生物合成多肽融合抑制剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供经修饰的生物合成多肽融合抑制剂、其制造方法和用途。
【专利说明】生物合成多肽融合抑制剂
[0001]分案说明
[0002]本申请案是申请日为2006年11月I日，申请号为200680041233.X(国际申请号为PCT/US2006/042851)，发明名称为生物合成多肽融合抑制剂的专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0003]本发明涉及抑制膜融合事件并且包含至少一个非天然编码的氨基酸或利用至少一个非天然编码的氨基酸制造的生物合成多肽和融合蛋白。
【背景技术】
[0004]呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus, RSV)属于副粘液病毒(Paramyxoviridae)科。RSV是引起婴儿、老人和免疫功能低下的个体(包括但不限于移植患者)下呼吸道感染的主要原因。尚无有效治疗或疫苗。RSV是一种单股反义RNA病毒，其编码11种蛋白质，其中有9种为结构蛋白并且有2种为病毒复制的调控蛋白。RSV含有两种主要的表面糖蛋白，意即使病毒与宿主受体连接的受体结合蛋白(G)和使病毒能够进入宿主细胞的融合(F)蛋白。在中性pH下发生的RSV包膜的融合诱导受感染细胞与近旁未受感染的细胞之间巨大合胞体的形成。F蛋白裂解产生两个经二硫键连接的多肽，即来自C末端的Fl和来自N末端的F2。与这两个区相邻的为两个称为HR-C和HR-N的七肽重复序列，其形成使病毒与宿主细胞膜融合的具有发夹样结构的三聚体。七肽区为设计与HR-N结合且因此防止发夹样结构形成及随后融合的抑制肽的潜在标靶。RSV的融合过程与HIV融合机制极其类似。
[0005]两个独立的研究小组已集中在研发抑制RSV进入的肽。就阻断HIV融合的产品FUZEON? (Roche)来说，源自HR-C区的肽是类似的。也已证实具有常见阴离子特征的肽(诸如，源自GTPase RhoA的肽)针对RSV具有抗病毒活性。这些RhoA来源的肽显然是通过抑制病毒细胞表面接触的单独机制起作用。
[0006]肽被广泛用于研究和医学实践中，并且可以预期随着肽产品的制造和性能难题的解决，肽的重要性将增加。治疗肽(诸如本文所述的肽)被称为生物合成肽融合抑制剂(BPFI)。
[0007]当将天然肽或其类似物用于疗法中时，通常会发现其具有极高的降解和/或清除率。在需要于较长时间段内保持高的治疗剂血液含量的情况下，治疗剂的高清除率相当不便，这是因为随后将需要重复投药。在一些情况下，可能通过施用适当的医药组合物来影响肽的释放曲线，但这种方法具有多个缺点且通常并不适用。 [0008]肽酶通过跨肽键插入水分子来使肽中的肽键断裂。一般说来，大部分肽都是通过体内的肽酶以一种数分钟或更短的方式断裂。此外，一些肽酶对于某些类型的肽具有特异性，从而使其降解甚至更快。因此，如果将肽用作治疗剂，那么其活性通常会随着由肽酶作用引起的体内肽的迅速降解而降低。
[0009]克服这一缺点的一种方式是对患者投与较大剂量的所关注的治疗肽，以致即使一些肽降解，仍有足够肽保持治疗有效性。然而，这种方法令患者相当不舒服。由于大部分治疗肽无法经口投与，故治疗肽将需要持续输注、通过静脉内注射频繁投与或者通过不方便的皮下注射途径频繁投与。对于频繁投药的需求也导致许多潜在肽治疗剂在每一治疗过程中的预计成本高的令人无法接受。大量降解肽的存在还可能产生不合需要的副作用。
[0010]共价连接亲水性聚合物聚(乙二醇)(缩写为PEG)为一种增加许多生物活性分子(包括蛋白质、肽和尤其疏水性分子)的水溶性和生物利用性、增加其血清半衰期、增加其治疗半衰期、调节其免疫原性、调节其生物活性或延长其循环时间的方法。PEG已经广泛用于药品中、人工移植物上以及生物相容性、毒性缺乏和免疫原性缺乏至关重要的其它应用中。为使PEG的所需特性最大化，与生物活性分子连接的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高以赋予通常与PEG聚合物连接有关的有利特征，诸如增加的水溶性和循环半衰期，而不会不利地影响母体分子的生物活性。
[0011]PEG衍生物通常经由反应性化学官能团与生物活性分子连接，所述官能团诸如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N末端和碳水化合物部分。蛋白质和其它分子通常具有有限数目的可用于聚合物连接的反应性位点。通常，最适于经由聚合物连接进行修饰的位点在受体结合中具有重要作用，并且为分子生物活性的保留所必需。结果，聚合物链与生物活性分子上所述反应性位点的不加选择的连接通常引起经聚合物修饰的分子的生物活性显著降低乃至完全丧失。R.Clark等人，(1996).T.Biol.Chem., 271:21969-21977。为形成具有赋予标靶分子所需优势的足够聚合物分子量的接合物，现有技术方法通常已涉及将众多聚合物臂与所述分子随机连接，从而增加母体分子的生物活性降低乃至完全丧失的风险。
[0012]形成用于将P EG衍生物与蛋白质连接的基因座的反应性位点受蛋白质结构支配。蛋白质(包括酶)是由具有通用结构H2N--CHR--COOH的各种α氨基酸序列组成。一种氨基酸的α氨基部分(H2N-)与相邻氨基酸的羧基部分(一C00H)连接形成酰胺键，其可表示为一(NH--CHR--CO)n--,其中下标“η”可等于数百或数千。由R表示的片段可含有用于蛋白质生物活性且用于连接PEG衍生物的反应性位点。
[0013]举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位以及α位中存在一NH2部分。在碱性pH条件下ε--ΝΗ2不发生反应。在以PEG对蛋白质进行衍生的领域中的许多技术已针对研发用于连接蛋白质中所存在的赖氨酸残基的ε -NH2部分的PEG衍生物。"PolyethyleneGlycol and Derivatives for Advanced PEGylation^j Nektar Molecular EngineeringCatalog, 2003,第1-17页。然而，这些PEG衍生物都具有共同的局限，即其不能选择性地安装于蛋白质表面上所存在的通常众多的赖氨酸残基上。与在受体结合位点的情况下一样，在赖氨酸残基对于蛋白质活性重要(例如存在于酶活性位点中)的情况下，或在赖氨酸残基对于介导蛋白质与其它生物分子的相互作用起作用的情况下，此可为重要限制。
[0014]用于蛋白质聚乙二醇化的现有方法的第二且同样重要的新增问题在于:除所需反应之外，PEG衍生物可经历与残基的不合需要的副反应。组氨酸含有反应性亚氨基部分(结构表示为一N(H)--)，但与ε -NH2反应的许多化学反应性物质也可与一N(H)--反应。类似地，氨基酸半胱氨酸的侧链带有游离巯基，其结构表示为-SH。在一些情况下，针对赖氨酸ε -NH2基团的PEG衍生物也可与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。此可产生经PEG衍生的生物活性分子的复杂异质混合物和破坏所靶向的生物活性分子的活性的风险。需要研发允许在蛋白质内的单一位点处引入化学官能团的PEG衍生物，其随后会使一种或一种以上PEG聚合物与生物活性分子在蛋白质表面上经明确定义且可预测的特异性位点处选择性偶合。
[0015]除赖氨酸残基之外，所属领域中已针对研发靶向其它氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N末端)的活性PEG试剂作出相当大的努力。例如参看美国专利第6，610，281号，其是以引用的方式并入本文中；和〃Polyethylene Glycol and Derivatives forAdvanced PEGylation^, Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003,第 1-17 页。可使用定点突变诱发和所属领域中已知的其它技术将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白质结构中，且所得游离巯基部分可与带有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。然而，这种方法相当复杂，原因在于引入游离巯基会使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性复杂化。因此，需要具有一种将化学官能团引入生物活性分子中的方法，其能够使一种或一种以上PEG聚合物与蛋白质选择性偶合，而同时与巯基和通常见于蛋白质中的其它化学官能团相容(即，不与其进行不需要的副反应)。 [0016]自所属领域的取样可见，针对与蛋白质的侧链(具体说来，赖氨酸氨基酸侧链上的一NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分)连接所研发的这些衍生物中的多种已经证明在其合成和使用中有问题。一些衍生物与蛋白质形成不稳定键，其在水性环境中(诸如在血流中)经历水解且因此分解、降解或在其它方面不稳定。一些衍生物形成较稳定的键，但在键形成之前经历水解，这意谓着PEG衍生物上的反应性基团可在蛋白质连接之前失活。一些衍生物具有些许毒性且因此不太适用于活体内。一些衍生物反应过慢以致于实际上无用。一些衍生物通过与负责蛋白质活性的位点连接而导致蛋白质活性丧失。一些衍生物对于其将连接的位点无特异性，这也可导致所需活性丧失且结果缺乏再现性。为克服与用聚(乙二醇)部分修饰蛋白质相关的难题，已研发出较稳定(例如，美国专利6，602，498，其是以引用的方式并入本文中)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应(例如，美国专利6，610，281，其是以引用的方式并入本文中)的PEG衍生物。在所属领域中明显需要直到要求选择性反应形成稳定化学键之前都在生理环境中呈化学惰性的PEG衍生物。
[0017]近来，在蛋白质科学中已报导一种全新的技术，其有希望克服与蛋白质的位点特异性修饰相关的许多局限。具体说来，已将新组分加到原核生物大肠杆菌(Escherichia coli ；E.coli)(例如，L.Wang 等人,(2001), Science292:498-500)和真核生物酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae ；S.cerevisiae)(例如，J.Chin 等人，Science301:964-7 (2003))的蛋白质生物合成机构中，其使得能够在活体内向蛋白质中并入非基因编码的氨基酸。使用这种方法，已经回应琥珀密码子TAG而将具有新颖化学、物理或生物特性的众多新颖氨基酸(包括光亲和性标记和可光异构化氨基酸、酮基氨基酸和糖基化氨基酸)有效且高保真地并入大肠杆菌和酵母中的蛋白质中。例如参看J.W.Chin等人，(2002), Tournal of the American Chemical Societyl24:9026-9027 ；J.ff.Chin, &P.G.Schultz, (2002).ChemBioChem3(ll): 1135-1137 ；J.ff.Chin 等人，(2002).PNASUnited States of America99:1102Q-11024:和 L.Wang, &P.G.Schultz, (2002), Chem.Comm., 1:1-11。这些研究已证实有可能选择性且常规地引入诸如酮基、炔基和叠氮基部分的化学官能团，所述化学官能团未见于蛋白质中，对见于20种常见基因编码氨基酸中的所有官能团呈化学惰性并且可用于有效且选择性地反应以形成稳定共价键。
[0018]将非基因编码的氨基酸并入蛋白质中的能力允许引入可提供天然存在官能团(诸如赖氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等)的有价值替代物的化学官能团。已知某些化学官能团对见于20种常见基因编码氨基酸中的官能团呈惰性，但完全且有效地反应以形成稳定键。举例来说，在所属领域中已知叠氮基和乙炔基在存在催化量的铜的情况下在水性条件中经历Huisgen[3+2]环加成反应。例如参看Tornoe等人，(2002) J.0rg.Chem.67:3057-3064 ；和 Rostovtsev 等人，(2002) Angew.Chem.1nt.Ed.41:2596-2599。举例来说，通过将叠氮基部分引入蛋白质结构中，能够并入对见于蛋白质中的胺、巯基、羧酸、羟基呈化学惰性但也与乙炔部分平稳且有效地反应形成环加成产物的官能团。重要的是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮基在存在其它蛋白质侧链的情况下且在生理条件下保持化学惰性且不起反应。
[0019]本发明尤其针对与BPFI的活性和制备相关的问题，且也针对具有改良的生物或药理学特性(诸如改良的治疗半衰期)的BPFI的制备。
【发明内容】
[0020]本发明提供HR-C源性肽的具有改良的螺旋倾向的RSV进入抑制剂。本发明还提供具有融合抑制剂活性与阴离子肽活性的组合的RSV进入抑制剂。本发明还提供具有位点特异性聚乙二醇化以改 良肽的药理学特性的BPFI。本发明提供生物合成肽融合抑制剂(BPFI)，其包括但不限于膜融合抑制肽和阴离子肽，BPFI包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸。具有治疗活性的任何BPF1、其片段、类似物或变体都可用于本发明中。已提供可用于本发明中的BPFI的众多实例。然而，所提供的列表并不详尽并且不欲以任何方式限制可用于本发明中的BPFI的数量或类型。因此，可根据本发明对任何BPFI和/或由任何BPFI (包括新颖BPFI)产生的片段、类似物和变体进行修饰并且在治疗上使用。
[0021]在一些实施例中，BPFI包含一个或一个以上翻译后修饰。在一些实施例中，BPFI与连接基、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中，BPFI与双官能聚合物、双官能连接基或至少一种其它BPFI连接。
[0022]在一些实施例中，非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物与第二多肽连接。在一些实施例中，第二多肽为BPFI。
[0023]在一些实施例中，非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸与具有连接基的水溶性聚合物连接或与水溶性聚合物键结。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸与具有可生物降解的连接基的水溶性聚合物连接。在一些实施例中，可生物降解的连接基可用于形成包含BPFI的前药。在所述前药方法的一个实例中，水溶性聚合物阻断BPFI活性并且连接基的降解释放活性BPFI。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸与酰基部分或酰基链连接。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸通过连接基与酰基部分或酰基链连接。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸通过聚(乙二醇)连接基或前药与酰基部分或酰基链连接。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸与血清白蛋白连接。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸通过连接基与血清白蛋白连接。在一些实施例中，连接基为聚(乙二醇)或前药。在一些实施例中，连接基为两次裂解(dual cleavage)的前药，其中第I步骤为诸如白蛋白的分子的受控释放并且第2步骤为连接基或其部分的第二次裂解释放。[0024]在一些实施例中，BPFI包含BPFI中存在的两个氨基酸之间的分子内桥。在一些实施例中，BPFI包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸。两个桥接残基中一个可为非天然编码的氨基酸或天然编码的氨基酸。非天然编码的氨基酸可通过连接基、聚合物或生物活性分子接合。
[0025]在一些实施例中，BPFI包含至少两个与包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物连接的氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸为非天然编码的氨基酸。
[0026]在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入BPFI的任何位置处，诸如HR-C、HR-N或阴离子肽、这些肽中任一者或一者以上的融合体或这些肽中任一者或一者以上的片段、第一氨基酸(氨基酸末端处)之前、在羧基末端处添加或其任何组合。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入BPFI氨基酸序列内的任何位置处。
[0027]在一些实施例中，在这些位置的一个或一个以上位置中的非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物连接。
[0028]在一些实施例中，本发明的BPFI多肽在与BPFI序列相邻或BPFI序列内的一个或一个以上氨基酸位置处包含一个或一个以上非天然存在的氨基酸以提供拮抗剂。
[0029]在一些实施例中，BPFI包含调节BPFI对BPFI受体或结合搭配物(包括但不限于，蛋白质、多肽、小分子、脂质或核酸)的亲和力的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的稳定性相比时增加BPFI的稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的免疫原性相比时调节BPFI的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的血清半衰期或循环时间相比时调节BPFI的血清半衰期或循环时间的取代、添加或缺失。
[0030]在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的水溶性相比时增加BPFI的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的溶解性相比时增加宿主细胞中所产生的BPFI的溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的表达或合成相比时增加宿主细胞中BPFI的表达或增加活体外合成的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的肽酶或蛋白酶敏感性相比时降低BPFI的肽酶或蛋白酶敏感性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的活性相比时调节BPFI受体或结合搭配物的信号转导活性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的结合相比时调节其与另一分子(诸如受体)的结合的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与在无取代、添加或缺失的相应BPFI结合后结合搭配物的构象或生物活性相比时调节其结合搭配物的构象或一种或一种以上生物活性的取代、添加或缺失。
[0031]在一些实施例中，BPFI中的氨基酸取代可以天然存在或非天然存在的氨基酸进行，条件是至少一个取代是以非天然编码的氨基酸进行。
[0032]在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含羰基、氨基氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、置氣基或炔基。
[0033]在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸具有以下结构:
[0034]
【权利要求】
1.一种生物合成多肽融合抑制剂(BPFI)，其包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸。
2.根据权利要求1所述的BPFI，其中所述BPFI包含一个或一个以上翻译后修饰。
3.根据权利要求1所述的BPFI，其中所述多肽与连接基、聚合物或生物活性分子连接。
4.根据权利要求3所述的BPFI，其中所述多肽与水溶性聚合物连接。
5.根据权利要求1所述的BPFI，其中所述多肽与双官能聚合物、双官能连接基或至少一个其它BPFI连接。
6.根据权利要求5所述的BPFI，其中所述双官能连接基或聚合物与第二多肽连接。
7.根据权利要求6所述的BPFI，其中所述第二多肽为BPFI。
8.根据权利要求4所述的BPFI，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
9.根据权利要求4所述的BPFI，其中所述水溶性聚合物与所述BPFI中存在的非天然编码的氨基酸连接。
10.根据权利要求1所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸对连接基、聚合物或生物活性分子具反应性，所述连接基、聚合物或生物活性分子对所述多肽中的20种常见氨基酸中的任一种不具反应性。
11.根据权利要求1所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸包含羰基、氨基氧基、餅基、酸餅基、氣基服基、置氣基或炔基。
12.根据权利要求11所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸包含羰基。
13.根据权利要求12所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸具有以下结构:
14.根据权利要求11所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸包含氨基氧基。
15.根据权利要求11所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸包含酰肼基。
16.根据权利要求11所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸包含肼基。
17.根据权利要求11所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸残基包含氨基脲基。
18.根据权利要求11所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸残基包含叠氮基。
19.根据权利要求18所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸具有以下结构:
20.根据权利要求11所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸包含炔基。
21.根据权利要求20所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸具有以下结构:
22.根据权利要求4所述的BPFI，其中所述水溶性聚合物具有介于约0.1kDa与约IOOkDa之间的分子量。
23.根据权利要求22所述的BPFI，其中所述水溶性聚合物具有介于约0.1kDa与约50kDa之间的分子量。
24.根据权利要求4所述的BPFI，其是通过使包含含羰基氨基酸的BPFI与包含氨基氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的水溶性聚合物反应来制备。
25.根据权利要求24所述的BPFI，其中所述氨基氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基通过酰胺键与所述水溶性聚合物连接。
26.根据权利要求4所述的BPFI，其是通过使包含羰基的水溶性聚合物与包含非天然编码的氨基酸的多肽反应来制备，所述非天然编码的氨基酸包含氨基氧基、肼基、酰肼基或氣基服基。
27.根据权利要求4所述的BPFI，其是通过使包含含炔氨基酸的BPFI与包含叠氮基部分的水溶性聚合物反应来制备。
28.根据权利要求4所述的BPFI，其是通过使包含含叠氮基氨基酸的BPFI与包含炔部分的水溶性聚合物反应来制备。
29.根据权利要求28所述的BPFI，其中所述叠氮基或炔基通过酰胺键与水溶性聚合物连接。
30.根据权利要求4所述的BPFI，其中所述水溶性聚合物为分支或多臂聚合物。
31.根据权利要求30所述的BPFI，其中所述水溶性聚合物的各分支具有介于约IkDa与约IOOkDa之间的分子量。
32.根据权利要求1所述的BPFI，其中所述多肽为拮抗剂。
33.根据权利要求32所述的BPFI，其中所述多肽包含一个或一个以上翻译后修饰、连接基、聚合物或生物活性分子。
34.根据权利要求33所述的BPFI，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成的群组的部分。
35.一种经分离核酸,其包含在严格条件下与编码BPFI的核苷酸序列杂交的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包含至少一个选择密码子。
36.根据权利要求35所述的经分离核酸，其中所述选择密码子选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子组成的群组。
37.一种制备根据权利要求3所述的BPFI的方法，所述方法包含使包含非天然编码的氨基酸的经分离BPFI与包含与所述非天然编码的氨基酸反应的部分的连接基、聚合物或生物活性分子接触。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成的群组的部分。
39.一种细胞 ，其包含根据权利要求35所述的核酸。
【文档编号】C07K14/135GK103965300SQ201410202290
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2006年11月1日 优先权日:2005年11月2日
【发明者】罗伯托·马利安, 布鲁斯·E.·金摩 申请人:Ambrx公司