一种用于植物基因定点剪切的TALE核酸酶精简骨架构建的制作方法

本发明属于植物生物技术领域，具体地说构建适合植物表达的talens的精简骨架，即n端包含136个氨基酸，c端包含63个氨基酸，中间构建识别特异dna序列的tale的重复模块，c端融合有fokiⅱ型核酸内切酶，构建成tale核酸酶能够剪切特异dna序列。

背景技术：

近年来兴起的基因组定点编辑技术包括以下几种人工核酸酶：锌指核酸酶(zfns),tale核酸酶(talens),以及crispr/cas系统。这些人工核酸酶都可以在dna靶位点产生dna双链断裂,它们对基因组定点编辑是通过控制dna的修复途径实现的。目前主要应用技术有crispr/cas系统和talens技术。

2009年，美国爱荷华州立大学植物病理、生物信息学和计算生物学计划系的moscou等（moscou，science,2009，326(5959):1501）以及德国马丁·路德大学生物研究所遗传系的boch等同时在国际著名的自然科学综合类学术期刊《science》上发表文章（boch，science,2009，326(5959):1509-1512），研究报道在植物病原菌黄单胞菌（xanthomonas）上发现了转录激活子样效应因子（transcriptionactivator-likeeffectors，tales），tales可特异性地结合到dna上并激活基因表达，在该病原菌感染过程中对植物基因进行调控。

随后的研究表明，tales蛋白的dna结合域由一串连续排列、数目不同（12-30个不等）、序列高度同源的蛋白结构域模块构成，每个模块大小为33-35个氨基酸。模块的第12位和13位的氨基酸对应识别dna分子四个碱基中的一个。利用tale序列模块，可组装成特异结合任意dna序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的（bochandbonas,annurevphytopathol,2010,48:419-436）。随后，研究人员尝试仿照锌指核酸酶(zfn)的模式,把tale中的转录激活结构域(ad)替换成核酸内切酶foki，从而构成tale核酸酶(talens),对基因组特定靶位点进行定向切割,从而实现基因打靶。正如巡航导弹击中军事目标一样，talen可特异识别dna序列并进行切割，从而进行基因修饰或敲除，使基因操作变得异常简单、方便(cermak,nucleicacidsres,2011,39(12):e82)。

talens技术可以对基因组靶位点dna进行结构性缺失、插入、重组、修复等剪辑，实现基因功能性敲除或激活。该技术发明后，立即在物种改造和基因治疗领域受到高度重视。短短几年时间内，talens技术已经成功应用到了动物细胞、植物、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象，日益成为功能强大的实验室基因编辑工具。2012年，美国爱荷华州立大学遗传发育和细胞生物学系的yangbing博士及其同事利用talens技术成功地将水稻感病基因os11n3启动子序列定点切割，使水稻白叶枯病原菌tal效应子avrxa7和pthxo3失去对os11n3基因启动子靶点序列的识别，从而提高了水稻抗白叶枯病的能力。这是世界第一例通过talens技术对植物基因组真正实施定点剪辑并获得目标性状改良的植物(yangandwhite,molplantmicrobeinteract,2004,17(11):1192-200)。可以预见,talens技术在医学和农业基础和应用领域必将发挥越来越有广阔的应用前景,并且产生无可估量的深远影响。

关于talens技术专利国外只有一项报道，2013年1月美国minnesota大学和iowa州立大学公开了利用转录激活因子tale结构域和foki内切酶结构区融合构建的转录激活因子核酸酶talen专利技术(us20130177960)，但是该专利只限定启动子改造。我国上海斯丹赛生物技术有限公司2013年1月公布了一种单模块dna文库及talens识别模块的连接方法（201310452282）；2014年1月中国农业科学院作物科学研究所公开了一种构建tal效应子和talens的简化方法及质粒，设计并构建了一个通用质粒psk-rar-u（201410032382.6）。由于通用psk-rar-u能够接受任何一个通过单元装配法组装的dtale重复区，进而构建dtales表达载体的方法简化为：第一步为dtale重复区序列组装，第二步为将dtale重复区序列克隆到psk-rar-u中，他们利用该载体对黄单胞杆菌进行了基因组定点激活、敲除。talens技术的关键是获得针对靶序列的特异tale蛋白，如果设计识别20个以上碱基的转录激活因子核酸酶talen,需要至少2kb的序列,并且这些序列有高度的重复性,因此在设计的时候存在非常大的难度。目前该技术在植物中应用很少，还没有关于该技术在植物上应用。

技术实现要素：

本发明为了简化talens技术在植物基因编辑中的应用，构建适合植物表达的talens的精简骨架，即n端包含136个氨基酸，c端包含63个氨基酸，c端融合有fokiⅱ型核酸内切酶。

本发明为了便于目的基因的编辑，在talens的精简骨架n端和c端，插入一段bamhi和saci的短序列，通过上述两个酶切位点，插入特异dna序列的tale的重复模块。

本发明利用基因合成方法（xiong2004，核酸研究），按照植物偏爱密码及基因优化原则合成talens的精简骨架，n端包含136个氨基酸，c端包含63个氨基酸，c端融合有fokiⅱ型核酸内切酶。n端和c端插入的核苷酸序列为ggatccctggaacactccttgtttgttgtgtcaagcgagctc。

本发明talens的精简骨架由camv35s启动子控制，终止子为nos。插入特异dna序列tale的重复模块与n端包含136个氨基酸，c端包含63个氨基酸，及fokiⅱ型核酸内切酶构成一个融合基因。

本发明构建的talens的精简骨架成功用于水稻和拟南芥八氢番茄红素脱氢酶（phytoenedesaturase，pds）基因的剪切，获得高频率的白化苗。

附图说明

图1植物talens的精简骨架表达单元示意图

图2水稻和拟南芥八氢番茄红素脱氢酶（phytoenedesaturase，pds）基因talen的植物表达载体sfok1ii[tnospds]和sfok1ii[tnospds]构建图谱。

图3水稻八氢番茄红素脱氢酶剪切后白化苗。

图4拟南芥八氢番茄红素脱氢酶剪切后白化苗

本发明有益效果

该发明能够高效用于植物基因的定向剪切，从而完成各种植物的定点改造。

具体实施方式

实施例1：定向编辑植物基因talens的精简骨架编码序列的化学合成

以基因合成方法（nucleicacidsresearch,2004,32,e98）合成talens的精简骨架。设计的引物为：

splanttalens-1atggacccaatccgttctcgtactccatctcctgcacgtgaactgctgcctggtccacaa（seqidno.2所示）

splanttalens-2gtgcaccaccacgatcagcagtaggctggaccctgtcaggttgtggaccaggcagcagtt（seqidno.3所示）

splanttalens-3tgctgatcgtggtggtgcaccacctgctggtggtccactggacggtcttcctgctcgtcg（seqidno.4所示）

splanttalens-4tggtgcaggtggagatggcagccgagtccgagacatagtacgacgagcaggaagaccgtc（seqidno.5所示）

splanttalens-5tgccatctccacctgcaccatctcctgcattctctgctggttccttctccgacctgctgc（seqidno.6所示）

splanttalens-6tcaagaagggaggtgtcaagaagggatggatcgaactgacgcagcaggtcggagaaggaa（seqidno.7所示）

splanttalens-7cttgacacctcccttcttgactcgatgcctgctgttggcactccacatactgctgctgct（seqidno.8所示）

splanttalens-8cagcacgcagaccagactggacctcatcccattcagcaggagcagcagcagtatgtggag（seqidno.9所示）

splanttalens-9ccagtctggtctgcgtgctgctgatgatccaccaccaaccgttcgtgttgctgtcactgc（seqidno.10所示）

splanttalens-10ttccagggatccagcaggcttggcacgtggtggacgtgcagcagtgacagcaacacgaac（seqidno.11所示）

splanttalens-11agcctgctggatccctggaacactccttgtttgttgtgtcaagcgagctcgctgtcactg（seqidno.12所示）

splanttalens-12tcaggaacacggacctcgaaggactgctgtgcagatggaccagtgacagcgagctcgctt（seqidno.13所示）

splanttalens-13ttcgaggtccgtgttcctgaacagcgtgatgcactgcacttgccactgtcttggagggtc（seqidno.14所示）

splanttalens-14ggtcaggaagaccaccaccgatcctggtacgtggacgtttgaccctccaagacagtggca（seqidno.15所示）

splanttalens-15cggtggtggtcttcctgaccctggtactccaatcgctgctgacctggctgcatcctctac（seqidno.16所示）

splanttalens-16ctcttccagttcggacttgaccagctgggatctgatgacggtagaggatgcagccaggtc（seqidno.17所示）

splanttalens-17tcaagtccgaactggaagagaagaagtccgaactgagacacaagctgaagtatgtcccac（seqidno.18所示）

splanttalens-18gtggagtttctggcgatctcaatcagttcaatgtactcatgtgggacatacttcagcttg（seqidno.19所示）

splanttalens-19gagatcgccagaaactccactcaggacagaatcctggagatgaaggtcatggagttcttc（seqidno.20所示）

splanttalens-20aaccacccaggtgtttaccacgataaccgtagaccttcatgaagaactccatgaccttca（seqidno.21所示）

splanttalens-21tggtaaacacctgggtggttccaggaaacctgacggtgccatctacactgtcggttctcc（seqidno.21所示）

splanttalens-22agagtaagccttggtgtcaacgatgacaccgtagtcgattggagaaccgacagtgtagat（seqidno.23所示）

splanttalens-23ttgacaccaaggcttactctggtggttacaacctgccaatcggtcaagcagacgaaatgc（seqidno.24所示）

splanttalens-24atgtgcttgtttctggtttggttctcttcgacgtatctctgcatttcgtctgcttgaccg（seqidno.25所示）

splanttalens-25caaaccagaaacaagcacatcaaccctaacgaatggtggaaagtctatccatcctccgtc（seqidno.26所示）

splanttalens-26ccttgaagtgaccagagacgaacaggaacttgaactcggtgacggaggatggatagactt（seqidno.27所示）

splanttalens-27cgtctctggtcacttcaagggaaactacaaagctcagctgaccagactgaaccacatcac（seqidno.28所示）

splanttalens-28caacagctcttcgacagacaggacagcaccgttgcagttggtgatgtggttcagtctggt（seqidno.29所示）

splanttalens-29tgtctgtcgaagagctgttgattggtggagagatgatcaaagctggtactctgacccttg（seqidno.30所示）

splanttalens-30aagttgatctcaccgttgttgaacttccttctgacttcctcaagggtcagagtaccagct（seqidno.31所示）

splanttalens-31ttagaagttgatctcaccgttgtt（seqidno.32所示）

利用pcr合成talens的精简骨架编码序列，在100µl反应体系中，tn11a-2-tn11a-30共29个引物的添加量为2ng，外侧引物tn11a-1和tn11a-31添加量为50ng，扩增条件为：94℃预热1min；94℃,30s,50℃,30s,72℃,2min，使用的taqdna聚合酶为kodfxtaq酶（toyobo公司，日本），共25个循环。pcr产物进行1%琼脂糖胶回收，取10µl直接与平端克隆载体相连（大连宝生物公司）。4℃连接过夜，高效转化dh5α感受态中，获得阳性克隆。

实施例2：植物基因talens的精简骨架植物表达元件化学构建

植物talens的精简骨架splanttalens的启动子为camv35s+omega[omega为来自tmv病毒的翻译增强子]、终止子为nos，在foki切割结构域的n端附加了talen需要的n端和c末端序列（包括n端163个氨基酸的序列及c末端的63aa骨架），n端和c末端序列之间引入了两端分别带有bamhi和saci限制性内切酶切点的小片段dna序列，用于插入以上构建的靶位点结合功能模块。splanttalens的两端分别带有ecori和hindiii切点，便于植物表达单元的克隆和鉴定

从常规载体中pcr扩增camv35s+omega和nos终止子，然后通过重叠延伸pcr将启动子、talens的精简骨架和nos终止子无缝连接。引物分别为：

35sz：gaattcatcttcgtcaacatggtg（seqidno.33所示）

35sf：gagtacgagaacggattgggtccatggtaattgtaaatagtaattgtaatgttg（seqidno.34所示）

splanttalensz：caacattacaattactatttacaattaccatggacccaatccgttctcgtactc（seqidno.35所示）

splanttalensf：ctttattgccaaatgtttgaacgttagaagttgatctcaccgttgttg（seqidno.36所示）

nosz：caacaacggtgagatcaacttctaacgttcaaacatttggcaataaag（seqidno.37所示）

nosf：aagcttggtgatcccaccgtgtcgag（seqidno.38所示）

利用pcr分别扩增camv35s+omega、talens的精简骨架编码序列、nos终止子，在100µl反应体系中，camv35s+omega扩增引物为35sz和35sf，talens的精简骨架编码序列扩增引物为splanttalensz和splanttalensf，nos终止子扩增引物为nosz和nosf。pcr产物进行8%丙烯酰胺胶回收，将回收片段按等摩尔混合，加入引物35sz和nosf进行片段拼接，pcr扩增条件为：94℃预热1min；94℃,30s,50℃,30s,72℃,2min，使用的taqdna聚合酶为kodfxtaq酶（toyobo公司，日本），共25个循环。

实施例3：植物基因talens的精简骨架用于植物基因剪切

八氢番茄红素脱氢酶（phytoenedesaturase，pds）是类胡萝卜素合成途径中的关键酶，pds基因功能的失活会导致类胡萝卜素不能有效合成，叶绿素在光照条件下会被破坏，使本应呈绿色的组织变成白色，即出现光漂白现象，这为基因功能缺失提供一个肉眼可见的明显表型变化。

为了验证talens的精简骨架在植物基因剪切中的应用效果。本研究根据水稻ospds1基因的基因组dna序列和拟南芥atpds1基因的基因组dna序列选择靶位点15个碱基，通过和水稻基因组的blast分析保证靶位点在水稻基因组中的唯一性。按照ng识别碱基t，hd识别碱基c，ni识别碱基a，nn识别碱基g和a，设计及合成pds特异dna序列的tale的重复模块，通过bamhi和saci插入talens的精简骨架的n端和c端，构建pds基因的talens剪切载体sfok1ii[tnospds]和sfok1ii[tnatpds]。

实施例4：水稻和拟南芥转化

所用菌株为根癌农杆菌。质粒经电击法导人农杆菌中。挑取单菌到25mlyeb培养基（50mg/l利福平）培养过夜，取5ml菌液转接到100mlyeb培养基（50mg/l利福平），培养至od600=0.7-0.8，菌液冰上放置10分钟，5000rpm离心10min，4℃，收集菌体，加入100ml无菌双蒸水清洗两次。加入4ml10%甘油悬浮菌体，转到50ml离心管。5500rpm离心10min，4℃。收集菌体，加入500µl10%甘油悬浮菌体，转到1.5ml离心管。取70µl感受态细胞，加入1µl重组质粒sfok1ii[tnospds]。用去头的黄枪头混匀，转到0.1cm电击杯中。电击参数：200ω，1.7kv，2.5f，电击后立即加入800µlsoc培养液。培养1小时后，取100µl涂抗性板筛选转化子，28℃培养。

n6培养基为基本培养基，去壳的种子，授粉后12-15天的幼胚，经表面消毒后接种到n6d2培养基中诱导愈伤组织（n6培养基，水解乳蛋白500mg/l，蔗糖30g/l,2,4-d2mg/l,植物凝胶2.5g/l,ph5.8）；培养4-7天后取愈伤组织进行转化。农杆菌培养od0.8-1.0后离心5000g离心8分钟，ddh2o清洗一次，等体积ms培养液悬浮侵染8分钟后，吸干放置在ms+naa1mg/l+ba2mg/l的培养基中，22度共培养3天。然后转入筛选培养基（加入头孢cb(500ug/ml)和潮霉素hat(50ug/ml)，转化后的愈伤在含有和的抗性培养基上培养3-4代，转入分化培养基中（2mg/lkt）；幼芽长至2mm转移到生根培养基（1/2ms+0．5mg/liba）。以上培养基中分别加入500mg/l酶水解乳蛋白(ch)，0-700mg/l谷氨酰胺或精氨酸，蔗糖30-80g/l，琼脂6g，ph5．8。继代周期为25d。将淡黄色的胚性愈伤组织转入分化培养基中，30d左右分化出芽。光照强度1500-2000lx，12-14h/d。

将转基因水稻种植到田间，收取种子，种子用含潮霉素hat（50ug/ml）的ms培养基筛选，筛选抗性水稻苗进行分子检测，提取叶片总dna，参照《分子克隆》的方法，以潮霉素抗性基因hpt设计专有引物对转基因植株进行pcr检测，扩增条件为：94℃预热1min；94℃,30s,60℃,30s,72℃,4min。共25个循环。从分子水平上证明目的基因是否导入。

拟南芥转化采用蘸花法。含目的基因质粒sfok1ii[tnatpds]的农杆菌菌株单菌落接菌在5毫升含对应抗生素的lb培养基中28℃培养2天。将5毫升菌液转到500毫升的液体lb培养基中28℃培养16-24小时（od=1.5-2.0）。室温下离心收集菌体，4000g离心10分钟。用等体积5%的新鲜蔗糖溶液悬浮。加入0.02%的silwet-77混匀后转移到烧杯中。每个菌株用300毫升转化，转2-3钵。隔7天后再转化1次。将拟南芥倒置后浸入菌液中10秒钟。莲座和花序都要侵染。侵染后将转化植株菌液空干3-5秒。用保鲜膜将转化植株圈好，平放16-24小时。转化后不要放置在高温和强光下。揭开保鲜膜，保持一定湿度，再生长1个月后收种子。

序列表

<110>上海市农业科学院

<120>一种用于植物基因定点剪切的tale核酸酶精简骨架构建

<130>2019

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cttgacacctcccttcttgactcgatgcctgctgttggcactccacatactgctgctgct300

cctgctgaatgggatgaggtccagtctggtctgcgtgctgctgatgatccaccaccaacc360

gttcgtgttgctgtcactgctgcacgtccaccacgtgccaagcctgctggatccctggaa420

cactccttgtttgttgtgtcaagcgagctcgctgtcactggtccatctgcacagcagtcc480

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