一种溶瘤腺病毒的构建方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，特别是涉及一种溶瘤腺病毒的构建方法。
背景技术：
：溶瘤病毒(oncolyticvirus)，是指一类可以优先感染或者选择性杀伤肿瘤细胞的病毒，自然界中仅极少种类的病毒可以选择性的感染肿瘤细胞并对其杀伤，绝大多数病毒需要通过基因工程改造才能发挥溶瘤作用的。病毒具有消除肿瘤的疾病的新闻在20世纪初就被报道，起初研究者发现宫颈癌、伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤病人在感染某种病毒后肿瘤出现退化的现象。在20世纪中期，开始出现通过免疫接种或病毒感染来治疗癌症的方法，并取得了一定的效果。但是由于病毒改造技术有限、过强的免疫反应及并发症，导致临床应用几乎停滞不前。溶瘤腺病毒，是目前最为常用的一种溶瘤病毒，有多种策略改造可以增强溶瘤腺病毒的肿瘤靶向性，包括将腺病毒基因组中参与细胞周期节点调控的功能基因(如e1a或e1b)进行突变或(和)利用肿瘤特异性启动子调控e1a基因的靶向转录调控，利用不同血清型腺病毒或rgd基序改变溶瘤腺病毒进入肿瘤细胞方式的靶向转导调控，以及利用细胞载体将溶瘤腺病毒传送至远处的肿瘤部位。溶瘤腺病毒作为一种载体，输送免疫调节基因或治疗性基因，通过增强抗肿瘤免疫，或引起肿瘤细胞凋亡、自杀等产生协同抗肿瘤效应。那么，病毒在肿瘤细胞内的复制能力和对插入基因的表达量将会影响到溶瘤病毒的作用效果。目前，已经较为流行的溶瘤腺病毒obp301，利用端粒酶启动子tert启动腺病毒的e1a区通过ires连接e1b区，形成tert-e1a-ires-e1b结构的溶瘤腺病毒，在小鼠体内获得了一定的溶瘤效果。技术实现要素：本发明主要解决的技术问题是提供一种溶瘤腺病毒的构建方法，通过tert启动子启动5型腺病毒的e1区的基因组序列，使用5型腺病毒基因组上的一段序列将e1b基因和e1a基因连接，通过改造方法获得的溶瘤腺病毒的复制能力和杀肿瘤细胞的能力要强于tert-e1a-ires-e1b结构的溶瘤腺病毒，而对非肿瘤细胞的也是安全的。为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种溶瘤腺病毒的构建方法，包括以下步骤：步骤一：在ncbi数据库中调取humanmastadenovirusc全基因组序列信息及tert-p启动子序列信息，根据tert-e1a-fblink-e1b序列信息，在通用生物系统(安徽)有限公司进行全基因合成至puc57载体，得到puc57-tert-e1a-fblink-e1b质粒；步骤二：设计引物对puc57-tert-e1a-fblink-e1b质粒进行扩增；步骤三：腺病毒载体经sacii酶切；步骤四：同源重组法构建fv012-tert-e1a-fblink-e1b溶瘤腺病毒载体；步骤五：将步骤四得到的载体和腺病毒骨架质粒pbhg转染到细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒。本发明为解决其技术问题所采用的进一步技术方案是：进一步地说，所述tert的基因序列如seqidno.1所示。进一步地说，所述e1a的基因序列如seqidno.2所示。进一步地说，所述fblink的基因序列如seqidno.3所示。进一步地说，所述e1b的基因序列如seqidno.4所示。进一步地说，所述腺病毒载体为腺病毒载体fv012。本发明的有益效果具有以下几点：1、本发明所构建的tert-e1a-fblink-e1b的对肿瘤(以肝癌细胞hep3b为例)的杀伤效果要优于tert-e1a-ires-e1b结构的溶瘤腺病毒；2、本发明所构建的tert-e1a-fblink-e1b对正常细胞无明显的杀伤作用，即该病毒也是相对安全的；3、本发明所构建的tert-e1a-fblink-e1b的对肿瘤细胞的活性抑制效果要优于tert-e1a-ires-e1b结构的溶瘤腺病毒。附图说明图1是本发明细胞出毒图片(cpe100x明场)；图2是本发明细胞出毒图片(cpe100x绿色荧光)；图3是本发明所构建的tert-e1a-fblink-e1b与tert-e1a-ires-e1b对肿瘤细胞的杀伤实验结果图；图4是本发明所构建的tert-e1a-fblink-e1b与tert-e1a-ires-e1b对细胞的活性抑制结果图(fv154为溶瘤腺病毒)；图5是本发明小鼠肿瘤内注射溶瘤腺病毒实验结果图；图6是本发明两个试验组和一个对照组中小鼠肿瘤体积变化曲线图。具体实施方式下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。实施例1：puc57-tert-e1a-fblink-e1b质粒扩增1)在ncbi数据库中调取humanmastadenovirusc全基因组序列信息及tert-p启动子序列信息；2)根据tert-e1a-fblink-e1b序列信息，在通用生物系统(安徽)有限公司进行全基因合成至puc57载体，并命名为：puc57-tert-e1a-fblink-e1b；3)pcr引物信息primerf:5’-tttgtctagggccgcggggactttgaccgtttacgtggagacttggcccctccctcggg-3’primerr:5’-agaaaaacacctgggcgtcaatctgtatcttcatcgctagagccaaac-3’注：primerf和primerr未划线部分是腺病毒载体fv012同源序列，划线处是tert-e1a-fblink-e1b特异性引物序列。4)pcr体系配制5)pcr反应条件6)琼脂糖凝胶电泳及胶回目的产物a)1％琼脂糖凝胶，220v电压条件下电泳30min；b)电泳结束后将胶块放置在切胶台上，切下目的片段放入已灭菌1.5mlep管中；c)按照tiangen普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒说明书进行dna回收操作；d)将回收的dna测定其浓度及260/280值，储存于-20℃备用。实施例2：腺病毒载体fv012酶切名称加入量腺病毒载体fv0121ngsacii(neb)1μl10xbuffer2μltotalddh2o补齐至20ul酶切反应条件37℃/30min，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳。实施例3：琼脂糖凝胶电泳及胶回目的产物1)1％琼脂糖凝胶，220v电压条件下电泳30min；2)电泳结束后将胶块放置在切胶台上，切下目的片段放入已灭菌1.5mlep管中；3)按照tiangen普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒说明书进行dna回收操作；4)将回收的dna测定其浓度及260/280值，储存于-20℃备用。实施例4：同源重组法构建fv012-tert-e1a-fblink-e1b溶瘤腺病毒载体链接体系如下：名称加入量腺病毒载体fv012-sacii酶切回收载体10ngtert-e1a-fblink-e1b基因pcr扩增回收片段4ng5xceiibuffer4μlexnaseii(5u/μl)2μltotalddh2o补齐至20μl试剂盒：cloneexpressiionestepcloningkit，vazyme，c112室温条件下，反应30min。实施例6：连接产物转化及涂板5)50ultop10感受态细胞放冰上融化，取5ul连接产物和感受态细胞混匀；6)冰浴30min，42℃水浴热击90s，继续冰浴2min；7)转化产物转移到含500ul无抗性lb液体培养基的ep管中，置于摇床中，37℃、250rpm/min培养30min；8)将含有转化菌的ep管，1000g离心1min；9)在超净台中倒去上清，留下约100ul培养基将沉淀混匀，均匀涂于lb抗性培养平板上；10)将平板倒扣置于37℃细菌培养箱培养过夜(12～16h)，得重组质粒。实施例7：连接产物鉴定1)从上述平板中挑取单克隆菌落于6mllb液体培养基中，37℃、250转/分，培养过夜(12～16h)；2)按照tiangen质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取操作；3)提取的质粒由苏州金唯智生物科技有限公司进行测序验证；4)测序结果和理论序列进行比对一致，该结果证明重组质粒构建成功。实施例8：溶瘤腺病毒包装1)转染前24h，用0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的hek293细胞(由本公司提供)，以含10％fbs的dmem培养基调整细胞密度为达30％～40％，重新接种于细胞培养瓶中，37℃、5％co2培养箱内培养，24h左右待细胞密度达到50％～60％时即可用于转染，细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数；2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清omem培养基；3)向一灭菌离心管中加入所制备的dna溶液(重组质粒5ug和辅助质粒pbhg质粒5ug)与omem培养基混合均匀，调整总体积为50ul，在室温下温育5分钟；4)将lipofectamine2000试剂(购置于赛默飞世尔科技(中国)有限公司)轻柔摇匀，取10ullipofectamine2000试剂在另一离心管中与50ulomem混合，在室温下温育5分钟；5)把稀释后的dna溶液与稀释后的lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡；6)混合后，在室温下温育20分钟，以便形成dna与lipofectamine2000稀释液的转染复合物；7)将dna与lipofectamine2000稀释液的转染复合物移至hek293细胞的培养液中，混匀，于37℃，5％co2细胞培养箱中培养；8)培养6h～8h后倒去含有转染复合物的培养基，每瓶细胞加入2ml的pbs液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染复合物，然后倒去；9)每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基5ml，于37℃、5％co2培养箱内继续培养；10)每天观察转染后细胞生长状况，若细胞培养基明显变黄，酌情补加适量的新鲜全培养液，转染后大约10～15天时，hek293细胞开始飘落，部分细胞出现细胞病变(cytopathiceffect，cpe)，即得溶瘤腺病毒。实施例9：溶瘤腺病毒杀伤活性验证实验1)感染病毒：24孔板每孔加入500000个细胞(hep3b)，24h后，按照moi值0，0.1，1，10分别加入病毒感染2h，之后换含2％fbs的培养基培养5天；2)细胞固定：将细胞用pbs清洗2-3次，加入3％戊二醛固定10min，再用pbs清洗；3)考马斯亮蓝染色：将0.2％考马斯蓝r-250溶液加入细胞中染色30min，之后用pbs洗去多余的染液，观察细胞着色情况，拍照。如图3的实验结果显示，本发明所构建的tert-e1a-fblinke1b的对肿瘤(以肝癌细胞hep3b为例)的杀伤效果要优于tert-e1a-ires-e1b结构的溶瘤腺病毒，对正常细胞非肿瘤细胞hacat没有明显的杀伤作用，即该病毒也是相对安全的。实施例10：溶瘤腺病毒mtt杀伤活性验证实验1)感染病毒：96孔板每孔加入5000个细胞，24h后，按照moi值0，0.1，1加入病毒感染2h，之后换含2％fbs的培养基；2)mtt结合：分别在病毒感染后第1、2、3、4、5天，每孔加入10ul5mg/ml的mtt，至于37℃5％co2培养箱培养；3)酶标仪检测：4h后，吸弃培养液，每孔加入150μldmso终止反应；振荡器低俗振荡5-10min，酶标仪490nm检测od值。实施例11：溶瘤腺病毒复制活性检测实验1)感染病毒：24孔板每孔加入500000个细胞(hep3b)，24h后，按照moi值1分别加入病毒感染2h；吸弃培养基，pbs清洗3次，每孔加入1ml含2％fbs的培养基。2)细胞收集：分别在病毒感染后第0、1、2、3天，收集细胞于离心管中。3)病毒收集：将收集的细胞沉淀与-70℃/37℃反复冻融、振荡3次，离心收集上清，终点稀释法检测滴度。4)滴度检测：a.在实验前24小时，向96孔板的每一个孔加入100μlhek293细胞悬液，约含1ⅹ103个细胞；b.准备12个无菌的ep管，在第一次ep管中加入990μl的完全培养液，其余的11个管子中各加入900μl的完全培养基；c.待测病毒液的稀释：取10μl腺病毒原液加入990μl的ep管中做1：100稀释(10-2)；然后以此为起点，再取100μl稀释液加入到900μl的ep管中做1：10稀释(10-3)，直至稀释到10-13；d.从培养箱中取出96孔板，在显微镜下确定每孔的细胞均生长良好。吸弃旧培养液，然后依次将10-13至10-6稀释的病毒液加入96孔板中，每一稀释度占用一行，每一行的第1-10孔每孔加入90μl病毒稀释液，而每一行的第11-12孔均加入90μl不含病毒的完全培养基作为对照；e.将96孔板置于37℃、5％co2细胞培养箱中继续培养；f.10d后观察细胞病变现象，并对cpe孔进行计数，计算每一行的阳性率，计算病毒滴度(spearman-karbermethod)。g.病毒滴度计算方法病毒滴度＝10(x+0.8)(pfu/ml)：x＝10-1到10-13次稀释度下cpe阳性率总和公式使用条件：a.阴性对照没有cpe和生长抑制现象；b.加入最小稀释浓度病毒液的孔均有cpe。由图4的实验结果显示，本发明所构建的tert-e1a-fblink-e1b的对细胞的活性抑制效果要优于tert-e1a-ires-e1b结构的溶瘤腺病毒。实施例12：小鼠肿瘤内注射溶瘤腺病毒实验本实验分三组，一组为实验组ovad154(tert-e1a-fblinke1b)，tert-e1a-ires-e1b，一组为pbs组，实验操作步骤如下：1)选择6周裸鼠用于本次实验，每组6只，每只小鼠接种含有5e+6个肺癌细胞h1299-luc(含荧光素酶标记细胞)；2)细胞接种2周后，肿瘤体积约为200mm3时用于实验(体积计算：长*宽*宽)；3)每只小鼠肿瘤内注射1e+8pfu的溶瘤腺病毒，对照组注射1xpbs100ul；4)每隔一天注射一次，连续处理三次，定期测量小鼠肿瘤体积；5)两周后，通过活体成像观察小鼠瘤的变化。由图5和图6的试验结果可知，试验组小鼠体内的肿瘤体积要显著小于对照组小鼠体内的肿瘤体积，且tert-e1a-fblinke1b试验组小鼠体内的肿瘤体积小于tert-e1a-ires-e1b试验组小鼠体内的肿瘤体积。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。序列表<110>复百澳（苏州）生物科技有限公司<120>一种溶瘤腺病毒的构建方法<130>2019<141>2019-11-12<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>455<212>dna<213>人类端粒酶逆转录酶(homosapienshuman)<400>1tggcccctccctcgggttaccccacagcctaggccgattcgacctctctccgctggggcc60ctcgctggcgtccctgcaccctgggagcgcgagcggcgcgcgggcggggaagcgcggccc120agacccccgggtccgcccggagcagctgcgctgtcggggccaggccgggctcccagtgga180ttcgcgggcacagacgcccaggaccgcgcttcccacgtggcggagggactggggacccgg240gcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtc300ccgacccctcccgggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcc360tttccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgc420gcacgtgggaagccctggccccggccacccccgcg455<210>2<211>986<212>dna<213>e1a(humanmastadenovirusc)<400>2atgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttg60gaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaacca120cctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggag180gcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgactta240ctcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgag300cagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatc360gatcttacctgccacgaggctggctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgag420gagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcac480cggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggc540atgtttgtctacagtaagtgaaaattatgggcagtgggtgatagagtggtgggtttggtg600tggtaattttttttttaatttttacagttttgtggtttaaagaattttgtattgtgattt660ttttaaaaggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaa720gacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgt780ctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctg840agatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggc900gtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggact960tgagctgtaaacgccccaggccataa986<210>3<211>168<212>dna<213>fblink(humanmastadenovirusc)<400>3ggtgtaaacctgtgattgcgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgta60agtttaataaagggtgagataatgtttaacttgcatggcgtgttaaatggggcggggctt120aaagggtatataatgcgccgtgggctaatcttggttacatctgacctc168<210>4<211>1796<212>dna<213>e1b(humanmastadenovirusc)<400>4atggaggcttgggagtgtttggaagatttttctgctgtgcgtaacttgctggaacagagc60tctaacagtacctcttggttttggaggtttctgtggggctcatcccaggcaaagttagtc120tgcagaattaaggaggattacaagtgggaatttgaagagcttttgaaatcctgtggtgag180ctgtttgattctttgaatctgggtcaccaggcgcttttccaagagaaggtcatcaagact240ttggatttttccacaccggggcgcgctgcggctgctgttgcttttttgagttttataaag300gataaatggagcgaagaaacccatctgagcggggggtacctgctggattttctggccatg360catctgtggagagcggttgtgagacacaagaatcgcctgctactgttgtcttccgtccgc420ccggcgataataccgacggaggagcagcagcagcagcaggaggaagccaggcggcggcgg480caggagcagagcccatggaacccgagagccggcctggaccctcgggaatgaatgttgtac540aggtggctgaactgtatccagaactgagacgcattttgacaattacagaggatgggcagg600ggctaaagggggtaaagagggagcggggggcttgtgaggctacagaggaggctaggaatc660tagcttttagcttaatgaccagacaccgtcctgagtgtattacttttcaacagatcaagg720ataattgcgctaatgagcttgatctgctggcgcagaagtattccatagagcagctgacca780cttactggctgcagccaggggatgattttgaggaggctattagggtatatgcaaaggtgg840cacttaggccagattgcaagtacaagatcagcaaacttgtaaatatcaggaattgttgct900acatttctgggaacggggccgaggtggagatagatacggaggatagggtggcctttagat960gtagcatgataaatatgtggccgggggtgcttggcatggacggggtggttattatgaatg1020taaggtttactggccccaattttagcggtacggttttcctggccaataccaaccttatcc1080tacacggtgtaagcttctatgggtttaacaatacctgtgtggaagcctggaccgatgtaa1140gggttcggggctgtgccttttactgctgctggaagggggtggtgtgtcgccccaaaagca1200gggcttcaattaagaaatgcctctttgaaaggtgtaccttgggtatcctgtctgagggta1260actccagggtgcgccacaatgtggcctccgactgtggttgcttcatgctagtgaaaagcg1320tggctgtgattaagcataacatggtatgtggcaactgcgaggacagggcctctcagatgc1380tgacctgctcggacggcaactgtcacctgctgaagaccattcacgtagccagccactctc1440gcaaggcctggccagtgtttgagcataacatactgacccgctgttccttgcatttgggta1500acaggaggggggtgttcctaccttaccaatgcaatttgagtcacactaagatattgcttg1560agcccgagagcatgtccaaggtgaacctgaacggggtgtttgacatgaccatgaagatct1620ggaaggtgctgaggtacgatgagacccgcaccaggtgcagaccctgcgagtgtggcggta1680aacatattaggaaccagcctgtgatgctggatgtgaccgaggagctgaggcccgatcact1740tggtgctggcctgcacccgcgctgagtttggctctagcgatgaagatacagattga1796当前第1页1 2 3