一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白及其医药用途的制作方法

本发明涉及生物医药
技术领域：
，特别涉及一种人白细胞介素10-fc融合蛋白及其医药用途。
背景技术：
：人白细胞介素10(il-10)基因位于1q31-32上，全长5.1kb，包含5个外显子。il-10基因由178个氨基酸组成，人类和鼠类的il-10基因有75％的氨基酸序列是一致的，人类il-10是一个35kd的二聚体，由两个单体通过非共价键形式结合，在单体内有两个二硫键来维持其结构和生物学活性。目前已知所有的淋巴细胞均能合成il-10，体内最重要的来源主要是单核巨噬细胞和t辅助细胞，此外，树突状细胞，b细胞，nk细胞，细胞毒性t细胞，肥大细胞以及中性粒细胞和嗜酸性细胞也能合成il-10基因。多年来，人们对il-10的认识主要集中在免疫抑制方面，认为il-10可以直接抑制效应t细胞增殖和迁移能力并下调相关细胞因子的产生，在诱导肿瘤的免疫逃逸方面起到重要作用。近年来，不断有研究表明il-10具有免疫活化作用，其免疫活化作用对于肿瘤的抑制起到了至关重要的作用。mumm等研究发现聚乙二醇化il-10对移植瘤有排斥作用，并可提高颗粒酶b和ifn-γ的表达。il-10是人体中天然存在的免疫生长因子，能刺激免疫系统中一种被称为cd8+t细胞的特殊白细胞的存活、扩增和杀伤潜力，cd8+t细胞可以识别并杀死癌细胞，il-10激活cd8+t细胞中磷酸化的stat1和stat3，从而诱导cd8+t细胞的增殖和ifn-γ、细胞毒性蛋白穿孔素及颗粒蛋白酶的表达；ifn-γ可以诱导肿瘤细胞和单核巨噬细胞中mhc-ⅰ类抗原提呈分子的表达，协助cd8+t细胞杀死大部分抗原特异性肿瘤细胞；激活cd8+t细胞中的tcr可以有效地诱导抗细胞凋亡信号和细胞增殖信号，cd8+t细胞的存活和扩增有望改善患者的预后和生存率。重组人il-10在体内半衰期只有2个小时，很快会被清除，这严重影响了其在疾病治疗中的应用。为了克服重组人il-10半衰期短的问题，目前有些研究机构采用peg化修饰方法延长其在体内的半衰期，但是peg化修饰位点较多，所以人il-10经过peg化修饰后产物不均一，这给生产工艺和质量控制带来了很大的难度。因此，急需开发一种既能够有效延长重组人il-10半衰期，而且能够得到稳定的均一产物，便于工艺生产和质量控制的人白细胞介素10-fc融合蛋白及其医药用途。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的人il-10半衰期短，人il-10经过peg化修饰后产物不均一等问题，本发明通过基因工程技术提供了一种将人il-10与免疫球蛋白fc片段融合在一起，并保留了il-10生物活性，极大延长了il-10在生物体内的半衰期的人白细胞介素10-fc融合蛋白及其医药用途。本发明具体技术方案如下：本发明提供了一种人白细胞介素10-fc融合蛋白，所述融合蛋白是由人白细胞介素10通过连接肽与免疫球蛋白igg的fc片段融合而成；其中，所述fc片段选自人igg1、igg2或igg4中的一种；所述人白细胞介素10的氨基酸序列如seqidno:1所示。本发明将人白细胞介素10与免疫球蛋白fc片段融合，不仅保留了人白细胞介素10的生物学活性，而且能够通过免疫球蛋白fc片段有效延长了半衰期，克服了人白细胞介素10半衰期短的缺陷，本发明的fc片段选自人igg1、igg2或igg4，其中igg2和igg4使用野生型序列，人igg的四种亚型中，igg1和igg3亚型的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(adcc作用)和补体依赖的细胞毒性作用(cdc作用)较强，而igg2和igg4亚型的adcc作用和cdc作用相对较弱，人白细胞介素10-fc融合蛋白并不需要adcc和cdc作用，相反，adcc和cdc作用会带来一些不必要的副作用，因此igg2和igg4的fc片段使用野生型氨基酸序列；此外，本发明通过连接肽与免疫球蛋白igg的fc片段连接，不仅保证了大分子融合蛋白的稳定性，而且能够保证得到均一的融合蛋白产物，便于生产和质量控制。优选的，所述fc片段为人igg1的fc部分。优选的，所述fc片段的氨基酸序列选自seqidno:2或seqidno:3。进一步的，所述连接肽通式为[glyglyglyglyx]n；其中，所述x为ser或ala，所述n为1-6的整数。优选的，所述x优选ser。优选的，所述n为6。连接肽的结构设计能够保证药物分子的生物活性。本发明还提供了一种多核苷酸序列或组合，所述多核苷酸序列或组合编码所述人白细胞介素10-fc融合蛋白的氨基酸序列。本发明进一步提供了一种重组dna表达载体，所述重组dna表达载体包含所述多核苷酸序列或组合。本发明还提供了一种转染所述重组dna表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。本发明还提供了一种药物或药物组合物，所述药物或药物组合物包含所述人白细胞介素10-fc融合蛋白。本发明还提供了一种所述人白细胞介素10-fc融合蛋白用于制备治疗免疫疾病和癌症药物中的应用。本发明的有益效果如下：首先，本发明提供的人白细胞介素10-fc融合蛋白在保留了人白细胞介素10生物活性的同时，通过与免疫球蛋白igg的fc片段融合，延长了人白细胞介素10在生物体内的半衰期，增加了人白细胞介素10在体内的稳定性，能够长时间抑制肿瘤生长，有利于其在疾病治疗中的应用，其次，从纯化工艺和生产角度而言，本发明采用基因工程技术进行人白细胞介素10-fc融合蛋白的制备，通过连接肽将人白细胞介素10与免疫球蛋白igg的fc片段融合，提高了大分子融合蛋白的稳定性，产品均一性较好，克服了il-10peg化带来的生产工艺和质量控制的麻烦；此外，本发明还公开了所述的il-10融合蛋白可用于相关疾病的治疗，所述的疾病包括免疫疾病和癌症等，免疫疾病包括但不限于多发性硬化症、银屑病、风湿性关节炎、克罗恩病等；癌症包括但不限于胰腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、结直肠癌、乳腺癌等肿瘤。附图说明图1为本发明人白细胞介素10-fc融合蛋白分子结构示意图；图2为本发明人白细胞介素10和人白细胞介素10-fc融合蛋白表达载体；图3为本发明人白细胞介素10和人白细胞介素10-fc融合蛋白的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；图4为本发明人白细胞介素10和人白细胞介素10-fc融合蛋白刺激小鼠肥大细胞mc/9增殖；图5为本发明人白细胞介素10-fc融合蛋白对sk-br-3肿瘤细胞的杀伤；图6为本发明人白细胞介素10-fc融合蛋白在小鼠h1975肿瘤模型中的药效作用。具体实施方式下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。实施例1本发明实施例1提供了一种人白细胞介素10-fc融合蛋白，融合蛋白是由人白细胞介素10通过连接肽与免疫球蛋白igg的fc片段融合而成；其中，fc片段为人igg1的fc部分；人白细胞介素10的氨基酸序列如seqidno:1所示；fc片段的氨基酸序列如seqidno:2所示；连接肽通式为[glyglyglyglyser]6，连接肽的氨基酸序列如seqidno:4所示。其中，seqidno:1(人白细胞介素10的氨基酸序列)；spgqgtqsenscthfpgnlpnmlrdlrdafsrvktffqmkdqldnlllkeslledfkgylgcqalsemiqfyleevmpqaenqdpdikahvnslgenlktlrlrlrrchrflpcenkskaveqvknafnklqekgiykamsefdifinyieaymtmkirn。seqidno:2(fc片段的氨基酸序列)；dkthtcppcpapeleggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkayacavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。seqidno:4(连接肽的氨基酸序列)；ggggsggggsggggsggggsggggsggggs。人白细胞介素10-fc融合蛋白的具体构型示意图如图1所示。实施例2本发明实施例2提供了一种人白细胞介素10-fc融合蛋白，融合蛋白是由人白细胞介素10通过连接肽与免疫球蛋白igg的fc片段融合而成；其中，fc片段为人igg1的fc部分；人白细胞介素10的氨基酸序列如seqidno:1所示；fc片段的氨基酸序列如seqidno:3所示；连接肽通式为[glyglyglyglyser]6，连接肽的氨基酸序列如seqidno:4所示。其中，seqidno:1和seqidno:4提供的氨基酸序列与实施例1中相同；seqidno:3(fc片段的氨基酸序列)；epkscdkthtcppcpapeleggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkayacavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。人白细胞介素10-fc融合蛋白的具体构型示意图如图1所示。实施例3本发明实施例3提供了一种人白细胞介素10-fc融合蛋白，融合蛋白是由人白细胞介素10通过连接肽与免疫球蛋白igg的fc片段融合而成；其中，fc片段为人igg2的fc部分，fc片段的氨基酸序列如seqidno:5所示；人白细胞介素10的氨基酸序列如seqidno:1所示；连接肽通式为[glyglyglyglyser]6，连接肽的氨基酸序列如seqidno:4所示。其中，seqidno:1和seqidno:4提供的氨基酸序列与实施例1中相同；seqidno:5(fc片段的氨基酸序列)；erkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdisvewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。人白细胞介素10-fc融合蛋白的具体构型示意图如图1所示。实施例4本发明实施例4提供了一种人白细胞介素10-fc融合蛋白，融合蛋白是由人白细胞介素10通过连接肽与免疫球蛋白igg的fc片段融合而成；其中，fc片段为人igg4的fc部分，fc片段的氨基酸序列如seqidno:6所示；人白细胞介素10的氨基酸序列如seqidno:1所示；连接肽通式为[glyglyglyglyser]6，连接肽的氨基酸序列如seqidno:4所示。其中，seqidno:1和seqidno:4提供的氨基酸序列与实施例1中相同；seqidno:6(fc片段的氨基酸序列)；eskygppcpscpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk。人白细胞介素10-fc融合蛋白的具体构型示意图如图1所示。实施例5本发明实施例5提供了一种人白细胞介素10-fc融合蛋白，融合蛋白是由人白细胞介素10通过连接肽与免疫球蛋白igg的fc片段融合而成；其中，fc片段为人igg2的fc部分，fc片段的氨基酸序列如seqidno:5所示；人白细胞介素10的氨基酸序列如seqidno:1所示；连接肽通式为[glyglyglyglyser]5，连接肽的氨基酸序列如seqidno:7所示。其中，seqidno:1提供的氨基酸序列与实施例1中相同；seqidno:5提供的氨基酸序列与实施例3中相同；seqidno:7(连接肽的氨基酸序列)；ggggsggggsggggsggggsggggs。人白细胞介素10-fc融合蛋白的具体构型示意图如图1所示。实施例6本发明实施例6提供了一种人白细胞介素10-fc融合蛋白，融合蛋白是由人白细胞介素10通过连接肽与免疫球蛋白igg的fc片段融合而成；其中，fc片段为人igg4的fc部分，fc片段的氨基酸序列如seqidno:6所示；人白细胞介素10的氨基酸序列如seqidno:1所示；连接肽通式为[glyglyglyglyala]4，连接肽的氨基酸序列如seqidno:8所示。其中，seqidno:1提供的氨基酸序列与实施例1中相同，seqidno:6提供的氨基酸序列与实施例4中相同；seqidno:8(连接肽的氨基酸序列)；ggggaggggaggggagggga。人白细胞介素10-fc融合蛋白的具体构型示意图如图1所示。实施例7本发明实施例7提供了一种人白细胞介素10-fc融合蛋白，融合蛋白是由人白细胞介素10通过连接肽与免疫球蛋白igg的fc片段融合而成；其中，fc片段为人igg1的fc部分；人白细胞介素10的氨基酸序列如seqidno:1所示；fc片段的氨基酸序列如seqidno:2所示；连接肽通式为[glyglyglyglyser]3，连接肽的氨基酸序列如seqidno:9所示。其中，seqidno:1和seqidno:2提供的氨基酸序列与实施例1中相同；seqidno:9(连接肽的氨基酸序列)；ggggsggggsggggs。人白细胞介素10-fc融合蛋白的具体构型示意图如图1所示。实施例8本发明实施例8提供了一种人白细胞介素10-fc融合蛋白，融合蛋白是由人白细胞介素10通过连接肽与免疫球蛋白igg的fc片段融合而成；其中，fc片段为人igg2的fc部分，人白细胞介素10的氨基酸序列如seqidno:1所示；fc片段的氨基酸序列如seqidno:5所示；连接肽通式为[glyglyglyglyala]3，连接肽的氨基酸序列如seqidno:10所示。其中，seqidno:1提供的氨基酸序列与实施例1中相同；seqidno:5提供的氨基酸序列与实施例3中相同；seqidno:10(连接肽的氨基酸序列)；ggggaggggagggga。人白细胞介素10-fc融合蛋白的具体构型示意图如图1所示。实施例9本发明实施例9提供了一种多核苷酸序列或组合，多核苷酸序列或组合编码实施例1-8任一项提供的人白细胞介素10-fc融合蛋白的氨基酸序列。实施例10本发明实施10提供了一种重组dna表达载体，重组dna表达载体包含实施例9提供的多核苷酸序列或组合。实施例11本发明实施11提供了一种转染实施例10中提供的重组dna表达载体的宿主细胞，宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。实施例12本发明实施例12提供了一种药物或药物组合物，药物或药物组合物包含实施例1-8任一项提供的人白细胞介素10-fc融合蛋白。实施例13本发明实施例13提供了一种人白细胞介素10-fc融合蛋白用于制备治疗免疫疾病和癌症药物中的应用，其中，免疫疾病包括但不限于多发性硬化症、银屑病、风湿性关节炎、克罗恩病等；癌症包括但不限于胰腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、结直肠癌、乳腺癌等肿瘤。实验例1、人白细胞介素10和人白细胞介素10-fc融合蛋白表达载体的构建按照实施例1-8并参考如图1所示的分子构型示意图，选择ptse作为表达载体，基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，基因合成时，在合成基因两侧分别引入ecorl、bamhi酶切位点，然后对ptse表达载体和合成的抗体基因均进行ecorl、bamhi双酶切，并将ptse表达载体和抗体基因的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳和目的片段回收，最后将回收的目的片段分别连接到ptse表达载体中，转化到top感受态细胞(汇天东方，货号ht702-03)，测序正确后得到基因表达载体(如图2所示)，质粒分别命名为：r1l-10、il-10-fc-a、il-10-fc-b、il-10-fc-c、il-10-fc-d、il-10-fc-e、il-10-fc-f、il-10-fc-g、il-10-fc-h。实验例2、人白细胞介素10和人白细胞介素10-fc融合蛋白的表达和纯化1)、人白细胞介素10和人白细胞介素10-fc融合蛋白表达质粒的获得。利用无内毒素大提试剂盒(购买于康为世纪生物科技有限公司，cw2104)进行质粒大提，具体操作步骤如下：(1)取200μl活化的菌液置于500ml摇瓶(含200mlamp+的lb培养基)中，37℃，220rpm摇床过夜培养；(2)取200ml过夜培养的菌液，加入离心管中，在7000rpm下离心5分钟收集细菌，尽量除尽全部上清；(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入12.5mlbufferp1(已加入rnasea)，使用涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀；(4)向离心管中加入12.5mlbufferp2，温和地上下颠倒混匀8-10次，使菌体充分裂解，室温放置3-5分钟，待溶液应变得清亮粘稠；(5)向离心管中加入12.5mlbuffere3，立即上下颠倒混匀8-10次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5分钟；在7000rpm下离心15分钟，将上清全部倒入除内毒素过滤器(endo-removerfq)中，慢慢推动推柄(plungers)过滤，滤液收集在干净的50ml离心管(自备)中；(6)向滤液中加入10ml、0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀；(7)柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱(spincolumnsdq)中加入2mlbufferps，在7000rpm下离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(8)将步骤6中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱(已装入收集管)中；(9)在7000rpm下离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(10)向吸附柱中加入10mlbufferpw(已加入无水乙醇)，在7000rpm下离心2分钟，倒掉收集管中的废液；(11)重复步骤(10)一次；(12)将吸附柱重新放回收集管中，7000rpm离心5分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液；(13)将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位加入1ml无内毒素用水，室温放置2-5分钟，在7000rpm下离心5分钟，将质粒溶液收集到离心管中；测定浓度后，于-20℃保存质粒。2)、人白细胞介素10和人白细胞介素10-fc融合蛋白表达质粒的瞬时转染。人胚肾细胞(hek293es悬浮细胞)在freestyle293expressionmedium(gibco)中培养，细胞每隔一到两天传代一次，传代后细胞起始密度维持在0.2-0.6×106个/ml，细胞培养体积为摇瓶容积的15-35％，细胞培养瓶放在摇床(摇床转速:135rpm，温度:37℃，co2:5％)中培养。转染前一天，将处于对数生长期，生长状态良好的hek293es细胞，传代到细胞密度为0.5×106个/ml，放置摇床(135rpm，37℃，5％co2)培养过夜，待第二天进行转染。转染前将准备好的1×106个/ml细胞悬液在摇床(135rpm，39℃，5％co2)培养2h，转染时，依次加入上述步骤1)得到的9种质粒(终浓度1μg/ml)、聚乙烯亚胺pei(终浓度2μg/ml)，混匀，一起共转染到hek293es悬浮细胞中，之后，置于摇床(135rpm，39℃，5％co2)培养40min。转染后的细胞继续在135rpm，37℃，5％co2摇床中培养，表达人白细胞介素10和人白细胞介素10-fc融合蛋白。转染96小时后离心收获上清液体。3)、人白细胞介素10和人白细胞介素10-fc融合蛋白的纯化。人白细胞介素10的纯化：上清液体用0.22um滤膜过滤，利用ni柱从表达上清中获得带有his标签结构域的人白细胞介素10。平衡缓冲液和洗脱缓冲液分别为50mmtris-hcl、0.5mnacl、20mm咪唑、ph7.6和50mmtris-hcl、0.5mnacl、0.5m咪唑、ph7.6。设置梯度洗脱条件：100％洗脱液，30min，5ml/min流速梯度洗脱，根据咪唑不同浓度变化，收集uv280检测到的蛋白峰，标记好收峰位置，用pbs缓冲液进行换液浓缩。人白细胞介素10-fc融合蛋白的纯化：上清液体用0.22um滤膜过滤，利用hitraprproteina亲和层析柱从表达上清中获得带有fc结构域的融合蛋白。平衡缓冲液和洗脱缓冲液分别为50mmtris-hcl、0.15mnacl、ph7.0和0.1m柠檬酸-柠檬酸钠、ph3.0。通过阳离子交换柱hitrap-spff获得目标抗体，最后用pbs缓冲液进行换液浓缩。得到纯化后的人白细胞介素10和人白细胞介素10-fc融合蛋白，如图3所示，从左侧到右侧依次为蛋白质分子量marker、ril-10、il-10-fc-a、il-10-fc-b、il-10-fc-c、il-10-fc-d、il-10-fc-e、il-10-fc-f、il-10-fc-g、il-10-fc-h，每条带的分子量大小与理论一致。本发明保护的人白细胞介素10-fc融合蛋白选自以下任意一种：实施例药物分子人白细胞介素10氨基酸序列fc亚型fc氨基酸序列linker氨基酸序列1il-10-fc-aseqidno:1igg1seqidno:2seqidno:42il-10-fc-bseqidno:1igg1seqidno:3seqidno:47il-10-fc-cseqidno:1igg1seqidno:2seqidno:93il-10-fc-dseqidno:1igg2seqidno:5seqidno:45il-10-fc-eseqidno:1igg2seqidno:5seqidno:78il-10-fc-fseqidno:1igg2seqidno:5seqidno:104il-10-fc-gseqidno:1igg4seqidno:6seqidno:46il-10-fc-hseqidno:1igg4seqidno:6seqidno:8实验例3、人白细胞介素10-fc融合蛋白刺激小鼠肥大细胞mc/9增殖1、实验细胞名称：小鼠肥大细胞mc/9细胞培养基：rpmi1640(gibico，a10491-01)+10％fbs(vistech，se200-es)来源：上海子实生物科技有限公司细胞特性：该细胞表达内源性鼠白细胞介素10(il-10)受体(r1和r2)，在小鼠白细胞介素4(il-4)(mil-4)存在的情况下，il-10可刺激mc/9小鼠肥大细胞株增殖。而单一的mil-4或hil-10则仅有很低的增殖刺激活性。2、细胞铺板及加药取对数生长期的mc/9细胞用空白1640培养基洗涤2次，悬于20％fcs-1640培养液，并调制浓度为2×105个/ml，加入96孔板，1×104个/孔，设置对照组和实验组，分别给药，具体给药情况如下。37℃，5％co2培养箱中培养72小时后，加入cck-8检测液，37℃孵育2-4小时后在450nm处检测od值。实验结果如图4所示，通过细胞增殖情况得知，本发明提供的融合蛋白il-10-fc-a、il-10-fc-b、il-10-fc-c、il-10-fc-d、il-10-fc-e、il-10-fc-f、il-10-fc-g、il-10-fc-h保留了人白细胞介素10生物活性，不同类型的人白细胞介素10-fc融合蛋白均能刺激小鼠肥大细胞mc/9的增值，通过小鼠白细胞介素4(il-4)共刺激，人白细胞介素10-fc融合蛋白能够显著刺激细胞增殖。实验例4、人白细胞介素10-fc融合蛋白对sk-br-3肿瘤细胞体外杀伤作用1、靶细胞名称：人乳腺癌细胞sk-br-3维持培养基：rpmi1640(gibico，a10491-01)+10％fbs(vistech，se200-es)实验培养基：rpmi1640(gibico，a10491-01)+10％灭活fbs(vistech，se200-es)来源：atcc2、靶细胞铺板及血清灭活提前一天将sk-br-3细胞消化后，维持培养基重悬计数，铺于平底96孔板中，5×103个/100μl/孔，过夜培养，待细胞贴壁。取一管完全融化的fbs，置于60℃水浴锅中，作用40min，即获得灭活血清。3、效应细胞——人单个核细胞(pbmc)分离在50ml管中加入20ml单个核细胞分离液；用全血稀释液将采集到的血液按1:1比例进行稀释处理，混匀后沿康宁管内壁匀速缓慢的铺至分离液上层，每管内加入稀释后全血体积为20ml；待各管加液完毕后放入提前预冷至22℃的离心机内，600g水平离心15min(加减速设置为1)；离心完成后取出离心管，用移液器小心吸取置于分离液和血清间呈圆弧状分布的细胞层—单个核细胞(pbmc)，置于新的50ml管中；按照1:5比例在细胞液中加入细胞洗涤液，充分混匀后离心，弃上清，再重复洗涤一次，收集细胞沉淀，用rpmi-1640培养基重悬；将单个核细胞(pbmc)调整细胞数目为2.5×106个/ml；4、药物稀释及铺板加药将实施例2中得到的8种药物分子(il-10-fc-a、il-10-fc-b、il-10-fc-c、il-10-fc-d、il-10-fc-e、il-10-fc-f、il-10-fc-g、il-10-fc-h)用实验培养基稀释，使其作用终浓度为200μg/ml，设置3个复孔。将96孔板内的生长培养基弃去，灭菌pbs轻柔洗一次，每孔加入100μl实验用培养基。将调整数目的pbmc细胞和稀释后的药物分子先后加入96孔板内，pbmc与靶细胞的效靶比为50:1。设置空白靶细胞、空白pbmc对照组，每组分别只含有靶细胞和效应细胞，每组3个复孔；同时设置效应细胞/靶细胞混合作用孔，共计6孔。其中3孔设为最大杀伤组，在检测前30min加入裂解液，完全裂解杀死细胞；其余3孔为自然杀伤组(自然杀伤组中分别加入il-10-fc-a、il-10-fc-b、il-10-fc-c、il-10-fc-d、il-10-fc-e、il-10-fc-f、il-10-fc-g、il-10-fc-h)，作为融合蛋白杀伤作用的对照(target+pbmc)。空白靶细胞、空白pbmc及最大杀伤组均用于进行细胞死亡率计算。标示清晰后，置于37℃细胞培养箱孵育。5、检测及杀伤率计算3天后镜检可见明显靶细胞数目减少，取上清液进行ldh检测，酶标仪读取od490后，进行细胞死亡率计算。计算公式为：实验结果如图5所示，与对照组pbmc+target相比，本发明实施例1-8提供的8种人白细胞介素10-fc融合蛋白均能特异性杀伤sk-br-3肿瘤细胞，其中il-10-fc-a、il-10-fc-b、il-10-fc-d、il-10-fc-g的杀伤能力较强，细胞死亡率均在60％以上。实验例5、人白细胞介素10-fc融合蛋白在小鼠h1975肿瘤模型中的药效1、实验动物：种属品系：musmusculus，ncg，小鼠周龄：6-8周实验动物提供商:江苏集萃药康生物科技有限公司。2、细胞培养：用含有灭活的10％胎牛血清，100u/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素以及2mm谷氨酰胺的rpmi-1640培养基在37℃、5％co2的培养箱中培养肿瘤细胞，每隔3至4天待细胞长满后分瓶传代，将处于对数生长期的肿瘤细胞用于体内肿瘤的接种。3、肿瘤细胞的接种与分组：将h1975用pbs洗涤细胞两次，然后重悬肿瘤细胞于pbs，得到nci-h1975人非小细胞肺癌细胞，并将nci-h1975人非小细胞肺癌细胞接种于pbmc人源化的雌性nod/scid小鼠皮下，细胞接种量为5x10e6/小鼠；pbmc来源于正常人外周血，于h1975细胞接种前三天接种至荷瘤鼠体内，2x10e6/小鼠。在肿瘤接种后待肿瘤生长至约100mm3时分组给药，共6组，每组8只动物，分别为溶媒对照组、ril-10组、il-10-fc-a组、il-10-fc-b组、il-10-fc-d组、il-10-fc-g组(1mg/kg，i.p.，biw×4weeks)。4、检测指标：每周使用游标卡尺对肿瘤体积进行2次的测量，测量肿瘤的长径和短径，其体积计算公式为：体积＝0.5×长径×短径2；记录荷瘤鼠肿瘤体积的变化与给药时间的关系，实验结果如图6所示。通过图6中数据显示，与溶酶对照组相比，明显给药组对肿瘤生长的抑制能力较强，与给药il-10相比，随着时间的延长，给药本发明实施例1提供的il-10-fc-a、给药本发明实施例2提供的il-10-fc-b、给药本发明实施例3提供的il-10-fc-d和给药本发明实施例4提供的il-10-fc-g对肿瘤生长的抑制作用都比较强，对肿瘤生长的抑制效果明显优于人白细胞介素10。本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。序列表<110>北京东方百泰生物科技有限公司<120>一种人白细胞介素10-fc融合蛋白及其医药用途<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>160<212>prt<213>人工序列(homosapiens)<400>1serproglyglnglythrglnsergluasnsercysthrhisphepro151015glyasnleuproasnmetleuargaspleuargaspalapheserarg202530vallysthrphepheglnmetlysaspglnleuaspasnleuleuleu354045lysgluserleuleugluaspphelysglytyrleuglycysglnala505560leuserglumetileglnphetyrleuglugluvalmetproglnala65707580gluasnglnaspproaspilelysalahisvalasnserleuglyglu859095asnleulysthrleuargleuargleuargargcyshisargpheleu100105110procysgluasnlysserlysalavalgluglnvallysasnalaphe115120125asnlysleuglnglulysglyiletyrlysalametserglupheasp130135140ilepheileasntyrileglualatyrmetthrmetlysileargasn145150155160<210>2<211>227<212>prt<213>人工序列(homosapiens)<400>2asplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuglugly151015glyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumet202530ileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhis354045gluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluval505560hisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyr65707580argvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasngly859095lysalatyralacysalavalserasnlysalaleuproalaproile100105110glulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnval115120125tyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalser130135140leuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglu145150155160trpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpropro165170175valleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrval180185190asplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmet195200205hisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuser210215220proglylys225<210>3<211>232<212>prt<213>人工序列(homosapiens)<400>3gluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocysproala151015progluleugluglyglyproservalpheleupheproprolyspro202530lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval354045valaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrval505560aspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglugln65707580tyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln859095asptrpleuasnglylysalatyralacysalavalserasnlysala100105110leuproalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnpro115120125arggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthr130135140lysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproser145150155160aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr165170175lysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr180185190serlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphe195200205sercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys210215220serleuserleuserproglylys225230<210>4<211>30<212>prt<213>人工序列(homosapiens)<400>4glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglysergly151015glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser202530<210>5<211>228<212>prt<213>人工序列(homosapiens)<400>5gluarglyscyscysvalglucysproprocysproalaproproval151015alaglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleu202530metileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalser354045h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