用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂、检测方法及应用与流程

本申请涉及鹿流行性出血热病毒检测领域，特别是涉及一种用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂、检测方法及应用。

背景技术：

鹿流行性出血热病(Epizootic hemorrhagic disease ofdeer,EHD)是由呼肠弧病毒科环状病毒属的鹿流行性出血热病毒(EHDV)引起的疾病。EHD是昆虫库蠓属传播的影响野生和家养的反刍动物感染的非接触性传染病，是重要的虫媒病之一。在自然条件下，EHDV可引起牛、绵羊等家畜及白尾鹿、糜、大角羚羊等多种驯养和野生反刍动物感染，其中白尾鹿是受EHDV影响最严重的物种。鹿感染该病毒后体温升高，黏膜和浆膜面广泛出血，急性型死亡率高。EHDV严重影响着许多国家的畜牧业和国际贸易的发展，世界动物卫生组织将EHD列为法定报告传染病。

鹿流行性出血热病毒与蓝舌病病毒、非洲马瘟病毒同属于呼肠孤病毒科环状病毒属，为双股RNA病毒，无囊膜。由三个同心蛋白层组成一个二十面体病毒核，直径约80nm。EHDV有一个10段的RNA基因组，可以编码7种结构蛋白，即VP1至VP7，分为两个衣壳。内衣壳层由120个拷贝的结构蛋白VP3，包裹着VPl、VP4、VP6三个次要蛋白成分，以及病毒基因组；外衣壳层由780个拷贝的VP7和60个三聚VP2、180个三聚VP5组成，在EHDV感染细胞中还发现三种不同的非结构蛋白NS1、NS2和NS3/NS3a。国际病毒分类委员会(ICTV)网站查询显示EHDV有八种血清型。EHDV-1和EHDV-2都是野生有蹄类动物大规模疫情的罪魁祸首，尤其是白尾鹿，有时会造成严重的死亡。EHDV-1即New Jersey strain-USA1955/01，首次在美国东北部发现，EHDV-21962年在加拿大阿尔伯塔省南部首次发行，但也在澳大利亚和日本传播。EHDV血清型3和血清型4只在非洲报道过。血清型5至8最初是在澳大利亚有报道。最初只有EHDV-1和EHDV-2在多个大陆上被发现。然而，最近在中东和美国都发现了EHDV-6，2006年在以色列也发现了EHDV-7，表明其他EHDV血清型也存在于广泛分离的地理位置。

EHDV常规检测和分型程序包括从鸡胚或绵羊中分离病毒，或适应细胞培养，然后在“病毒中和试验”(VNT)中使用针对已建立血清型的参考抗血清进行分型。然而，上述方法成本高、耗时长，并且需要获得参考病毒或抗血清。

近年来实时荧光PCR在动物疫病诊断检测方面应用广泛，与传统血清学方法相比，该方法快速、可靠，已成为许多实验室的标准诊断检测方法。目前已经有部分关于EHDV种或血清组特异性PCR检测的相关研究和报道；但是，这些检测都需要借助特殊的仪器设备，并且检测流程相对复杂，难以适用于现场检测。EHD是一种外来病，虽然我国暂未见发现该病的报道，但随着我国进口动物及动物产品贸易量的不断增长，EHD存在传入我国的风险，一旦传入将会给我国的养殖业造成巨大影响，因此亟需建立一种能够更好的适用于现场快速检测的EHDV检测方法，以防止EHDV传入或扩散。

技术实现要素：

本申请的目的是提供一种用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂、检测方法及应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂，该试剂包括用于一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的鹿流行性出血热病毒特异性引物对和探针，探针在引物对的扩增靶标区域内，引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列；

Seq ID No.1：5’-ATAAGAGGGACTGGTATTTGGGAAAATGATGAAT-3’

Seq ID No.2：5’-CCAAAGCAGACGAAGCAAAATAGTCTGAACATGAT-3’

Seq ID No.3：

5’-CAGGAGGGAATCTATCTGCTAGCGAGAGTGCTACTACGCTGGGAACTATC-3’

其中，SEQ ID No.3所示的探针序列中，第32个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，第33个碱基替换为碱基类似物，第35个碱基修饰荧光基团-dT，3’末端修饰C3Spacer。

需要说明的是，本申请的试剂中，引物对和探针是针对鹿流行性出血热病毒设计的，是特别用于一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的引物和探针。一步法逆转录重组酶聚合酶扩增，缩写RT-RPA，是在重组酶聚合酶扩增反应体系的基础上添加逆转录酶，使其可以直接对RNA模板进行一步法快速扩增。重组酶聚合酶扩增，缩写RPA，是英国TwistDx公司开发的一种新型的核酸等温扩增技术；该技术的关键之一是设计合适的扩增引物对和探针。但是，常规PCR引物对和探针并不适合RPA；常规PCR的引物相对太短、重组效率低；常规的探针系统，与RPA也不兼容。因此，无法通过常规的引物或探针设计软件直接输出适用于RPA的引物对和探针。目前设计RPA引物对和探针，主要根据TwistDx公司网站上提供的筛选指南，人工设计多条特异性引物和探针进行试验筛选，以获得扩增效率高、灵敏度高、特异性强的引物和探针。本申请的一种实现方式中，分别设计了2条RPA探针，并针对每条探针分别设计了3条上游引物和3条下游引物，用于试验筛选，最终筛选出Seq ID No.1所示序列和Seq ID No.2所示序列的引物对，以及SEQ ID No.3所示序列的探针，作为本申请的鹿流行性出血热病毒检测试剂。

还需要说明的是，RPA的原理是采用三个酶，在恒温下使一对引物对靶标进行指数扩增；本申请的试剂中，考虑到通过荧光检测的方式对RPA扩增产物进行检测，因此，在一对特异性引物的基础上提供了相应的特异性探针。可以理解，RPA扩增产物也可以采用其它方式，例如侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等进行检测；因此，如果不采用荧光检测，则可以不使用SEQ ID No.3所示序列的探针。也就是说，本申请的试剂中，可以单独使用Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列的引物，也可以与探针一起使用，具体使用方式可以根据检测条件和环境选择。本申请的一种实现方式中，由于采用便携式的常温等温扩增荧光检测仪，优选的将引物和探针一起使用，通过荧光法对RPA扩增产物进行检测。

优选的，荧光淬灭基团-dT为BHQ1-dT。

优选的，碱基类似物为dSpacer。

优选的，荧光基团-dT为6-FAM-dT。

需要说明的是，根据探针的设计原则，只需要在碱基类似物的两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团即可，本申请的优选方案中，优选的使用FAM荧光基团和BHQ1荧光淬灭基团。可以理解，荧光基团的选择是根据所使用的荧光检测仪的荧光通道进行的，不同的荧光检测仪具有检测一种或多种荧光基团的通道，例如FAM、TET、JOE、HEX、CY3、CY5等；而荧光淬灭基团则是根据荧光基团进行选择的，荧光淬灭基团的吸收光谱只要能够覆盖荧光基团的发射光谱即可，不只限于BHQ1。

本申请的另一面公开了本申请的用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂在鹿流行性出血热病毒非诊断治疗目的的检测中的应用。

可以理解，本申请的鹿流行性出血热病毒的检测试剂和方法，虽然可以为鹿流行性出血热病的诊断或治疗提供参考依据；但是，本申请的目的并非通过本申请的试剂或方法对鹿流行性出血热病进行诊断，本申请的目的是采用本申请的试剂或方法对相关的动物产品或动物源产品进行检测，以避免其携带鹿流行性出血热病毒，造成鹿流行性出血热病毒的传播或扩散。另外，本申请的试剂和方法也可以应用于鹿流行性出血热病毒的基础研究。

本申请的另一面公开了本申请的用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂在制备鹿流行性出血热病毒检测试剂盒、检测试纸条或检测芯片中的应用。

可以理解，本申请用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂还可以采用侧流层析试纸条、生物芯片等进行检测；因此，本申请的试剂可以用于制备特异性的用于鹿流行性出血热病毒检测的检测试纸条或检测芯片。

本申请的再一面公开了一种用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂。

优选的，本申请的用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂盒中还含有用于一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。

需要说明的是，本申请的试剂盒，是特别针对鹿流行性出血热病毒的重组酶聚合酶扩增检测设计的，因此，为了使用方便，试剂盒中完全可以进一步的包括用于一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。其中，反应液在本申请的一种实现方式中为Rehydration Buffer，酶可以是混合有多种酶的RPA冻干酶粉，反应添加剂在本申请的一种实现方式中采用的是MgAc；另外，考虑到一步法逆转录的实现，本申请的一种实现方式中还包括了反转录酶MMLV Reverse Transcriptase和RNA酶抑制剂Recombinant RNase Inhibitor。

本申请的再一面公开了一种鹿流行性出血热病毒的非诊断治疗目的的检测方法，包括采用本申请的用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂，或本申请的用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂盒，对待测样品的核酸进行一步法逆转录重组酶聚合酶扩增检测，并采用荧光检测仪收集荧光。

需要说明的是，本申请的检测方法，通过一步法逆转录重组酶聚合酶扩增对鹿流行性出血热病毒进行快速检测，一方面，一步法逆转录重组酶聚合酶扩增检测速度快，只需要十几二十分钟就可以完成检测；另一方面，整个检测只需要在相对较低的恒温下就可以完成，例如采用便携式的常温等温扩增荧光检测仪即可。因此，本申请检测方法特别适合于鹿流行性出血热病毒的现场快速检测，为疫病的快速检测和防控提供有力的科学依据。

优选的，一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的反应条件为，40℃恒温反应15分钟。

需要说明的是，RPA所采用的酶的活性最适合温度范围为37℃-42℃，RPA通常二十分钟内就可以完成检测；本申请优选的方案中，引物探针扩增效率较高，优选在40℃恒温反应15分钟。

本申请的有益效果在于：

本申请用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂，能够通过一步法逆转录重组酶聚合酶扩增，对鹿流行性出血热病毒进行敏感、特异、高效的检测。采用本申请的试剂可以方便的对鹿流行性出血热病毒进行现场检测，并且可以快速的获得检测结果；这对于鹿流行性出血热病毒的快速防控，防止疫情传播，最大限度的保障生产安全具有重大意义。

附图说明

图1是本申请实施例中鹿流行性出血热病毒RT-RPA特异性检测结果；

图2是本申请实施例中鹿流行性出血热病毒RT-RPA灵敏度检测结果；

图3是本申请实施例中采用OIE推荐的实时荧光RT-PCR法进行鹿流行性出血热病毒灵敏度检测的结果；

图4是本申请实施例中鹿流行性出血热病毒RT-RPA重复性检测结果。

具体实施方式

近年来，多种恒温核酸扩增技术的出现解决了传统PCR技术成本高、耗时长、依赖精密温度循环仪器等局限。其中，重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)是一种新型的等温核酸扩增技术，被视为“最可能替代传统PCR”的恒温扩增技术。RPA技术主要依赖三种酶：单链DNA结合蛋白(Single-stranded DNABingding，SSB)、重组酶、链置换DNA聚合酶。该技术原理是在恒温下，重组酶与引物结合形成复合体，酶促使引物定位到DNA双链模板的同源靶序列上，并在单链DNA结合蛋白的协助下，解链模板DNA，随后在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，循环进行从而实现DNA的指数增长，反应体系中增加反转录酶则可以对RNA模板进行一步法快速扩增，即本申请采用的一步法逆转录重组酶聚合酶扩增。RPA最佳反应温度范围是37℃至42℃，反应时间少于二十分钟。结合荧光探针使用的实时RPA检测技术，可在便携式恒温扩增荧光检测仪中实现检测结果的直接读取，极大简化了反应程序，检测时间和便利性优于传统PCR法，非常适用于设备简配的基层或现场实验室，在动物疫病检测方面具有广泛的应用前景，因此，本申请研发了用于鹿流行性出血热病毒快速检测的试剂。该试剂包括用于一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的鹿流行性出血热病毒特异性引物对和探针，探针在引物对的扩增靶标区域内，引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；其中，SEQ ID No.3所示的探针序列中，第32个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，第33个碱基替换为碱基类似物，第35个碱基修饰荧光基团-dT，3’末端修饰C3 Spacer。

本申请的鹿流行性出血热病毒检测试剂，在本申请的一种实现方式中，其灵敏度可以达到8×10¹copies/μL，可用于对鹿流行性出血热病毒的现场快速检测，防止疫情传入，从而更有效的保障养殖生产安全。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、材料与方法

1.试验用质粒及核酸样品

本例根据NCBI GenBank中公布的鹿流行性出血热病毒保守的非结构蛋白NS1基因(Segment 5)，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成该基因片段并克隆到pUC载体中，命名为EHDV-Seg5。本例所用的灭活抗原核酸包括EHDV-1和EHDV-1，蓝舌病病毒核酸、牛病毒性腹泻病毒核酸、口蹄疫病毒核酸。

2.主要的试剂和仪器

TwistAmp exo kit(TwistDx)，MMLV Reverse Transcriptase(Takara)，Recombinant RNase Inhibitor(Takara)，恒温扩增仪(Axxin)，5415R型高速离心机(Eppendorf)，7500 Fast荧光PCR仪(ABI)，超微量核酸蛋白浓度分析仪(BioDrop)等。

3.RT-RPA引物和探针的设计与筛选

本例根据鹿流行性出血热病毒因组中序列保守稳定的NS1基因(Segment 5)序列，设计了多条特异性的引物和探针，设计好引物和探针后，通过BLAST比对确定其特异性，然后再用于后续试验筛选，引物和探针具体序列如表1所示。本例所有的引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1重组酶聚合酶扩引物和探针

表1中，SEQ ID No.3所示序列的EHDVRPAP1探针中，第32个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，第33个碱基替换为碱基类似物，第35个碱基修饰荧光基团-dT，3’末端修饰C3 Spacer。SEQ ID No.14所示序列的EHDVRPAP2探针中，第32个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，第33个碱基替换为碱基类似物，第35个碱基修饰荧光基团-dT，3’末端修饰C3 Spacer。

需要说明的是，RT-RPA引物和探针的设计实际上与RPA引物和探针是一样的，只是在反应体系中增加了反转录酶及RNA酶抑制剂，从而实现一步法逆转录重组酶聚合酶扩增。在对实际样品进行检测时，是提取样品的RNA用于检测，其余步骤和条件都与RPA相同。

4.反应体系和反应条件

本例采用TwistAmp exo Kit试剂盒进行RT-RPA扩增。

反应体系为50μL。将RehydrationBuffer 29.5μL、两条浓度为10μM的引物各2.1μL、浓度为10μM的探针0.6μL、200U/μL MMLV Reverse Transcriptase 1μL、40U/μL Recombinant RNase Inhibitor 1μL、DEPC水8.7μL、核酸模板2.5μL混合均匀后加入到RPA冻干酶粉的反应管中，混匀，最后加入浓度为280mM的MgAc溶液2.5μL，混匀。将上述反应管置于Axxin恒温扩增仪中，40℃反应15分钟，反应过程中实时读取荧光信号。

其中，两条浓度为10μM的引物是指上游引物和下游引物。本例的反应体系与常规的RPA反应体系不同的是，增加了反转录酶MMLV Reverse Transcriptase和RNA酶抑制剂Recombinant RNase Inhibitor，其余组份和反应条件都与RPA相同。本例的反应体系可以对DNA进行检测，也可以直接检测RNA。如果是对DNA进行检测，则反转录酶和RNA酶抑制剂不发挥作用。如果是对RNA进行检测，则反转录酶在反应过程中同时进行反转录，将RNA反转录为cDNA，然后进行重组酶聚合酶扩增，该过程是在一个反应体系中同步进行。

5.引物和探针筛选

在筛选的过程中，先采用其中一条上游引物，对下游引物进行筛选，然后再根据筛选出来的下游引物，再去筛选上游引物，以获得最佳的鹿流行性出血热病毒检测用引物探针组合。引物和探针筛选采用“4.反应体系和反应条件”。

6.特异性试验

采用筛选的引物和探针组合，按“4.反应体系和反应条件”，对EHDV-Seg5、EHDV-1和EHDV-1，蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻病毒、口蹄疫病毒等几种核酸模板进行检测。并设置一个阴性对照和空白水对照，其中阴性对照是指从阴性的牛血中提取的RNA样品。

7.灵敏度试验

本例将EHDV-Seg5按10倍梯度稀释至10^-6，采用各梯度浓度的稀释核酸模板，按“4.反应体系和反应条件”进行RPA试验，试验中设置一个水空白对照，以测试引物探针的灵敏度。同时，与OIE推荐的实时荧光RT-PCR法进行比较，即采用相同的稀释核酸模板，按照OIE推荐的实时荧光RT-PCR法对各稀释核酸模板进行检测。

8.重复性试验

采用10^-2、10^-3稀释浓度的核酸为模板，按“4.反应体系和反应条件”进行RPA试验，重复检测三次分析其稳定性。

9.样品的检测

对实验室保存的27份鹿血样品，52份牛血样品，36份羊血样品按照“4.反应体系和反应条件”进行检测，并设置EHDV阳性对照、阴性对照和水空白对照，同时用OIE推荐的实时荧光RT-PCR法进行检测。所有样品均由深圳海关动植中心提供和保藏。各血样品采用RNA提取试剂盒提取RNA后直接进行检测。

二、结果和分析

1.引物和探针筛选

经过筛选，本例最终从表1的引物探针中，筛选出Seq ID No.1所示序列的上游引物EHDVF2、Seq ID No.2所示序列的下游引物EHDVR1和Seq ID No.3所示序列的探针EHDVRPAP1，该引物和探针组合可用于对鹿流行性出血热病毒进行特异性检测。

根据筛选结果可见，即使是相同的探针，不同的上游和下游引物组合，对重组酶聚合酶扩增的扩增效率、特异性和灵敏度都有影响。

2.特异性试验结果

特异性检测结果如图1所示，图中，曲线1为EHDV-Seg5的检测结果，曲线2为EHDV-1的检测结果，曲线3为EHDV-2的检测结果，曲线4-8分别为蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻病毒、口蹄疫病毒、阴性对照和水空白对照的检测结果。可见，仅重组质粒EHDV-Seg5及EHDV-1、EHDV-2灭活抗原核酸有荧光曲线，呈阳性；而其它病原核酸和阴性对照、水空白对照都没有荧光曲线，呈阴性。因此，本例的引物和探针能对EHDV进行特异性检测，与蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻病毒、口蹄疫病毒灭活抗原核酸无交叉反应，具有良好的特异性。

3.灵敏度试验结果

本例的引物和探针对EHDV的灵敏度检测结果如图2所示，图2中，曲线1至曲线4依序为EHDV-Seg5稀释度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4的扩增曲线，曲线5至曲线7依序为10^-5、10^-6以及水空白对照的扩增曲线。由检测结果可知，本例中RPA最低可以检测到EHDV-Seg510^-4稀释度。测得质粒EHDV-Seg5原始浓度后，换算成拷贝数为8×10⁵copies/μL，10^-4稀释度对应的质粒浓度为8×10¹copies/μL。

对相同的稀释核酸模板，使用OIE推荐的实时荧光RT-PCR法进行灵敏度检测，检测结果如图3所示，图3中，曲线1至曲线5依序为EHDV-Seg5稀释度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的扩增曲线，曲线6、曲线7分别为10^-6以及水空白对照的扩增曲线。由检测结果可知，OIE推荐的实时荧光RT-PCR法最低可以检测到EHDV-Seg510^-5稀释度，对应的质粒浓度为8×10⁰copies/μL。

可见，相对于目前常规使用的OIE推荐的实时荧光RT-PCR检测方法，本例的EHDV RT-RPA检测方法可以达到相近的灵敏度；但是，本例的检测方法，其检测时间短，不需要大型仪器设备，大大缩短了检测时间，提升了检测效率。

4.重复性试验结果

重复性检测结果如图4所示，图中，曲线1至曲线3为10^-2稀释的EHDV-Seg5扩增曲线，曲线4至曲线6为10^-3稀释的EHDV-Seg5扩增曲线，曲线7至曲线9为水空白对照的扩增曲线。可见曲线1至曲线3检测结果一致，曲线4至曲线6检测结果一致，在相同位置均可观察到相对应的荧光曲线，说明本例RT-RPA方法重复性良好。

5.样品的检测

样品检测结果显示，采用本例的引物和探针对27份鹿血样品，52份牛血样品，36份羊血样品共115份样品进行RT-RPA检测，阳性对照出现荧光扩增曲线，阴性对照、水空白对照及样品均无扩增曲线出现，样品检测结果为阴性，与OIE推荐的实时荧光RT-PCR法检测结果相同。

本例的鹿流行性出血热病毒检测方法和试剂，检测时间短，反应条件简单且无需大型仪器设备，大大提升了检测效率。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳海关动植物检验检疫技术中心

武定县动物疫病预防控制中心

<120> 用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂、检测方法及应用

<130> 19I28498

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ataagaggga ctggtatttg ggaaaatgat gaat 34

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccaaagcaga cgaagcaaaa tagtctgaac atgat 35

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caggagggaa tctatctgct agcgagagtg ctactacgct gggaactatc 50

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taggtggata agagggactg gtatttggga aaatg 35

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caatacaaat tcataggtgg ataagaggga ctgg 34

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atccttcctt ggcgcatatc caaagcagac gaagc 35

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaacgtgcct agatctttcc agtcaggtat tgttc 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caaaaccatg acccagtatc catcattaca agcac 35

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agacaaaacc atgacccagt atccatcatt acaag 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttgagtttag acaaaaccat gacccagtat ccatc 35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aaatgggcgg tatattgttt ggtagcgttg ttctg 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtatattgtt tggtagcgtt gttctgttaa gaatc 35

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aggcggataa atgggcggta tattgtttgg tagcg 35

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tatattcaat gtttactcat ataagaatcc tttgtggcat ggactacgag 50