一种松花粉掺伪的多重PCR鉴定方法及其专用引物组与试剂盒与流程

本发明涉及一种松花粉掺伪的多重pcr鉴定方法及其专用引物组与试剂盒。

背景技术：

松花粉又被称为松花、松黄，是指松属植物马尾松、云南松、油松、黑松、赤松或同属数种植物的干燥花粉，是我国传统食药兼用的花粉品种。松花粉性味甘平，归肝、脾经，具有润心肺益气、壮颜益志的功效。从古至今，我国重要的30多部中医传统著作中都有详细记载。松花粉含有游离氨基酸、多糖、维生素、黄酮、微量元素等多种成分，具有丰富的营养价值和多种生物活性，无论在临床应用还是保健品开发方面都具有广阔的前景。

随着市场对松花粉需求的不断增长，价格也不断攀升。由于蒲黄、玉米粉与松花粉的外观和颜色极为相似，蒲黄和玉米粉被掺入松花粉的情况时有发生，严重影响了松花粉产品质量的稳定性。目前药典中主要利用显微鉴别、水分检查、总灰分检查等来控制松花粉的质量，但这些方法对原料混杂及有混伪品掺入的情况很难进行鉴定。虽然近年来针对松花粉的质量评价方法也开展了一系列的研究，包括化学成分分析法、指纹图谱法、dna条形码等。但化学成分分析法、指纹图谱法需要松花粉进行前处理及特征化合物的提取等一系列复杂的操作过程，对实验仪器也有较高的要求。dna条形码技术可以对松花粉及其混伪品进行鉴定，但此方法每次测定时均需对样品进行条形码序列的扩增、测序，并需要构建邻接树，实验操作繁琐复杂，无法满足大量样品的快速检测。

因此，亟需一种更为简单有效的鉴定松花粉原料来源的方法以保证其产品的安全性和质量的稳定性。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，利用发现的松属松花粉来源植物的特异性序列设计了松花粉的特异性引物，并利用多重pcr建立了松花粉区别于玉米、蒲黄的鉴定方法。

具体发明内容如下：

本发明的第一个目的是提供一种用于松花粉掺伪的多重pcr鉴定的专用引物组。

一种松花粉掺伪的多重pcr鉴定的专用引物组，包括针对松花粉、蒲黄、玉米粉的叶绿体trnl-f基因设计的三条特异性正向引物和上述三种叶绿体trnl-f基因通用的一条反向引物。

其中，针对松花粉的叶绿体trnl-f基因的特异性正向引物，其核苷酸序列如seqidno.1所示；针对蒲黄的叶绿体trnl-f基因的特异性正向引物，其核苷酸序列如seqidno.2所示；针对玉米粉的叶绿体trnl-f基因的特异性正向引物，其核苷酸序列如seqidno.3所示；三种叶绿体trnl-f基因通用的一条反向引物，其核苷酸序列如seqidno.4所示。

松花粉的叶绿体trnl-f基因的核苷酸序列如seqidno：5所示；蒲黄的叶绿体trnl-f基因的核苷酸序列如seqidno：6所示；玉米粉的叶绿体trnl-f基因的核苷酸序列如seqidno：7所示。

松花粉的特异性正向引物pyf是根据图1中松花粉trnl-f基因序列第600～620位碱基序列设计的，与玉米和蒲黄相比，松花粉在3’末端有3个snp位点。蒲黄的特异性正向引物typf是根据图1中蒲黄trnl-f基因序列第231～250位置处的特异性碱基序列设计的。玉米的特异性正向引物zmf是根据图1中玉米trnl-f基因序列第782～800位置处的特异性碱基序列设计的。上述三种叶绿体trnl-f基因的通用反向引物命名为utr。

利用上述序列衍生的其他物种特异性引物序列也属于本发明的保护范围。所述衍生引物序列是指在本发明引物的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的序列。

本发明的第二个目的是提供一种用于松花粉掺伪的多重pcr鉴定的试剂盒，包括如前所述的引物组。

本发明的第三个目的是提供一种用于松花粉掺伪的多重pcr鉴定方法。

本发明所提供的用于松花粉掺伪的多重pcr鉴定方法，是用上述引物对待测松花粉原料的基因组dna进行多重pcr扩增，然后对多重pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，松花粉可以产生由其特异性引物pyf和utr扩增出的457bp的dna条带，玉米粉可以产生由其特异性引物zmf和utr扩增出的281bp的dna条带，蒲黄可以产生由其特异性引物typf和utr扩增出的745bp的dna条带。如果松花粉中掺有玉米或蒲黄，则不同物种的条带均会扩增出来，从而达到掺伪鉴定的目的。

琼脂糖凝胶电泳中，琼脂糖浓度优选为1％。

30μl多重pcr反应体系优选为：1μl(10ng)待测样品的基因组dna，1μl(0.33μm)引物pyf，1μl(0.33μm)引物typf，2μl(0.67μm)引物zmf，2μl(0.67μm)引物utr，8μl灭菌超纯水，15μl2×premixdnapolymerase(配方：3μl10×easytaqbuffer，2.4μl2.5mmdntps，0.6μleasytaqdnapolymerase,9μlh2o)。

多重pcr反应条件优选为：先94℃预变性4min；然后94℃30s，52℃30s，72℃60s，共35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温。

本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种用于松花粉掺伪的多重pcr鉴定方法，从而可达到准确鉴定松花粉原料来源的目的。虽然叶绿体trnl-f基因序列可以应用于植物种以上水平的分类和遗传关系研究，但由于花粉属于植物的雄性细胞，极少或几乎不含叶绿体，因此尚未有利用叶绿体trnl-f基因序列进行花粉原料来源鉴定的报道。虽然花粉极少或几乎不含叶绿体，但叶绿体是一种半自主性细胞器，其trnl-f由核基因编码，因此本发明的创造性在于利用trnl-f基因序列对花粉类原料的来源进行鉴定。采用本发明的方法在检测松花粉来源时无需对样品进行再次测序，只需经过dna提取和pcr扩增即可鉴定原料是否存在混伪品，可以检测1％的混伪品掺入，检测限为0.01ng。本发明可以解决松花粉市场上原料掺伪的问题，为松花粉原料来源的鉴别提供了客观标准，对于保证松花粉产品质量、规范松花粉市场秩序具有重要意义。

附图说明

图1为松花粉、玉米、蒲黄的叶绿体trnl-f序列的比对结果和引物相对位置图；

图2为松花粉、玉米、蒲黄的多重pcr鉴定结果。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明是基于发明人在叶绿体trnl-f基因序列发现了松花粉及其混伪品玉米、蒲黄的物种特异性序列而做出。本发明以下述实施例详细介绍利用多重pcr技术对松花粉混伪品的鉴别。

实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所有引物合成及序列测定工作均由赛默飞世尔(中国)科技有限公司完成。

实施例1

进行引物设计，并使用本发明的引物组用于松花粉掺伪的多重pcr鉴定。

一、设计用于松花粉掺伪检测的多重pcr专用引物

根据松花粉、蒲黄、玉米在叶绿体trnl-f基因中的特异性序列设计用于松花粉掺伪检测的多重pcr专用引物。

1松花粉、蒲黄、玉米在叶绿体trnl-f基因序列的扩增和比对

1.1提取松花粉、蒲黄、玉米的基因组dna

取适量的松花粉(采于云南、重庆、湖南、河北、山东)、蒲黄(购自中医世家)、玉米粉(购自市场)，液氮研磨至细粉末状后，用植物基因组dna提取试剂盒(dneasyplantminikit,qiagen)分别提取松花粉、蒲黄、玉米的基因组dna。

1.2pcr分别扩增松花粉、蒲黄、玉米的叶绿体trnl-f基因序列

20μlpcr反应体系为：1μl(10ng)松花粉、蒲黄、玉米的基因组dna，2μl(1μm)引物trnl，序列为5’-cgaaatcggtagacgctacg-3’(如seqidno：8所示)，2μl(1μm)引物trnf，序列为5’-atttgaactggtgacacgag-3’(如seqidno：9所示)，5μl灭菌超纯水，10μl2×easytaqsupermixdnapolymerase(配方：2μl10×easytaqbuffer，1.60μl2.5mmdntps，0.4μleasytaqdnapolymerase,6μlh2o)。

pcr反应条件为：先94℃预变性4min；然后94℃30s，58℃30s，72℃60s，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保温结束反应。

1.3多重序列比对

对pcr扩增产物进行双向直接测序，利用seqman软件对dna测序结果进行拼接。利用clustalwomega软件对松花粉、蒲黄、玉米的叶绿体trnl-f基因序列进行多重序列比对，结果如图1所示。松花粉的叶绿体trnl-f序列如序列表中seqidno：5所示，蒲黄的叶绿体trnl-f序列如序列表中seqidno：6所示，玉米粉的叶绿体trnl-f序列如序列表中seqidno：7所示。

2、分别设计松花粉、蒲黄、玉米的特异性引物

根据序列比对中发现的松花粉、蒲黄、玉米的特异性序列，在第600～620位碱基处设计松花粉的特异性引物pyf，序列为5’-aatccgttggctttatagac-3’(如seqidno：1所示)。在第231～250位碱基处设计蒲黄的特异性引物typf，序列为5’-taactggaatccctttatcg-3’(如seqidno：2所示)。在第782～800碱基处设计玉米的特异性引物zmf，序列为5’-tcaatgaatcttatgctattca-3’(如seqidno：3所示)。在第1059～1078位碱基处设计三条特异性引物共同的通用反向引物utr，序列为5’-cctctgctctaccaactgag-3’(如seqidno：4所示)。

二、松花粉、蒲黄、玉米的多重pcr鉴定

以松花粉、蒲黄、玉米及其混合品的基因组dna为模板，利用松花粉的特异性引物pyf，玉米的特异性引物zmf，蒲黄的特异性引物typf及通用的反向引物utr进行多重pcr扩增。其中松花粉采于云南、重庆、湖南、河北、山东，蒲黄购自中医世家药品超市，玉米粉购自市场。

30μl多重pcr反应体系优选为：1μl(10ng)待测样品的基因组dna，1μl(0.33μm)引物pyf，1μl(0.33μm)引物typf，2μl(0.67μm)引物zmf，2μl(0.67μm)引物utr，8μl灭菌超纯水，15μl2×premixdnapolymerase(配方：3μl10×easytaqbuffer，2.4μl2.5mmdntps，0.6μleasytaqdnapolymerase,9μlh2o)。

多重pcr反应条件为：先94℃预变性4min；然后94℃30s，52℃30s，72℃60s，共35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温结束反应。

取3μl多重pcr扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2(泳道1-4为不同品种的松花粉，泳道5-6为蒲黄，泳道7-8为玉米，泳道9-11为掺入蒲黄的松花粉，泳道12-14为掺入玉米粉的松花粉，泳道15-17为同时掺入蒲黄和玉米粉的松花粉)所示，松花粉样品均产生了由特异性引物pyf和utr扩增出的457bp的dna条带，蒲黄产生了由特异性引物typf和utr扩增出的745bp的dna条带，玉米粉产生了由特异性引物zmf和utr扩增出的281bp的dna条带。对于松花粉和蒲黄、松花粉和玉米粉两两混合的样品，则分别产生了相应物种的特异性条带。对于松花粉和玉米粉、蒲黄的三者混合品则产生了三种特异性条带。切胶回收三种特异性条带，经克隆测序确认三种特异性条带的序列与其trnl-f基因的相应序列完全一致。由此可以得出，利用本发明的引物及多重pcr技术可以实现对松花粉原料掺伪的准确鉴定。

实施例2

一种松花粉掺伪的多重pcr鉴定的试剂盒，其内容如下：

将0.33μm的松花粉叶绿体trnl-f基因的特异性引物pyf，0.33μm的蒲黄叶绿体trnl-f基因引物typf，0.67μm的玉米引物zmf，0.67μm的通用反向引物utr共同包装，得到用于30μl反应体系的松花粉掺伪的多重pcr鉴定试剂盒。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>烟台新时代健康产业有限公司

<120>一种松花粉掺伪的多重pcr鉴定方法及其专用引物组与试剂盒

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