用于体液细菌与细胞分离的芯片、制作方法及其使用方法与流程

本发明涉及生命科学技术领域，尤其涉及一种用于体液细菌与细胞分离的芯片、制作方法及其使用方法。

背景技术：

近几十年来，微流控技术在分析化学、生物检测、临床医疗等应用领域发展迅速，并且取代了部分传统的应用方法。譬如，传统的细胞分析和分选一般是利用流式细胞术，此技术速度快、精度高、准确性好，但是需要复杂、昂贵的设备，检测周期长，只适合应用于大型医院和实验室。

微流控利用集成化、微型化的微流控芯片，只需要少量的样品，即可在短时间内快速地对样品进行检测、分析。相比于传统的方法，整个过程更加快速高效并且绿色环保。

目前，在用于细胞分离的微流控技术中，根据分离机理的不同，可将各种细胞分离方法分为主动式和被动式分离。其中，主动式的细胞分离方法是通过对不同细胞本身所带的特征信号进行采集，然后借助外场力对细胞进行驱动分离，这样就不可避免的对细胞活性、生物学形状和功能产生影响。

技术实现要素：

(一)要解决的技术问题

本发明实施例提供一种用于体液细菌与细胞分离的芯片、制作方法及其使用方法，用以解决现有技术中主动式细胞分离方法对细胞活性、生物学形状和功能产生不良影响的问题。

(二)技术方案

为了解决上述技术问题，本发明实施例提供一种用于体液细菌与细胞分离的芯片，包括：上板、下板以及微孔膜，所述下板、所述微孔膜以及所述上板由下至上依次叠放，所述下板设有进液通道，所述上板设有收集通道，所述进液通道与所述收集通道通过所述微孔膜连接，所述微孔膜中微孔孔径的取值范围为4-7μm。

其中，所述进液通道包括第一流道和在所述第一流道上布置的多个第一突腔结构，且在所述进液通道的端部设置有第一进液口和第一出液口；所述收集通道包括第二流道和在所述第二流道上布置的多个第二突腔结构，且在所述收集通道的端部设置有第二出液口和第二进液口，且所述第一突腔结构与所述第二突腔结构对齐设置。

其中，所述第一突腔结构的横截面宽度是所述第一流道横截面宽的1.5-3倍，所述第二突腔结构的横截面宽度是所述第二流道横截面宽度的1.5-3倍。

其中，所述第一突腔结构的底面向上倾斜30°-60°，且所述第一突腔结构的底面向上抬升的垂直高度的取值范围为所述第一流道高度20％-80％之间。

其中，所述第一流道的总长度相等或者小于与所述第一突腔结构的总长度，所述第二流道的总长度相等或者小于所述第二突腔结构的总长度。

其中，所述第一突腔结构的形状为圆形或六边形，所述第二突腔结构的形状为圆形或六边形。

其中，所述进液通道和所述收集通道的长度均为3-5cm，宽度均为0.5-1.5mm，深度均为0.25-0.75mm。

其中，所述上板和下板由环烯烃共聚物或聚苯乙烯制成，所述微孔膜由聚对苯二甲酸乙二酯制成。

本发明还公开一种如本发明的用于体液细菌与细胞分离的芯片的制作方法，包括：

制备模具，分别将上板和下板注塑成型，并同微孔膜用等离子处理10-60秒；

将聚酯薄膜放置于上板和下板之间，加热或粘贴，并压制封装。

本发明还公开一种如本发明的用于体液细菌与细胞分离的芯片的使用方法，包括：

从进液通道通入体液，从收集通道逆向通入磷酸缓冲盐溶液，两液流相对流动，从收集通道收集并离心富集微生物。

(三)有益效果

本发明实施例提供的一种用于体液细菌与细胞分离的芯片、制作方法及其使用方法，从下板的进液通道通入痰液或其他体液等，从上板的收集通道逆向通入磷酸缓冲盐溶液(pbs缓冲液)，两液流相对流动，形成非对称液流，促进细菌可以通过微孔膜而被收集，而细胞则不能通过，这样在收集通道可以收集到细菌，而细胞则停留在进液通道内，实现细菌和细胞两者的被动式分离，这种分离方式不会对细胞活性、生物学形状和功能产生不良影响。

附图说明

图1为本发明一种用于体液细菌与细胞分离的芯片的进液通道的俯视图；

图2为本发明一种用于体液细菌与细胞分离的芯片的收集通道的俯视图；

图3为本发明一种用于体液细菌与细胞分离的芯片的结构示意图；

图4为本发明进液通道的侧面剖视图。

图中：1、上板；2、下板；3、微孔膜；4、进液通道；41、第一流道；42、第一突腔结构；5、收集通道；51、第二流道；52、第二突腔结构；6、腔体。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

如图1-图3所示，本发明公开一种用于体液细菌与细胞分离的芯片，包括：上板1、下板2以及微孔膜3，所述下板2、所述微孔膜3以及所述上板1由下至上依次叠放，所述下板2设有进液通道4，所述上板1设有收集通道5，所述进液通道4与所述收集通道5通过所述微孔膜3连接，所述微孔膜3中微孔孔径的取值范围为4-7(优选为6μm)，保证细菌能够通过微孔膜3，而细胞则不能通过。

具体地，本发明上板1和下板2可以热压或胶粘方式与微孔膜结合，制成耐一定压力、稳定不漏液的芯片。从下板2的进液通道4通入待分离体液，从上板1的收集通道5逆向通入磷酸缓冲盐溶液(pbs缓冲液)，两液流相对流动，形成非对称液流，促进细菌可以通过微孔膜而被收集，而细胞则不能通过，这样在收集通道5可以收集到细菌，而细胞则停留在进液通道4内，实现细菌和细胞两者的被动式分离，这种分离方式不会对细胞活性、生物学形状和功能产生不良影响。

如图1和图2所示，所述进液通道4包括第一流道41和在所述第一流道41上布置的多个第一突腔结构42，且在所述进液通道4的端部设置有第一进液口和第一出液口；所述收集通道5包括第二流道51和在所述第二流道51上布置的多个第二突腔结构52，且在所述收集通道5的端部设置有第二出液口和第二进液口，且所述第一突腔结构51与所述第二突腔结构52对齐设置。具体的，本实施例中根据芯片的实际需求，在进液通道4设置1个第一进液口，1个第一出液口，收集通道5设置1个第二出液口，1个第二进液口，在进行分离作业时，需保证体液从同一侧的第一进液口进入，并从同一侧的第二出液口排出。进液通道4由第一流道41和第一突腔结构42两者交替布置，可以理解为第一突腔结构42将第一流道41隔开，优选地，相邻的第一突腔结构42之间的间距相同，两个第一突腔结构42以及夹在中间的第一流道41构成类似“工”字型结构(从俯视图角度观察)。同理，第二流道51、第二突腔结构52与第一流道41、第一突腔结构42的布置形式相同，保证第一突腔结构42和第二突腔结构52对齐设置，即第一突腔结构42的正上方有且对应只有一个第二突腔结构52。

其中，所述第一突腔结构42的形状为圆形或六边形，所述第二突腔结构52的形状为圆形或六边形。根据实际需要，也可以将第一突腔结构42和第二突腔结构52做成其他形状，例如正方形的那个。

其中，所述第一突腔结构42的横截面宽度是所述第一流道41横截面宽的1.5-3倍，所述第二突腔结构52的横截面宽度是所述第二流道51横截面宽度的1.5-3倍。优选地，所述第一突腔结构42的横截面宽度是所述第一流道41横截面宽的2倍，所述第二突腔结构52的横截面宽度是所述第二流道51横截面宽度的2倍。

其中，所述进液通道41和所述收集通道51的长度均为3-5cm，宽度均为0.5-1.5mm，深度均为0.25-0.75mm。

如图4所示，所述第一突腔结构42的底面向上倾斜30°-60°，且所述第一突腔结构42的底面向上抬升的垂直高度的取值范围为所述第一流道41高度20％-80％之间。优选倾斜角度可为60°，这样底面的向上倾斜，构成升流平台结构，对液体具有一定的扰动作用，产生较大的液流阻力，且在第一突腔结构42处具有较大的流速突变，使得进液通道内的液体内微孔膜产生更大的压力，促进小于微孔膜3孔径的细菌通过。在实际实验中，体液大部分在临近第一进液口端进行分离，若一个位置的微孔膜产生堵塞，体液在堵塞处前面进行交换。具体地，本实施例第一突腔结构42为斜向上设置，从收集通道5通入pbs缓冲液，以在通液时形成非对称液流和压力差，促进小于微孔膜孔径的颗粒通过中间微孔膜3，进入收集通道5从而实现分离。

其中，所述第一流道41的总长度相等或小于所述第一突腔结构42的总长度为相等，所述第二流道51的总长度相等或小于所述第二突腔结构52的总长度相等。优选地，由于第一流道41和第一突腔结构42为交替设置，本例中多个第一流道41的长度求和与多个第一突腔结构42的长度求和相等；同理，第二流道51和第二突腔结构52也同样设置。

其中，所述上板1和下板2由环烯烃共聚物(简称：coc)或聚苯乙烯(简称：ps)制成，所述微孔膜3由聚对苯二甲酸乙二酯(简称：pet)制成。具体地，根据实际需要，可以采用其他材料制成上板1、下板2以及微孔膜3。

实施例：

本实施例中公开一种优选芯片尺寸方案：本实施例中上板1和下板2的长度为4cm。进液通道4和收集通道5的通道宽度为1mm，深度为0.5mm，在进液通道4和收集通道5的流道上间隔设置多个腔体6，且腔体6的宽度为2mm，具有圆角设计，腔体6的总长度与通道的总长度为1:1。第一突腔结构42由其第一流道41向上倾斜60°，且第一突腔结构42向上抬升的垂直高度为0.2mm。本实施例的芯片以痰液为实验对象，经2μm和9μm荧光微球分离结果显示，50％以上2μm荧光微球被富集，而9μm荧光微球则完全被去除。痰液微生物富集二代测序检测结果表明，细菌dnareads数占有率从2％提高到16％。

本发明还公开一种如本发明的用于体液细菌与细胞分离的芯片的制作方法，包括：

制备模具，分别将上板和下板注塑成型，并同微孔膜(可采用聚对苯二甲酸乙二酯，简称：pet膜)用等离子处理10-60秒；

将聚酯薄膜放置于上板和下板之间，加热或粘贴，并压制封装。

具体地，将耐高温聚酯薄膜放置于上板和下板之间，对齐，以137℃的温度加热，并用6公斤的压力压封13分钟，热压封装。

本发明还公开一种如本发明的用于体液细菌与细胞分离的芯片的使用方法，包括：

从进液通道通入体液，从收集通道逆向通入缓冲盐溶液，两液流相对流动，从收集通道收集并离心富集微生物。其中，缓冲盐溶液可选用磷酸缓冲盐溶液(简称：pbs缓冲液)。富集微生物需要提取dna、rt-pcr鉴定以及二代dna测序鉴定细菌富集率。

具体的，离心转速为12000rmp。利用本芯片采用的分离方法，rt-pcr细菌dna占比提高倍数达到8倍，二代dna测序细菌dna占比提高倍数达到10倍。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。