黄酮合酶及其应用的制作方法

本发明涉及生物酶技术领域，特别涉及一种黄酮合酶，以及该黄酮合酶的应用。

背景技术：

黄酮类化合物是结构多样性高的重要植物天然化合物，目前已经分离到了9000多种不同结构的黄酮类化合物，按结构可以分为黄酮(flavones)、黄烷酮(flavanones)、异黄酮(isoflavone)、黄烷醇(flavanols)、黄酮醇(flavonols)和花青素(anthocyanidines)等不同类型。其中，黄酮是黄酮类化合物中最大的类型。黄酮不但对于植物的生理、生态和农业有广泛的用途，而且在癌症和心血管等疾病防治方面也显著的疗。例如，芹菜素(apigenin)是一种黄酮类化合物，分布于一些温热带的蔬菜和水果中，尤以芹菜中含量为高。芹菜素具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化等多种生物学活性，它的抗肿瘤活性非常优异，不但可抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤侵袭和转移而且可以提高化疗药物敏感性和抗氧化作用等(陈亭亭等，中国现代应用药学，2019年)。木犀草素(luteolin)也是一种存在于多种蔬菜和药用植物中的黄酮类化合物，具有包括抗肿瘤、抗氧化、抗炎、保护神经系统等在内的多种药物活性(王继双等，生命科学，2013)。白杨素(chrysin)又是一种具有广泛药理活性的黄酮类化合物，它即可从紫葳科植物木蝴蝶中提取，同时也是蜂胶的主要有效成分之一，具有抗肿瘤和防治心脑血管疾病等多种药理作用(姜金生等，中草药，2011年)。由于具有良好的药理活性使得黄酮在药物开发与设计方面也越来越受到重视(stefanmartens等，moleculesofinterest，2005年)。因此，如何大量制备这些黄酮化合物也受到了越来越多的关注。

黄酮的生物合成包括以下几个步骤，首先三个分子丙二酰辅酶a与一个分子对香豆酰基辅酶a或者一份子肉桂酰辅酶a或者一分子咖啡酰辅酶a等合成查尔酮衍生物，接着查尔酮衍生物转化为黄烷酮，最后黄烷酮在黄酮合酶(fns)的催化下生成黄酮。在黄酮的生物合成途径中，黄酮合酶是其中的限速酶。目前已经发现植物中存在两种完全不同的fns，其中一种是fnsi，它是一种可溶性双加氧酶，另外一种是fnsii，它是一种膜结合细胞色素p450酶。通过fns的催化作用可以将很多低成本的黄烷酮化合物转化为药用价值更高的黄酮化合物，例如将柚皮素转化为芹菜素，圣草素(eriodictyol)转化为木犀草素和松果间素(pinocembrin)转化为木犀草素。经过文献比较分析，大部分fnsi的催化效率要高于fnsii(effendileonard，appliedandenvironmentalmicrobiology，2005)，但是现有种类的fnsi转化效率仍不能满足要求生产、科研需求。

技术实现要素：

本技术公开的fnsi可实现包括芹菜素在内的多种黄酮化合物的转化和制备，且具有更优的催化效率。

本发明公开的黄酮合酶选自：

(a)氨基酸序列如seqidno:1或seqidno:2所示的多肽；或

(b)将seqidno:1或seqidno:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽；或

(c)与seqidno:1或seqidno:2氨基酸序列有至少85％(较佳地至少90％；更佳地至少95％)序列相同性，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽。

优选地，所述(c)还包括：由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。

本发明同时还公开了编码上述黄酮合酶的多核苷酸。优选地，该多核苷酸的序列如seqidno:3或seqidno:4所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，含有前述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，含有所述的载体或基因组中整合有所述的多核苷酸。所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞，常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等；所述的真菌细胞包括酵母细胞。

在本发明的另一方面，提供上述黄酮合酶的制备方法，其包括步骤：

1)在适合表达的条件下，培养所述宿主细胞；

2)从培养物中分离出黄酮合酶。

制得的黄酮合酶可应用于将黄烷酮化合物转化为黄酮化合物。具体是以α酮戊二酸为辅因子将黄烷酮化合物合成黄酮类植物的小分子代谢产物；例如，将柚皮素转化为芹菜素。

本发明公开的黄酮合酶具有优于现有种类的fnsi的转化效率，能够用于黄酮化合物细胞工厂的构建与优化。

附图说明

图1为黄酮合酶dcfns和agfns琼脂糖凝胶电泳图；

图2为黄酮合酶dcfns和agfns的westernblot图；

图3为黄酮合酶dcfns、agfns和pcfns催化柚皮素反应产物的hplc检测图；

图4为黄酮合酶dcfns、agfns和pcfns催化柚皮素效率比较图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

通过对多种植物的基因组和转录组数据进行数据挖掘分析，从中分别获得黄酮合酶的核苷酸候选序列dcfns(seqidno:3)和agfns(seqidno:4)。通过在大肠杆菌中表达该序列，制备含有该序列表达产物的粗酶液，以α酮戊二酸为辅因子，通过体外催化检测其对柚皮素的催化活性。本发明发现dcfns和agfns表达产物能够高效催化柚皮素合成具有高附加值和多种重要生理活性的芹菜素。

实施例1.黄酮合酶dcfns的克隆及其在大肠杆菌中表达

合成如序列表中seqidno:5和seqidno:6的两条引物，以从植物提取的rna反转录获得的cdna为模板，利用如上引物进行pcr。dna聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的koddna聚合酶。pcr扩增程序为：94℃2min；94℃15s，58℃30s，68℃2min，共35个循环；68℃10min降至10℃。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1。

在紫外下照射，切下目标dna条带。然后采用axygengelextractionkit(aeygen公司)从琼脂糖凝胶中回收dna即为扩增出的黄酮合酶基因的dna片段。利用宝生物工程(大连)有限公司(takara)的pmd18-t克隆试剂盒，将回收的pcr产物克隆到pmdt载体，所构建的载体命名为pmdt-dcfns。经测序获得dcfns的基因序列。

dcfns基因具有seqidno:3的核苷酸序列。自seqidno:3的5’端第1-1074位核苷酸为dcfns的开放阅读框(openreadingframe,orf)，自seqidno:3的5’端的第1-3位核苷酸为dcfns基因的起始密码子atg，自seqidno:3的5’端的第1072-1074位核苷酸为dcfns基因的终止密码子tag。黄酮合酶dcfns编码一个含有357个氨基酸的蛋白质dcfns，具有seqidno:1的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为40.3kda，等电点pi为5.73。

合成如序列表中seqidno:7和seqidno:8的两条引物，在合成的引物，两端分别加bamhi和xhoi两个酶切位点，以质粒pmdt-dcfns为模板进行pcr。pcr扩增程序同上。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收后的pcr产物利用vazyme公司的one-stepmutisclonekit连入经bamhi和xhoi双酶切的pet28a载体(invitrogen公司)中。所获得的重组质粒命名为pet28a-dcfns。

将重组质粒pet28a-dcfns及空载体pet28a转化大肠杆菌bl21(de3)中构建重组大肠杆菌bl21-pet28a-dcfns和bl21-pet28a。

分别接种bl21-pet28a-dcfns和bl21-pet28a到lb培养基中，37℃200rpm培养至od600约0.6-0.8，使菌液降温至4℃，加入终浓度为50μm的iptg，18℃，200rpm诱导表达15h。4℃离心收集菌体，加入裂解buffer(50mm磷酸盐缓冲液、1mmedta、1mmdtt，ph7.4)重悬菌体，超声破碎细胞，4℃12000g离心收集细胞裂解液上清，取样品进行sds-page电泳和westernblot分析，结果如附图2。

实施例2.黄酮合酶dcfns催化柚皮素反应

以实施例1获得的bl21-pet28a-dcfns和bl21-pet28a裂解液上清为粗酶液，配置如下反应体系(100μl)：

在30℃水浴下反应2h。反应结束后加入等体积的乙酸乙酯抽提，取上层乙酸乙酯相，经真空浓缩后，反应产物溶解于100μl甲醇中，结果用hplc检测，结果如附图3。

从图3中结果可以看出含有黄酮合酶dcfns的大肠杆菌粗酶液bl21-pet28a-dcfns可以催化柚皮素形成一种新的产物其在hplc的保留时间与芹菜素标准品一致，而对照组含有空载体pet28a的大肠杆菌粗酶液bl21-pet28a催化柚皮素则没有该产物生成。结果表明，本发明中发现的黄酮合酶dcfns能催化黄烷酮类化合物柚皮素的c3位脱氢反应合成芹菜素。

实施例3.黄酮合酶agfns的克隆及其在大肠杆菌中表达

合成如序列表中seqidno:9和seqidno:10的两条引物，以从植物提取的rna反转录获得的cdna为模板，利用如上引物进行pcr。dna聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的koddna聚合酶。pcr扩增程序为：94℃2min；94℃15s，58℃30s，68℃2min，共35个循环；68℃10min降至10℃。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1。

在紫外下照射，切下目标dna条带。然后采用axygengelextractionkit(aeygen公司)从琼脂糖凝胶中回收dna即为扩增出的黄酮合酶基因的dna片段。利用宝生物工程(大连)有限公司(takara)的pmd18-t克隆试剂盒，将回收的pcr产物克隆到pmdt载体，所构建的载体命名为pmdt-agfns。经测序获得agfns的基因序列。

agfns基因具有seqidno:4的核苷酸序列。自seqidno:4的5’端第1-1068位核苷酸为agfns的开放阅读框，自seqidno:4的5’端的第1-3位核苷酸为agfns基因的起始密码子atg，自seqidno:4的5’端的第1066-1068位核苷酸为agfns基因的终止密码子tga。黄酮合酶agfns编码一个含有355个氨基酸的蛋白质agfns，具有seqidno:1的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为40.0kda，等电点pi为6.2。

合成如序列表中seqidno:11和seqidno:12的两条引物，在合成的引物，两端分别加bamhi和xhoi两个酶切位点，以质粒pmdt-agfns为模板进行pcr。pcr扩增程序同上。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收后的pcr产物利用vazyme公司的one-stepmutisclonekit连入经bamhi和xhoi双酶切的pet28a载体中。所获得的重组质粒命名为pet28a-agfns。

将重组质粒pet28a-agfns转化大肠杆菌bl21(de3)中构建重组大肠杆菌bl21-pet28a-agfns。

分别接种bl21-pet28a-agfns和bl21-pet28a(实施例1)到lb培养基中，37℃200rpm培养至od600约0.6-0.8，使菌液降温至4℃，加入终浓度为50μm的iptg，18℃，200rpm诱导表达15h。4℃离心收集菌体，加入裂解buffer(50mm磷酸盐缓冲液、1mmedta、1mmdtt，ph7.4)重悬菌体，超声破碎细胞，4℃12000g离心收集细胞裂解液上清，取样品进行sds-page电泳和westernblot分析，结果如附图2。

实施例4.黄酮合酶agfns催化柚皮素反应

以实施例1获得bl21-pet28a-agfns和bl21-pet28a裂解液上清为粗酶液，配置如下反应体系(100μl)：

在30℃水浴下反应2h。反应结束后加入等体积的乙酸乙酯抽提，取上层乙酸乙酯相，经真空浓缩后，反应产物溶解于100μl甲醇中，结果用hplc检测，结果如附图3。

从图3中结果可以看出含有黄酮合酶agfns的大肠杆菌粗酶液bl21-pet28a-agfns可以催化柚皮素形成一种新的产物其在hplc的保留时间与芹菜素标准品一致，而对照组含有空载体pet28a的大肠杆菌粗酶液bl21-pet28a催化柚皮素则没有该产物生成。结果表明，本发明中发现的黄酮合酶agfns能催化黄烷酮类化合物柚皮素的c3位脱氢反应合成芹菜素。

实施例5.黄酮合酶dcfns、agfns与pcfns催化柚皮素反应活性比较

pcfns是从植物欧兰芹(petroselinumcrispum)中克隆的一种黄酮合酶(参考文献martenss,forkmanng,maternu,etal.cloningofparsleyflavonesynthasei[j].phytochemistry,2001,58(1):43-46.)，根据许多文献报道黄酮合酶pcfns催化活性不仅强于已报道的ii型黄酮合酶，也优于众多其他i型黄酮合酶，是目前芹菜素等化合物细胞工厂研究中使用最为普遍的黄酮合酶。为将本发明获得的两个黄酮合酶agfns和dcfns与pcfns比较，通过基因合成获得了文献报道的pcfns核苷酸序列(ncbiaccessionno.：ay230247)，并按照实施例1、2策略通过大肠杆菌表达和体外催化比较了agfns和dcfns与pcfns催化柚皮素的效率。结果如图4所示，agfns和dcfns与pcfns催化柚皮素合成芹菜素的转化率分别为21.89％、30.6％和18.46％。结果表明agfns和dcfns催化效率显著高于pcfns，分别提高了18.6％和65.8％。

sequencelisting

<110>佛山市汇腾生物技术有限公司；中国科学院上海生命科学研究院

<120>黄酮合酶及其应用

<130>2019

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>357

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

metalaprothrthrilethralaleualalysglulysthrleuasn

151015

seraspphevalargaspgluaspgluargprolysvalalatyrasn

202530

glnpheserthrgluileproileileserleualaglyileaspasp

354045

aspserasnglyargargprogluvalcysarglysilevalgluala

505560

phegluasptrpglyilepheglnvalvalasphisglyileaspser

65707580

glyleuilealaglumetserargleuserarggluphephealaleu

859095

proalagluglulysleuargtyraspthrthrglyglylysarggly

100105110

glyphethrileserthrhisleuglnglyaspaspvallysasptrp

115120125

arggluphevalvaltyrphesertyrprovalaspalaargasptyr

130135140

serargtrpproasplysprogluglytrpargservalthrgluval

145150155160

tyrserglulysleumetalaleuglyalalysleuleugluvalleu

165170175

serglualametglyleuglulysglualaleuthrglualacysval

180185190

asnmetgluglnlysvalleuileasntyrtyrprothrcysprogln

195200205

proaspleuthrleuglyvalargarghisthraspproglythrile

210215220

thrileleuleuglnaspmetvalglyglyleuglnalathrargasp

225230235240

glyglylysthrtrpilethrvalglnprovalgluglyalapheval

245250255

valasnleuglyasphisglyhistyrleuserasnglyargphelys

260265270

asnalaasphisglnalavalvalasnserthrserserargleuser

275280285

ilealathrpheglnasnproalaglnasnalailevaltyrproleu

290295300

lysilearggluglyglulysproileleugluglualametthrtyr

305310315320

alaglumettyrlyslysasnmetthrlyshisilegluvalalathr

325330335

glnlyslysleualalysglulysargleuglnasnglulysalalys

340345350

leugluthrlysphe

355

<210>2

<211>355

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

metalaproserthrilethralaleuserglnglulysthrleuasn

151015

leuaspphevalargaspgluaspgluargprolysvalalatyrasn

202530

glnpheserasngluileproileileserleualaglyleuaspasp

354045

aspserasnglyargargalagluilecysarglysilevalgluala

505560

phegluglutrpglyilepheglnvalvalasphisglyileaspser

65707580

glyleuileserglumetserargleuserarggluphephealaleu

859095

proalagluglulysleuvaltyraspthrthrglyglylyslysgly

100105110

glyphethrileserthrhisleuglnglyaspaspvalargasptrp

115120125

arggluphevalthrtyrphesertyrproileseralaargasptyr

130135140

serargtrpprolyslysprogluglytrpargserthrthrgluval

145150155160

tyrserglulysleumetvalleuglyalalysleuleugluvalleu

165170175

serglualametglyleuglulysglualaleuthrlysalacysval

180185190

glumetgluglnlysvalleuileasntyrtyrprothrcysproglu

195200205

proaspleuthrleuglyvalargarghisthraspproglythrile

210215220

thrileleuleuglnaspmetvalglyglyleuglnalathrargasp

225230235240

glyglylysthrtrpilethrvalglnprovalgluglyalapheval

245250255

valasnleuglyasphisglyhistyrleuserasnglyargphearg

260265270

asnalaasphisglnalavalvalasnserthrserthrargleuser

275280285

ilealathrpheglnasnproalaglnasnalailevaltyrproleu

290295300

lysilearggluglyglulysalaileleuaspglualailethrtyr

305310315320

alaglumettyrlyslysasnmetthrlyshisilealavalalathr

325330335

glnlyslysleualalysglulysargleuglnaspglulysalalys

340345350

metlysile

355

<210>3

<211>1074

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

atggctccaacaactattactgcattggccaaggaaaaaacacttaactctgattttgtc60

cgggatgaggatgagcgtcccaaagttgcctacaatcaattcagcactgaaattcccatt120

atttctttagctggtatcgatgatgattccaatggcaggagacctgaggtgtgtcgtaaa180

atagtggaggccttcgaagactgggggattttccaggtagttgatcacggtattgacagc240

ggtttgatcgcggaaatgtctcgtctgtctcgtgaattctttgctttgcctgccgaggag300

aaacttcggtatgatactactggtggaaagagaggcggcttcactatctccactcatctt360

cagggtgacgatgtgaaggattggcgtgagtttgttgtttatttttcgtacccagtcgat420

gctcgggactactcgagatggcctgataagccagagggatggaggtctgttacggaggtt480

tatagtgagaagttgatggcgctaggtgccaagttactggaagtgctatcagaggccatg540

gggcttgaaaaagaggctcttacagaggcttgtgtgaacatggaacagaaagtgttgatt600

aattactatcctacatgtccccaaccggacttgacacttggagtcagaaggcacacggat660

ccgggtacgattaccattttgcttcaggacatggttggggggttacaggctaccagggat720

ggcggcaaaacttggattactgttcagcctgtcgagggagcttttgtcgtcaatttgggt780

gatcatggtcattatttgagcaatggaaggttcaagaatgccgatcaccaagcagtagtg840

aattcaacttctagcagattgtctatcgcaactttccagaacccggctcagaatgctata900

gtgtatccattaaagatcagggagggcgagaagccaattcttgaggaggccatgacatac960

gccgagatgtataagaaaaacatgactaaacatattgaggtggctacccagaagaaattg1020

gccaaggagaaaagattgcagaacgagaaggccaagctggagacgaaattttag1074

<210>4

<211>1068

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

atggctccatcaactataactgcactgtctcaagagaagacactgaacttagactttgtg60

agggatgaagatgagcgtcccaaagttgcttacaatcaattcagcaatgaaattcccatc120

atttctttagctggtttggatgacgattctaatggcaggagagctgagatatgtcgtaaa180

atagttgaggctttcgaagaatggggaattttccaagttgttgatcacggtattgatagc240

ggtttgatttctgagatgagtcgtctttctcgtgaattcttcgctttgcctgctgaggaa300

aaacttgtgtatgataccactggtggaaagaaaggcggctttactatctccactcatctt360

cagggagatgatgttcgggattggcgtgagtttgttacttacttttcgtatccaatcagt420

gctcgggactactcaagatggcctaaaaagcccgaggggtggagatcaaccacggaggtt480

tatagtgagaagttaatggtgctaggtgccaagttactggaggtgttatccgaggcaatg540

gggcttgagaaagaggctcttacaaaggcttgtgtggaaatggaacagaaagtgttaatt600

aattactatcccacatgccccgaacccgacttgacgctaggtgtcagaaggcatacggat660

ccaggtactattaccattctgcttcaggacatggttggtggtttacaggctactagggat720

ggcggcaaaacttggattactgttcagcctgtggagggagcttttgttgtcaatttgggt780

gatcatggtcattatttgagcaatggaaggttcaggaatgctgaccatcaagcagtagtg840

aattcaacttccaccagattgtcaattgcaactttccagaacccggctcagaatgcgata900

gtatatccgttaaagatcagggagggagagaaggcaattctggatgaggccatcacctac960

gctgaaatgtataagaaaaacatgactaaacatattgcggtggctacccagaagaaattg1020

gccaaggagaaaaggttgcaagatgagaaggccaagatgaagatatga1068

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

atggctccaacaactattactgc23

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ctaaaatttcgtctccagcttggc24

<210>7

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

agcaaatgggtcgcggatccatggctccaacaactattact41

<210>8

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

tggtggtggtggtgctcgagaaatttcgtctccagcttggc41

<210>9

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

atggctccatcaactataactgc23

<210>10

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

tcatatcttcatcttggccttctc24

<210>11

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

agcaaatgggtcgcggatccatggctccatcaactataact41

<210>12

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

tggtggtggtggtgctcgagtatcttcatcttggccttctc41