氮基胺(0.4g，4mmol)、三乙胺和乙腈加入反应瓶室温搅拌，将罗丹明磺酰氯溶于乙腈中缓慢加入反应液，室温反应，薄层色谱监测反应进度。产物水洗萃取，减压蒸出溶剂，经柱色谱分离提纯，产物结构通过hrms鉴定。

实施例6

氩气保护下，将化合物a3(26mg，36μmol)与化合物b(13mg，43μmol)加至反应瓶中，加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴n,n-二异丙基乙胺，室温下反应24h，减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离，得到紫色固体。产物结构通过hrms鉴定。

实施例7

称取磺酸罗丹明(0.9g，2mmol)于反应瓶中，加入1，2-二氯乙烷充分搅拌，缓慢滴加三氯氧磷，95℃回流反应，硅胶板监测反应进度，待磺酸罗丹明反应完全后，冷却、减压蒸出溶剂得罗丹明磺酰氯备用；将叠氮基胺(0.52g，4mmol)、三乙胺和乙腈加入反应瓶室温搅拌，将罗丹明磺酰氯溶于乙腈中缓慢加入反应液，室温反应，薄层色谱监测反应进度。产物水洗萃取，减压蒸出溶剂，经柱色谱分离提纯，产物结构通过hrms鉴定。

实施例8

氩气保护下，将化合物a4(20mg，36μmol)与化合物b(13mg，43μmol)加至反应瓶中，加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴n,n-二异丙基乙胺，室温下反应24h，减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离，得到紫色固体。产物结构通过hrms鉴定。

实施例9

称取磺酸罗丹明(0.83g，2mmol)于反应瓶中，加入1，2-二氯乙烷充分搅拌，缓慢滴加三氯氧磷，95℃回流反应，硅胶板监测反应进度，待磺酸罗丹明反应完全后，冷却、减压蒸出溶剂得罗丹明磺酰氯备用；将叠氮基胺(0.52g，4mmol)、三乙胺和乙腈加入反应瓶室温搅拌，将罗丹明磺酰氯溶于乙腈中缓慢加入反应液，室温反应，薄层色谱监测反应进度。产物水洗萃取，减压蒸出溶剂，经柱色谱分离提纯，产物结构通过hrms鉴定。

实施例10

氩气保护下，将化合物a5(19mg，36μmol)与化合物b(13mg，43μmol)加至反应瓶中，加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴n,n-二异丙基乙胺，室温下反应24h，减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离，得到紫色固体c5。产物结构通过hrms鉴定。

实施例11

称取磺酸罗丹明(0.92g，2mmol)于反应瓶中，加入1，2-二氯乙烷充分搅拌，缓慢滴加三氯氧磷，95℃回流反应，硅胶板监测反应进度，待磺酸罗丹明反应完全后，冷却、减压蒸出溶剂得罗丹明磺酰氯备用；将叠氮基胺(0.4g，4mmol)、三乙胺和乙腈加入反应瓶室温搅拌，将罗丹明磺酰氯溶于乙腈中缓慢加入反应液，室温反应，薄层色谱监测反应进度。产物水洗萃取，减压蒸出溶剂，经柱色谱分离提纯，产物结构通过hrms鉴定。

实施例12

氩气保护下，将化合物a6(20mg，36μmol)与化合物b(13mg，43μmol)加至反应瓶中，加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴n,n-二异丙基乙胺，室温下反应24h，减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离，得到紫色固体。产物结构通过hrms鉴定。

实施例13

称取磺酸罗丹明(1.01g，2mmol)于反应瓶中，加入1，2-二氯乙烷充分搅拌，缓慢滴加三氯氧磷，95℃回流反应，硅胶板监测反应进度，待磺酸罗丹明反应完全后，冷却、减压蒸出溶剂得罗丹明磺酰氯备用；将叠氮基胺(0.75g，4mmol)、三乙胺和乙腈加入反应瓶室温搅拌，将罗丹明磺酰氯溶于乙腈中缓慢加入反应液，室温反应，薄层色谱监测反应进度。产物水洗萃取，减压蒸出溶剂，经柱色谱分离提纯，产物结构通过hrms鉴定。

实施例14

氩气保护下，将化合物a7(24mg，36μmol)与化合物b(13mg，43μmol)加至反应瓶中，加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴n,n-二异丙基乙胺，室温下反应24h，减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离，得到紫色固体。产物结构通过hrms鉴定。

实施例15

称取磺酸罗丹明(1.95g，2mmol)于反应瓶中，加入1，2-二氯乙烷充分搅拌，缓慢滴加三氯氧磷，95℃回流反应，硅胶板监测反应进度，待磺酸罗丹明反应完全后，冷却、减压蒸出溶剂得罗丹明磺酰氯备用；将叠氮基胺(0.75g，4mmol)、三乙胺和乙腈加入反应瓶室温搅拌，将罗丹明磺酰氯溶于乙腈中缓慢加入反应液，室温反应，薄层色谱监测反应进度。产物水洗萃取，减压蒸出溶剂，经柱色谱分离提纯，产物结构通过hrms鉴定。

实施例16

氩气保护下，将化合物a8(41mg，36μmol)与化合物b(13mg，43μmol)加至反应瓶中，加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴n,n-二异丙基乙胺，室温下反应24h，减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离，得到紫色固体。产物结构通过hrms鉴定。

实施例17

称取磺酸罗丹明(0.84g，2mmol)于反应瓶中，加入1，2-二氯乙烷充分搅拌，缓慢滴加三氯氧磷，95℃回流反应，硅胶板监测反应进度，待磺酸罗丹明反应完全后，冷却、减压蒸出溶剂得罗丹明磺酰氯备用；将叠氮基胺(0.51g，4mmol)、三乙胺和乙腈加入反应瓶室温搅拌，将罗丹明磺酰氯溶于乙腈中缓慢加入反应液，室温反应，薄层色谱监测反应进度。产物水洗萃取，减压蒸出溶剂，经柱色谱分离提纯，产物结构通过hrms鉴定。

实施例18

氩气保护下，将化合物a9(19mg，36μmol)与化合物b(13mg，43μmol)加至反应瓶中，加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴n,n-二异丙基乙胺，室温下反应24h，减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离，得到紫色固体。产物结构通过hrms鉴定。

实施例19

称取磺酸罗丹明(1.18g，2mmol)于反应瓶中，加入1，2-二氯乙烷充分搅拌，缓慢滴加三氯氧磷，95℃回流反应，硅胶板监测反应进度，待磺酸罗丹明反应完全后，冷却、减压蒸出溶剂得罗丹明磺酰氯备用；将叠氮基胺(0.74g，4mmol)、三乙胺和乙腈加入反应瓶室温搅拌，将罗丹明磺酰氯溶于乙腈中缓慢加入反应液，室温反应，薄层色谱监测反应进度。产物水洗萃取，减压蒸出溶剂，经柱色谱分离提纯，产物结构通过hrms鉴定。

实施例20

氩气保护下，将化合物a10(21mg，36μmol)与化合物b(13mg，43μmol)加至反应瓶中，加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴n,n-二异丙基乙胺，室温下反应24h，减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离，得到紫色固体。产物结构通过hrms鉴定。

实施例21

称取磺酸罗丹明(0.96g，2mmol)于反应瓶中，加入1，2-二氯乙烷充分搅拌，缓慢滴加三氯氧磷，95℃回流反应，硅胶板监测反应进度，待磺酸罗丹明反应完全后，冷却、减压蒸出溶剂得罗丹明磺酰氯备用；将叠氮基胺(0.92g，4mmol)、三乙胺和乙腈加入反应瓶室温搅拌，将罗丹明磺酰氯溶于乙腈中缓慢加入反应液，室温反应，薄层色谱监测反应进度。产物水洗萃取，减压蒸出溶剂，经柱色谱分离提纯，产物结构通过hrms鉴定。

实施例22

氩气保护下，将化合物a11(25mg，36μmol)与化合物b(13mg，43μmol)加至反应瓶中，加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴n,n-二异丙基乙胺，室温下反应24h，减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离，得到紫色固体。产物结构通过hrms鉴定。

实施例23

合成方法同实施例21。

实施例24

合成方法同实施例22。

实施例25

称取磺酸罗丹明(1.18g，2mmol)于反应瓶中，加入1，2-二氯乙烷充分搅拌，缓慢滴加三氯氧磷，95℃回流反应，硅胶板监测反应进度，待磺酸罗丹明反应完全后，冷却、减压蒸出溶剂得罗丹明磺酰氯备用；将叠氮基胺(0.52g，4mmol)、三乙胺和乙腈加入反应瓶室温搅拌，将罗丹明磺酰氯溶于乙腈中缓慢加入反应液，室温反应，薄层色谱监测反应进度。产物水洗萃取，减压蒸出溶剂，经柱色谱分离提纯，产物结构通过hrms鉴定。

实施例26

氩气保护下，将化合物a13(25mg，36μmol)与化合物b(13mg，43μmol)加至反应瓶中，加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴n,n-二异丙基乙胺，室温下反应24h，减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离，得到紫色固体。产物结构通过hrms鉴定。

实施例27

合成方法同实施例25。

实施例28

合成方法同实施例26。

实施例29

称取磺酸罗丹明(1.30g，2mmol)于反应瓶中，加入1，2-二氯乙烷充分搅拌，缓慢滴加三氯氧磷，95℃回流反应，硅胶板监测反应进度，待磺酸罗丹明反应完全后，冷却、减压蒸出溶剂得罗丹明磺酰氯备用；将叠氮基胺(0.75g，4mmol)、三乙胺和乙腈加入反应瓶室温搅拌，将罗丹明磺酰氯溶于乙腈中缓慢加入反应液，室温反应，薄层色谱监测反应进度。产物水洗萃取，减压蒸出溶剂，经柱色谱分离提纯，产物结构通过hrms鉴定。

实施例30

氩气保护下，将化合物a15(29mg，36μmol)与化合物b(13mg，43μmol)加至反应瓶中，加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴n,n-二异丙基乙胺，室温下反应24h，减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离，得到紫色固体。产物结构通过hrms鉴定。

实施例31

合成方法同实施例29。

实施例32

合成方法同实施例30。

实施例33

称取磺酸罗丹明(1.04g，2mmol)于反应瓶中，加入1，2-二氯乙烷充分搅拌，缓慢滴加三氯氧磷，95℃回流反应，硅胶板监测反应进度，待磺酸罗丹明反应完全后，冷却、减压蒸出溶剂得罗丹明磺酰氯备用；将叠氮基胺(0.4g，4mmol)、三乙胺和乙腈加入反应瓶室温搅拌，将罗丹明磺酰氯溶于乙腈中缓慢加入反应液，室温反应，薄层色谱监测反应进度。产物水洗萃取，减压蒸出溶剂，经柱色谱分离提纯，产物结构通过hrms鉴定。

实施例34

氩气保护下，将化合物a17(22mg，36μmol)与化合物b(13mg，43μmol)加至反应瓶中，加入无水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和4滴n,n-二异丙基乙胺，室温下反应24h，减压蒸除溶剂。粗产品柱层析分离，得到紫色固体。产物结构通过hrms鉴定。