一种快速检测白色念珠菌的试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种快速检测白色念珠菌的试剂盒。

背景技术：

白色念珠菌(candidaalbicans)是最重要的人类机会性致病真菌，通常存在于正常人皮肤和黏膜表面，数量很少，不引起疾病，而当机体免疫功能下降或菌群失调时，白色念珠菌大量繁殖并引起疾病，概括起来分为黏膜皮肤念珠菌病和侵袭性或深部器官念珠菌病两大类。

黏膜皮肤念珠菌病主要包括鹅口疮、指间糜烂、类丘疹、甲沟炎和妇科念珠菌病。其中，以口腔及外阴阴道念珠菌病最为常见，其特点是在患处有一层白色的容易被刮下的菌膜。口腔念珠菌病(又名鹅口疮)多发于2岁以内的婴幼儿，成人较少见。外阴阴道念珠菌病(vvc)是仅次于细菌性阴道炎的第二位阴道感染，全球75％的妇女一生中至少有一次念珠菌感染，其中的5％将会患上复发性外阴阴道念珠菌病。

侵袭性或深部器官念珠菌病是指白色念珠菌通过上皮细胞进入体循环造成的严重疾病，如菌血症、支气管肺炎和脑膜炎等，通常发生于术后和免疫功能不全的病人中。其中，菌血症是侵袭性念珠菌病最常见的症状，念珠菌血症占院内血流感染(bsis)中第四位，会随着体液循环定植到腹腔、肺部、胆囊和其它深部器官，引起更加严重的疾病，总病死率高达50％。随着广谱抗生素、免疫抑制剂的广泛使用，侵袭性念珠菌病发病率越来越高，而同时侵入性治疗(如气管插管机械通气、全胃肠外营养等)也是重要的危险因素。

侵袭性念珠菌病诊断困难，前期症状通常是持续的低烧，而且传统的鉴定金标准即培养法需要至少两天的时间才能得到实验结果，常常使得患者得不到及时的治疗导致病死率较高。pcr、实时荧光pcr和免疫定量法等分子生物学技术也被用于白色念珠菌的检测,但这些方法相对复杂。

因此，提供一种能够实现实时快速高特异性检测白色念珠菌的试剂盒是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种快速检测白色念珠菌的试剂盒，本试剂盒采用独特的缓冲体系，具有扩增兼容性较强的优点，无需彻底去除蛋白等杂质，便能进行高效特异扩增，具有敏感、快速、简便、实时检测白色念珠菌的特点。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速检测白色念珠菌的特异性引物对，特异性引物对的核苷酸序列如下：

fft：5’-gtcaaagcgatcccgccttactgagcgtcgtttctccct-3’；seqidno.1；

bt：5’-cattccgccctagcgaaactggatatacgtggtagacgttgc-3’；seqidno.2；

if：5’-ctcaacaccaaacccagcgg-3’；seqidno.3；

ib：5’-acattgcttgcggcg-3’；seqidno.4。

一种快速检测白色念珠菌的试剂盒，包含上述特异性引物对。

一种快速检测白色念珠菌的试剂盒，包括试剂一、试剂二和封闭剂；

其中，试剂一包含引物ft、bt，引物if、ib，bstdna聚合酶，dntp和指示剂；试剂二包含硫酸铵、硫酸镁、氯化钾、tween-20和甜菜碱，ph8.8；封闭剂为石蜡。

优选地，最终工作体系中，各试剂浓度为：

ft、bt各1.6μm，if、ib各0.8μm，dntp各1.4mm，bstdna聚合酶8u，tris-hcl20.0mm,硫酸铵10mm，氯化钾50mm，硫酸镁8mm，tween-200.1％，甜菜碱0.8m，ph8.8。

优选地，指示剂包括ph指示剂；ph指示剂为甲酚红-苯酚红指示剂，最终工作体系中，甲酚红浓度0.08mm，苯酚红浓度0.02mm。

本发明试剂盒中的试剂可利用一种一元包装诊断试剂包装进行储存，一元包装诊断试剂包装包括检测管、检测管盖、放置槽和覆膜；其中，检测管为一端开口，另一端封闭的中空反应管；检测管盖与检测管相适配，连接在检测管的开口端，可封闭检测管，检测管与检测管盖一体成型；检测管盖内侧设置放置槽，放置槽与检测管盖一体成型；覆膜为ppe薄膜，覆盖在放置槽上。

本发明将试剂一置于检测管盖上的放置槽内，然后利用覆膜对放置槽进行封口，并将试剂二和封闭剂放置到检测管内底部，最后盖上检测管盖，完成试剂盒的组装。

气溶胶污染是困扰整个核酸扩增领域的难题，聚合酶螺旋反应扩增效率高，反应剧烈，不免会造成气溶胶污染，将封闭剂在反应前加入到反应管中，反应过程中熔化成液体覆盖反应液，阻止了气溶胶的挥发，并且对扩增反应无影响，反应完成后会再次凝结成固体，永久封闭反应液，杜绝了产物污染。

优选地，试剂盒的工作体系为25μl，包括：试剂一1μl，ph为8.8的试剂二12.5μl和dna模板11.5μl。

进一步优选地，试剂一的溶剂为水和/或玻璃化液。(本发明中的溶液除特别注明外溶剂均为水)

玻璃化液选自二甲基亚砜、甲酰胺、乙二醇(eg)、丙二醇、丙三醇等试剂中任意2种以上的组合；或者选自efs30玻璃化液、efs40玻璃化液、edfs30玻璃化液、edfs40玻璃化液、edfsf30玻璃化液或edfsf40玻璃化液。

efs30玻璃化液中含有30％v/veg，70％v/vfs溶液；

efs40玻璃化液中含有40％v/veg，60％v/vfs溶液；

edfs30玻璃化液中含有15％v/veg，15％v/vdmso，70％v/vfs溶液；

edfs40玻璃化液中含有20％v/veg，20％v/vdmso，60％v/vfs溶液；

fs溶液：300g/l聚蔗糖添加0.5mol/l蔗糖，经pbs缓冲液溶解成fs溶液。

edfsf30玻璃化液中含有15％v/veg，15％v/vdmso，70％v/vfsf溶液；

edfsf40玻璃化液中含有20％v/veg，20％v/vdmso，60％v/vfsf溶液；

fsf溶液：300g/l聚蔗糖添加0.5mol/l蔗糖，经pbs缓冲液溶解后，加20％胎牛血清后制成fsf溶液。

进一步地，试剂一置于检测管盖上的放置槽内后，晾干或烘干。

部分试剂经玻璃化后可以室温储存运输，不依赖冷链运输和低温保存。

利用上述试剂盒快速检测白色念珠菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用chelex裂解液，加热提取待检测样品的核酸；(2)以步骤(1)核酸为模板加入试剂盒的试剂一中，后与试剂二进行混合，加入封闭液防止污染；

(3)在65-67℃的条件下，恒温扩增30-60min，显色法观察判断结果和/或利用实时浊度法进行检测。

优选地，步骤(1)将200μl样本或样本稀释液加入2mlchelex裂解液，充分混匀，裂解条件为90℃-95℃加热10min，冷却后的上清液即可作为待扩增的核酸模板

chelex裂解液为5.0gchelex-100和1.0mltritonx-100溶于100mlte缓冲液(tris10mm,edta1mm)中制成。

其中，显色法检测：反应体系中添加有ph值指示剂，恒温扩增反应结束后，冷却至室温后观察结果，检测管变黄表示待测样本中存在白色念珠菌基因(阳性)，检测管颜色为红色表示待测样本中不存在白色念珠菌基因(阴性)。如果阴性对照管变为黄色，或者阳性对照管50分钟内颜色为红色，则本次检测结果无效，应重新检测。

显色法检测原理为：当dna聚合酶将一个脱氧核糖核苷酸分子结合到新合成的dna双链上时，会生成一个氢离子作为副产物，随着反应的进行会产生大量的氢离子，氢离子浓度的增加会使得反应体系的ph值降低。将ph指示剂溶液加于反应体系中，阳性反应变为黄色，阴性对照溶液为红色。

实时浊度法检测：在psr反应过程中形成mg2p2o7即焦磷酸镁，为白色沉淀，发生反应式如下:

(dna)n-1+dntp→(dna)n+p2o7^4-

p2o7^4-+2mg²⁺-→mg2p2o7↓。

据此反应原理，实时浊度仪每隔6秒测定反应管的浊度并绘制成曲线来判断反应的阴阳性。形成反应曲线--s型折线，则为阳性；未形成明显反应曲线—无s型折线，则为阴性。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种快速检测白色念珠菌的试剂盒，采用独特的缓冲体系，具有扩增兼容性较强的优点，无需彻底去除蛋白等杂质，便能进行高效特异扩增，具有敏感、快速、简便、实时检测白色念珠菌的特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为白色念珠菌检测引物设计；

a.its2基因的部分序列，引物被下划线；b.引物序列；

图2附图为一元包装诊断试剂包装的结构示意图；

图3附图为实时浊度法特异性检测结果；

图4附图为显色法特异性检测结果；

图5附图为实时浊度法敏感性检测结果；

1-7：从c.albicansatcc24433提取的纯核酸做十倍梯度稀释(从69.0ng/μl到0.069pg/μl)；8：阴性对照(纯水)；

图6附图为显色法敏感性检测结果；

1-7：从c.albicansatcc24433提取的纯核酸做十倍梯度稀释(从69.0ng/μl到0.069pg/μl)；8：阴性对照(纯水)；

图7附图为pcr法敏感性检测结果；

1-7：从c.albicansatcc24433提取的纯核酸做十倍梯度稀释(从69.0ng/μl到0.069pg/μl)；8：阴性对照(纯水)；pcr产物大小为263bp；

图8附图为使用实施例1显色法检测临床样本结果；

1-100：临床样本1-100号；101：阴性对照(纯水)；102：阳性对照(c.albicansatcc24433)。

图9附图为部分样本(1-30号)4种方法的检测结果，其中培养法图示仅代表菌落颜色。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中chelex-100、甜菜碱，sigma公司；硫酸镁、氯化钾、氢氧化钠、edta、硫酸铵，国药集团化学试剂有限公司；tris-hcl，上海生科生物科技有限公司；tritonx-100，北京美莱博医学科技有限公司；dntp，pharmacia公司；2×tapmix试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖，amresco公司。

实施例1

1.引物设计

根据白色念珠菌its2基因全长序列(no.kp675666.1)，设计快速检测白色念珠菌的特异性引物对：

ft：5’-gtcaaagcgatcccgccttactgagcgtcgtttctccct-3’；seqidno.1；

bt：5’-cattccgccctagcgaaactggatatacgtggtagacgttgc-3’；seqidno.2；

if：5’-ctcaacaccaaacccagcgg-3’；seqidno.3；

ib：5’-acattgcttgcggcg-3’；seqidno.4。

引物序列及其在靶基因上的位置如图1所示，引物包括主引物ft、bt和加速引物if、ib，ft与bt的3’端(f与b部分，大写字母)和靶序列its2基因互补(序列282–299；437–417)，ft与bt的5’端(tr与t部分，小写字母)与靶序列互补(序列359–379)，加速引物if和ib(序列323–304,402–416)作为辅引物也被用来its2基因的扩增。

2.dna模板的制备

为评价白色念珠菌检测的特异性，以c.albicansatcc24433作为阳性对照，纯水作为阴性对照，对14株真菌进行检测。

检测前取各组真菌菌液200μl，加入chelex裂解液2ml，混匀后，置于恒温扩增检测仪，95℃加热10min，取出凉至室温后，即可作为后续检测dna模板。

dna模板分组如下：

1：c.albicansatcc24433；2：candidaglabrataatcc2001；3：candidatropicaliscgmcc2.3967；4：candidaparapsilosiscgmcc2.3962；5：candidakruseicgmcc2.1047；6：cryptococcusneoformansatcc66031；7：candidametapsilosisatcc96144；8：saccharomycescerevisiaecgmcc2.3889；9：debaryomyceshanseniicgmcc2.3948；10：kluyveromycesmarxianuscgmcc2.3959；11：metschnikowiapulcherrimacgmcc2.3776；12：pichiamembranifacienscgmcc2.4060；13：pichiaanomalacgmcc2.1819；14：kluyveromycesmarxianuscgmcc2.3959；15：trichosporoncutaneumcgmcc2.2163；16：阴性对照(纯水)。

3.扩增检测

试剂盒包含试剂一、试剂二和封闭剂；试剂一包含引物ft、bt，引物if、ib，bstdna聚合酶，dntp和指示剂，溶剂为efs30玻璃化液；试剂二包含硫酸铵、硫酸镁、氯化钾、tween-20和甜菜碱，ph8.8；封闭剂为石蜡。

最终工作体系中，各试剂浓度为：

ft、bt各1.6μm，if、ib各0.8μm，dntp各1.4mm，bstdna聚合酶8u，tris-hcl20.0mm，硫酸铵10mm，氯化钾50mm，硫酸镁8mm，tween-200.1％，甜菜碱0.8m，ph8.8。

指示剂为甲酚红-苯酚红指示剂，最终工作体系中，甲酚红浓度0.08mm，苯酚红浓度0.02mm。

试剂盒的工作体系为25μl，其中，试剂一1μl，ph为8.8的试剂二12.5μl，dna模板11.5μl。

试剂盒中的试剂利用一元包装诊断试剂包装进行储存，如图2所示，包括检测管1、检测管盖3、放置槽4和覆膜2；其中，检测管1为一端开口，另一端封闭的中空反应管；检测管盖3与检测管1相适配，连接于检测管1的开口端，可封闭检测管1，检测管1与检测管盖3一体成型；检测管盖3内侧设置放置槽4，放置槽4与检测管盖3一体成型；覆膜2为ppe薄膜，覆盖在放置槽4上。

将试剂一1μl置于检测管盖3上的放置槽4内，晾干后利用覆膜2对放置槽4进行封口，并将试剂二12.5μl放置到检测管1底部，再加入一滴封闭剂石蜡，最后盖上检测管盖3，完成试剂盒的组装。

使用时撕去覆膜2，分别取出11.5μldna模板，滴加至检测管1上的检测管盖3上，扣上检测管盖3，倒置约10秒，将管盖上的液体用力甩至管底内。将各组检测管1置于实时浊度仪中，65℃恒温反应60min，取出，同时反应过程中切勿开盖。根据检测管的实时浊度并绘制成曲线(实时浊度法)，或观察检测管内液体颜色(显色法)。

如图3、4所示，实时浊度法与显色法得到相同结果，即白色念珠菌的dna检测结果呈阳性，其它14株真菌连同纯水检测结果呈阴性，表明本发明引物、试剂盒及检测方法在检测白色念珠菌时具有良好的特异性。

实施例2

比较实施例1中实时浊度法、显色法同传统pcr法在检测白色念珠菌中的敏感性，将从c.albicansatcc24433提取的纯核酸做十倍梯度稀释，从69.0ng/μl稀释到0.069pg/μl，作为dna模板。

实时浊度法、显色法检测同实施例1。

pcr反应使用0.5μm上游引物sap-f(seqidno.5)(5’-ctgctgatattactgttggttc-3’)和0.5μm下游引物sap-b(seqidno.6)(5’-ccaccaataccaacggtatc-3’)进行，12.5μl天根pcr反应mix，并加入与本发明实施例1中反应体系同量的dna模板。pcr反应按常规方法进行，退火温度设为55℃，产物电泳后照胶。

结果如图5-7所示，实时浊度法与显色法的检测限皆为6.9pg/μl，普通pcr法的检测限为69.0pg/μl，即本发明引物、试剂盒及检测方法敏感性是传统pcr法的十倍，结果表明本发明引物、试剂盒及检测方法在白色念珠菌检测中具有高度的敏感性。

实施例3

为评价本发明引物、试剂盒及检测方法的适用性，选择100名疑似为白色念珠菌感染的病人，并用4种方法对100个样本进行评价：

(1)临床上普遍采用的镜检法，即将分泌物样本简单处理后于显微镜下观察，看到出芽的酵母与假菌丝，可判断为感染念珠菌；

(2)科玛嘉显色培养法；

(3)实施例1实时浊度法；

(4)实施例1显色法。

在这100份临床样本中，实时浊度法与显色法(图8)均检测到42份阳性、58份阴性，结果与科玛嘉显色培养基培养法吻合，并纠正了临床上采用的镜检法的一些漏检与误检。

部分比较结果如图9所示，大部分样本4种方法都得出同样结果，只有少数有差别，如4、6、14号样本镜检为阳性结果，而实时浊度法、显色法与培养法皆为阴性结果，因此判断镜检为误诊；28号样本镜检为阴性结果，而实时浊度法、显色法与培养法皆为阳性结果，因此判断镜检为漏诊；2号样本镜检为阳性，实时浊度法、显色法结果皆为阴性，而科玛嘉显色培养基培养结果是光滑念珠菌(淡紫色)，光滑念珠菌与白色念珠菌表型基本一致，因此镜检无法区分开，实时浊度法、显色法的阴性检测结果又进一步证明了其良好的特异性。另对42株阳性菌株进一步做its2基因测序，结果上传到ncbi上比对，结果皆为白色念珠菌。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>中国检验检疫科学研究院

<120>一种快速检测白色念珠菌的试剂盒

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>39

<212>dna

<213>artificial

<400>1

gtcaaagcgatcccgccttactgagcgtcgtttctccct39

<210>2

<211>42

<212>dna

<213>artificial

<400>2

cattccgccctagcgaaactggatatacgtggtagacgttgc42

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<400>3

ctcaacaccaaacccagcgg20

<210>4

<211>15

<212>dna

<213>artificial

<400>4

acattgcttgcggcg15