干扰物对荧光定量PCR检测HBVDNA的干扰评价方法与流程

本发明属于临床检验方法学评价领域，涉及干扰物对荧光定量pcr检测hbvdna的干扰评价方法。

背景技术：

分析干扰是指在测定某分析物的浓度或活性时，受另一非分析物影响而导致测定结果增高(正干扰)或降低(负干扰)，是引起患者检测结果与真值之间偏离的主要原因之一。按照iso15189:2012要求和cnas-cl36:2012《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》，定量检测方法和程序的分析性能验证应包括抗干扰能力。因此临床基因扩增实验室需要对分子诊断定量检测方法进行分析干扰评价，对存在的干扰物质分析其浓度和干扰程度之间的关系，确定和量化干扰效应，为临床医生提供明确的干扰所致的检测结果误差。根据我国《乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸定量检测试剂注册技术审查指导原则》要求必须验证的干扰物质有甘油三酯、胆红素、血红蛋白和igg，本技术以评价干扰物对hbvdna的检测为例，提供一种用于临床分子诊断定量检测程序分析干扰评价的实验新方法。

美国临床和实验室标准化协会(clsi)ep7-a2文件是目前分析干扰评价实验的规范标准，其采用配对差异、剂量效应和利用病人标本作偏倚分析三种实验方案，但都存在局限性：

1)前两种方案采用的干扰物为添加的外源性干扰物，因此实验样本基质不代表典型有问题的临床样本；

2)第三种方案选择真实的特定病人标本以减少基质效应，但只能证明偏倚和估计的干扰物某水平的相关性，不能直接证明干扰物与分析物的因果关系；

3)采用第三种方案需与参考方法或比较方法做比对，但某些定量检测项目无公认参考方法，比较方法特异性又较差；

4)第三种方案需要收集较多样本数，如标本不新鲜，一些不稳定组分可能丢失。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种干扰物对荧光定量pcr检测hbvdna的干扰评价方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

干扰物对荧光定量pcr检测hbvdna的干扰评价方法，包括配对差异实验和剂量效应实验两部分，所述干扰物包括甘油三酯、胆红素、血红蛋白和总igg，其特征在于，配对差异实验的具体方法是：先配制含hbvdna、干扰物浓度在标示抗干扰浓度的测试样本ⅰ，配制与测试样本ⅰ含hbvdna浓度一致、不含干扰物或所含干扰物浓度很低的对照样本，然后利用荧光定量pcr技术进行检测，计算测试样本ⅰ和对照样本的测量均值的差值，倘若差值的绝对值≤最大允许干扰值，则判定为符合标示，否则判定为不符合，即存在干扰物质，继续进行剂量效应实验；剂量效应实验的具体方法是：配制含hbvdna、干扰物的测试样本ⅱ，采用荧光定量pcr技术对测试样本ⅱ进行检测，所得数据经统计学分析以确定干扰物浓度与干扰程度之间的关系。

优选的，所述的测试样本ⅰ、对照样本、测试样本ⅱ的hbvdna分析浓度均包括两个水平：hbvdna分析浓度分别为10³iu/ml和10⁶iu/ml；测试样本ⅰ中所含干扰物的浓度为：甘油三酯34.0mmol/l，或总胆红素476.0μmol/l，或血红蛋白2g/dl，或总igg40g/l；对照样本中所含干扰物的浓度为：甘油三酯＜1mmol/l，或总胆红素＜6μmol/l，或总igg≤12g/l，或不含血红蛋白；测试样本ⅱ为5个系列浓度的总igg干扰效应测试样本，其浓度分别为12.0g/l、21.0g/l、30.0g/l、39.0g/l和48.0g/l。

进一步优选的，在进行配对差异实验时，分别计算两个浓度水平测试样本ⅰ和对照样本的测量均值的差值，并进行是否存在干扰物质的判断。

干扰物对荧光定量pcr检测hbvdna的干扰评价方法，包括：

步骤一、配对差异实验

(一)配制样本：

(1)样本：

①低浓度(10³iu/ml)样本：测试样本：hbvdna分析浓度为10³iu/ml，干扰物浓度为标示抗干扰浓度；对照样本：hbvdna分析浓度同测试样本，不含干扰物或所含干扰物浓度与测试样本相比可忽略不计；

②高浓度(10⁶iu/ml)样本：测试样本：hbvdna分析浓度为10⁶iu/ml，干扰物浓度为标示抗干扰浓度；对照样本：hbvdna分析浓度同测试样本，不含干扰物或所含干扰物浓度与测试样本相比可忽略不计；

(2)配制方法：

①低浓度(10³iu/ml)样本配制：取hbvdna浓度为10⁵iu/ml、不含干扰物或所含干扰物浓度很低的血清样本(即甘油三酯＜1mmol/l，或总胆红素＜6μmol/l，或总igg≤12g/l，或不含血红蛋白的血清样本)，以及干扰物浓度在标示抗干扰浓度、hbvdna阴性的血清样本，按体积比1：100配制，由于稀释比例较大，前者对后者血清中干扰物浓度的影响可以忽略不计，即制备成hbvdna分析浓度在10³iu/ml、干扰物浓度在标示抗干扰浓度的测试样本；对照样本取hbvdna浓度为10⁵iu/ml、不含干扰物或所含干扰物浓度很低的血清样本(即甘油三酯＜1mmol/l，或总胆红素＜6μmol/l，或总igg≤12g/l，或不含血红蛋白的血清样本)，以及不含干扰物或所含干扰物浓度很低、hbvdna阴性的血清样本(即甘油三酯＜1mmol/l，或总胆红素＜6μmol/l，或总igg≤12g/l，或不含血红蛋白的血清样本)，按同样比例配制；

②高浓度(10⁶iu/ml)样本配制：取hbvdna浓度为10⁸iu/ml、不含干扰物或所含干扰物浓度很低的血清样本(即甘油三酯＜1mmol/l，或总胆红素＜6μmol/l，或总igg≤12g/l，或不含血红蛋白的血清样本)，其余同低浓度样本配制；

(二)测定流程：采用荧光定量pcr法(按湖南圣湘生物科技有限公司hbvdna检测试剂盒说明书进行操作)在同一批内对测试样本和对照样本进行检测，每个样本需重复测定取均值；计算各浓度水平测试样本和对照样本的测量均值的差值，倘若差值的绝对值≤最大允许干扰值，则判定为符合标示，否则判定为不符合，即为存在干扰物质，进一步行剂量效应实验；

步骤二、剂量效应实验

(一)配制样本：选取高于标示抗干扰浓度的病理血清样本作为高浓度干扰物样本，正常血清样本作为低浓度干扰物样本，高、低浓度干扰物样本的hbvdna均为阴性，将高、低浓度干扰物样本混合制备成5个系列浓度的干扰样本；再取含10⁵iu/mlhbvdna、不含干扰物或所含干扰物浓度很低的血清样本(即甘油三酯＜1mmol/l，或总胆红素＜6μmol/l，或总igg≤12g/l，或不含血红蛋白的血清样本)分别与各浓度梯度的干扰样本混合制备成hbvdna分析浓度为10³iu/ml的测试样本，配制方法同配对差异实验；hbvdna分析浓度为10⁶iu/ml的测试样本则取含10⁸iu/mlhbvdna、不含干扰物或所含干扰物浓度很低的血清样本(即甘油三酯＜1mmol/l，或总胆红素＜6μmol/l，或总igg≤12g/l，或不含血红蛋白的血清样本)的血清样本进行配制，配制方法同10³iu/ml的测试样本；

(二)测定流程：采用荧光定量pcr法(按湖南圣湘生物科技有限公司hbvdna检测试剂盒说明书进行操作)对所有测试样本在同一批内进行检测，每个样本需重复测定取均值，数据经统计学分析以确定干扰物浓度与干扰程度之间的关系。

优选的，步骤一中测定流程的具体方法是：首先确定样本的重复测量次数，取hbvdna分析浓度分别在10³和10⁶iu/ml的2个浓度水平的临床样本，每个测试样本重复测定20次，得到均值和批内标准差s，分别计算2个浓度水平的dmax/s，dmax为最大允许干扰值(0.4log值)，查ep7-a2文件附表得出两个浓度水平的重复次数n；按照重复次数对测试样本ⅰ和对照样本进行同批检测；计算测试样本ⅰ和对照样本的测量均值，得到两者的差值，倘若差值的绝对值≤dmax，则判定为符合标示，否则判定为不符合。

优选的，步骤二的具体方法是：

(a)选取高于标示抗干扰浓度(总igg≤40g/l对检测结果无影响)的病理血清样本(igg浓度为48g/l)作为高浓度干扰物样本(h)，正常血清样本(igg浓度为12g/l)作为低浓度干扰物样本(l)，两个样本经检测hbvdna均为阴性后，制备成4l、3l+1h、2l+2h、1l+3h、4h这5个系列浓度的干扰样本(例：4l代表4个低浓度样本)，取含hbvdna浓度分别为10⁵iu/ml和10⁸iu/ml的血清和上述各个浓度水平的干扰样本按照体积比1：100混合，得到hbvdna分析浓度分别为10³iu/ml和10⁶iu/ml2个水平的剂量效应测试样本；

(b)每个样本重复测量3次，在一个分析批内完成检测；

(c)数据分析：计算低浓度水平4l标本的测量均值，各浓度水平的测定结果减去低浓度标本的均值为干扰效应；以干扰物浓度为x轴，以干扰效应为y轴，绘制剂量-干扰效应回归分析图，如呈线性效应，采用线性回归分析；如呈非线性效应，则采用非线性回归分析拟合回归方程计算给定干扰物浓度的干扰程度；

(d)统计学分析：采用microsoftexcel2010、spss22.0软件对数据进行统计学分析，计量数据以表示，p<0.05为差异有统计学意义。

优选的，所述的标示抗干扰浓度为厂家声明，厂家声明：甘油三酯≤34.0mmol/l，总胆红素≤476.0μmol/l，血红蛋白≤2g/dl，总igg≤40g/l对检测结果无影响。

本发明的有益效果在于：

1、本发明直接选择高甘油三酯、高胆红素、高血红蛋白和高igg等特定病人的真实标本进行配对差异和剂量效应实验，解决了实验样本的基质效应问题；

2、可直接评价干扰物浓度和干扰程度之间的关系，证明干扰物与分析物的因果关系；

3、无需再与参考方法或比较方法进行比较；

4、较少的样本数量即可达到统计学要求的检验水准。

因此，本发明为临床分子诊断定量检测程序的分析干扰评价提供了一种新的简单、有效、实用的方法学。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为总igg对10³iu/ml浓度hbvdna检测的干扰效应；

图2为总igg对10⁶iu/ml浓度hbvdna检测的干扰效应。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例：

1、配对差异实验

验证干扰物是否对荧光定量pcr法测定hbvdna存在干扰。

1.1样本

收集甘油三酯、总胆红素、血红蛋白和总igg与hbvdna检测试剂厂家声明的抗干扰浓度接近或相同的hbvdna阴性血清作为干扰物，制备hbvdna分析浓度分别在10³和10⁶iu/ml的高低2个水平血清样本作为测试样本。厂家声明甘油三酯≤34.0mmol/l、总胆红素≤476.0μmol/l、血红蛋白≤2g/dl和总igg≤40g/l对检测结果无影响。制备方法：以干扰物(甘油三酯)为例，取hbvdna浓度为10⁵iu/ml、甘油三酯浓度较低(<1mmol/l)的血清和甘油三酯浓度接近厂家声明的抗干扰浓度(32.67mmol/l)、hbvdna阴性的血清，按1:100比例配制(由于前者含甘油三酯较低，且稀释比例较大，对后者样本中甘油三酯浓度的影响可忽略不计)，即获得甘油三酯为32.67mmol/l、hbvdna分析浓度在10³iu/ml的测试样本；hbvdna分析浓度为10⁶iu/ml水平的测试样本则选取hbvdna浓度为10⁸iu/ml、甘油三酯<1mmol/l的血清以相同方法配制。其余干扰物测试样本配制同甘油三酯。对照样本按同样方法配制为hbvdna分析浓度相同的血清，但仅含少量甘油三酯(<1mmol/l)、少量总胆红素(<6μmol/l)，以及不含血红蛋白。由于总igg干扰样本浓度较低(40g/l)，而正常血清中igg平均浓度水平在10g/l左右，故对照样本选取12g/l的总igg正常标本，即40g/l左右的干扰样本与12g/l的对照样本进行比较。

1.2测定流程

确定样本的重复次数，取hbvdna分析浓度分别在10³和10⁶iu/ml的2个血清样本，每个样本重复测定20次，得到均值和批内标准差(s)。最大允许干扰值(dmax)为卫生部临检中心室间质评评价界限0.4(log值)，分别计算2个浓度水平的dmax/s，查ep7-a2文件附表得出两个浓度水平的重复次数(n)。测试样本和对照样本同批检测，按重复次数测定。样本检测前校准仪器，每天进行室内质量控制，质控在控时数据可接受。

1.3数据分析

取测试样本和对照样本的测量均值计算两者的差值，差值≤±0.4(log值)，符合厂家声明。

2剂量效应实验

对存在干扰的物质确定干扰物浓度与干扰程度之间的关系(干扰效应)。

2.1样本

高浓度干扰物样本(h)选取高于厂商声明的抗干扰浓度的病理血清样本，低浓度干扰物样本(l)选取浓度较低的正常血清样本，高、低浓度干扰物样本均检测hbvdna为阴性后制备成(4l，3l+1h，2l+2h，1l+3h，4h)5个系列浓度的干扰样本。取hbvdna浓度分别为10⁵和10⁸iu/ml的血清和各浓度梯度的干扰样本，配制hbvdna分析浓度分别在10³和10⁶iu/ml2个水平的测试样本，配制方法同配对差异实验。

2.2测定流程

每个样本重复测量3次，在一个分析批内完成检测。

2.3数据分析

计算低浓度水平(4l)标本的测量均值，各浓度水平的测定结果减去低浓度标本的均值为干扰效应。以干扰物浓度为x轴，以干扰效应为y轴，绘制剂量-效应回归分析图，如呈线性效应，采用线性回归分析；如呈非线性效应，则采用非线性回归分析拟合回归方程计算给定干扰物浓度的干扰程度。

3统计学分析

采用microsoftexcel2010、spss22.0软件对数据进行统计学分析。计量数据以表示，p<0.05为差异有统计学意义。

4结果

4.1样本的重复次数

hbvdna在10³iu/ml浓度水平，s为0.09iu/ml，dmax/s为4.62；在10⁶iu/ml浓度水平，s为0.05iu/ml，dmax/s为7.85，查附表两个浓度水平的样本重测次数(n)均为3。

4.2配对差异实验

结果见表1。32.67mmol/l的甘油三酯和2g/dl的血红蛋白对hbvdna检测无干扰，差值＜0.4(log值)，符合厂家声明。470.9umol/l的总胆红素对10³iu/ml浓度水平的hbvdna检测无干扰；在10⁶iu/ml水平处测试样本和对照样本差值为0.44(log值)，按四舍五入原则，符合厂家声明。40g/l的总igg对10³iu/ml浓度水平的hbvdna检测有负干扰，需进一步利用剂量效应实验测定干扰效应。

表1.干扰物对hbvdna检测的配对差异实验结果(log值)

注：*表示有干扰

4.3剂量效应实验

总igg干扰效应测试样本的5个系列浓度分别为12.0g/l、21.0g/l、30.0g/l、39.0g/l和48.0g/l。总igg≤48.0g/l时，对hbvdna检测为非线性负干扰，剂量-干扰效应曲线见图1、图2。非线性方程分别为y＝1.6932-1.5093in(x)(r²＝0.92，p＝0.01)，y＝0.0461-0.0022x-0.0003x²(r²＝0.98，p＝0.02)。通过回归方程可估计不同浓度总igg对hbvdna检测的干扰程度。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。