一种能在肠道中降解尿酸的工程益生菌及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种通过基因工程手段重组表达尿酸降解相关酶类的益生菌的制备方法及其应用。
背景技术：
：高尿酸血症是一种慢性代谢性疾病，临床表现为血尿酸水平高于正常范围(男性>420μmol/l，女性>360μmol/l)。高尿酸血症患者除因尿酸结晶引发痛风外，还可能发展为肾病、尿路结石，心血管紊乱，脑血管紊乱等。正常生理状态下，人体内尿酸总量约1200mg，尿酸的排泄主要有两种途径，2/3左右通过肾脏以尿液形式排出，1/3以肠道形式排泄的。越来越多的临床研究数据表明，尿酸的肠道途径代谢障碍是导致高尿酸血症的重要因素。成人的肠道中大约有1.5-2.5kg的内容物，由未消化完的食物，消化液，胆汁，人体排出的废物等成分组成，同时，人体肠道内还存在着大约1014个微生物(也称为肠道菌群)，约为人体细胞数量的10倍，肠道菌群构成微生态系统，参与人体营养物质消化吸收、合成、免疫调节、能量代谢等生命活动，构成肠道黏膜的保护屏障，因此，肠道菌群构成与生活习惯，饮食和许多疾病密切相关。在成年人个体中，这些肠道微生物的总重量约1271克，相当于肝脏的重量。这些微生物的编码基因总量是人类编码基因数目的50～100倍，被统称为宏基因组。人体每日排出粪便重量的50％以上由细菌及其“尸体”构成。对肠道排泄尿酸的机制进行研究，人们发现肠道内细菌在嘌呤和尿酸的产生和代谢过程中扮演着重要的角色。某些肠道菌自身具有分泌尿酸的能力，同时死亡菌体富含嘌呤，嘌呤被机体吸收后最终代谢产物也是尿酸，然而，许多研究结果也表明，部分肠道菌具有降解尿酸的能力。痛风患者体内肠道菌群失调导致尿酸代谢不平衡，可能是高尿酸症状的重要原因。目前，王海涛等人研究结果显示，通过结肠透析可以显著降低高尿酸血症(王海涛，陈椰，等.中国中西医结合杂志，2007年6月第27卷第6期:492-494)；曹永孝，等人通过口服具有吸附作用的蒙脱石散和活性炭，也可以达到降低高尿酸血症的效果(zhaoma，yongxiaocao，et.al.journalofpharmacyandpharmacology2009；61:1499–1504)，这些研究结果提示，降低肠道中的游离尿酸含量，可达到治疗高尿酸血症和痛风的目的。然而，以上方式的诸多缺陷，限制了临床上的应用，比如结肠透析操作复杂，需要专业的设备和技术人员才能操作，因此费用非常高；长时间口服蒙脱石散和活性炭，会带来便秘，肠道电解质失衡等后遗症等，因此无法在临床上广泛应用。肠道菌作为人体的长期共生菌，作为降低肠道中游离尿酸含量的媒介具有天然的优势。肠道菌降低尿酸的机制，主要可分为两类，一类是降解尿酸的前体物质，如嘌呤，核苷酸类的物质，降低食源性核苷酸的摄入，从而降低高尿酸血症。如日本明治公司(专利号：cn102747004b)开发的含有降嘌呤或核苷酸的益生菌的酸奶；还有一类，通过降解肠道中的尿酸，增加血中尿酸向肠道中的排泄，从而降低高尿酸血症，如张彦新等人将尿酸氧化酶构建进入乳酸菌，构建具有降尿酸能力的益生菌(张彦新，蒋云生.南京大学学报，2009年4月第45卷：223-224)。然而，血液中尿酸的来源，80％以上来自自身新陈代谢产生，食源性尿酸摄入的量很少，通过降低食源性的尿酸摄入，来试图降血尿酸的效果有限。此外，本专利发明人也曾构建过表达尿酸氧化酶的工程益生菌，试图通过增加益生菌的分解尿酸能力达到降低肠道环境尿酸浓度的目的，但体外模拟效果显示，效果并不理想。一次试验意外发现，当菌体裂解后，较完整菌体降解尿酸的能力显著上升，该试验结果提示专利发明人，表达尿酸氧化酶的工程益生菌降尿酸效果不佳，可能为胞外的尿酸无法有效的透过细胞膜到达胞内与尿酸氧化酶接触。因此，仅表达尿酸氧化酶的工程益生菌，虽然可以降解尿酸，但是效果不佳，不具有显著的应用价值。此后多次研究结果发现，对外源尿酸的摄取能力，可能是决定肠道菌降尿酸能力的关键因子。尿酸透过酶(uricacidpermease)是一种膜蛋白，具有12-14个跨膜区，存在于许多微生物中，具有转运胞外的尿酸以及尿酸相关衍生物(如黄嘌呤，次黄嘌呤，腺嘌呤，鸟嘌呤等)进入细胞内部的功能，是某些微生物摄取尿酸作为氮源代谢的基础。不同微生物来源的尿酸透过酶，分子量有差异，但是跨膜结构和功能区域具有较高的相似度，研究结果显示，如果缺失尿酸透过酶的功能，尿酸的摄入量会显著下降(diallinasandscazzocchio,1989)。在许多益生菌的基因组测序中，有预测为尿酸透过酶的基因，但是本专利发明人在降尿酸测试过程中，均未发现天然益生菌能高效吸收外源尿酸的能力，少数益生菌虽然可以降低外源尿酸，但效果非常弱，不具有实际应用价值(内部数据，未公开)。天然益生菌不具有高效降低尿酸能力的可能原因有：(1)尿酸透过酶基因在天然益生菌中不表达或表达效率低；(2)预测的尿酸透过酶无尿酸透过功能。至今，尚未有研究将尿酸透过酶应用到治疗高尿酸血症和痛风的工程益生菌领域。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种重组高效表达尿酸透过酶或尿酸透过酶和尿酸氧化酶组合的工程益生菌及其制备方法与应用，所述方法能够方便快捷的制备工程益生菌，所述工程益生菌能够高效组成型表达尿酸透过酶或尿酸透过酶和尿酸氧化酶的组合，较仅表达尿酸氧化酶的降尿酸工程益生菌，其降尿酸能力显著增强，且动物降尿酸的效果试验显示，具有明显的降尿酸效果。作为降低血尿酸和痛风治疗的新手段，具有广阔的应用前景。为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：第一方面，提供一种工程益生菌，所述工程益生菌的基因组上整合了完整的尿酸透过酶表达盒，包括强启动子、尿酸透过酶基因和强串联终止子。优选的，所述强启动子，包括但不限于p59，p32，pslpa，hcepromotor等，优选hcepromotor，核苷酸序列如seqidno.20所示，所述强串联终止子，包括但不限于大肠杆菌rrnbt1t2，核苷酸序列如seqidno.21所示。优选的，所述的尿酸透过酶基因来源于原核生物，包括枯草芽孢杆菌pucj，其氨基酸序列如seqidno.11所示、枯草芽孢杆菌puck，其氨基酸序列如seqidno.12所示、嗜铬单胞菌puck，其氨基酸序列如seqidno.13所示、链霉菌puck，其氨基酸序列如seqidno.14所示、拟杆菌pucj，其氨基酸序列如seqidno.15所示、格氏链球菌pbux，其氨基酸序列如seqidno.16所示、副干酪乳杆菌puck，其氨基酸序列如seqidno.17、大肠杆菌ygfu，其氨基酸序列如seqidno.18、大肠杆菌uact，其氨基酸序列如seqidno.19中的任一种。更优选的，所述的尿酸透过酶具有如seqidno.11，seqidno.17，seqidno.18所示的氨基酸序列中的任一种。第二方面，提供一种工程益生菌，所述工程益生菌的基因组上整合了完整的尿酸氧化酶和尿酸透过酶的表达盒，包括强启动子、尿酸氧化酶、尿酸透过酶和强串联终止子。优选的，所述强启动子，包括但不限于p59，p32，pslpa，hcepromotor等，优选hcepromotor，核苷酸序列如seqidno.20所示，所述强串联终止子，包括但不限于大肠杆菌rrnbt1t2，核苷酸序列如seqidno.21所示。优选的，所述的尿酸氧化酶基因来源于原核生物、真核生物或动物，包括枯草芽孢杆菌uox，其氨基酸序列如seqidno.1所示、产朊假丝酵母uox，其氨基酸序列如seqidno.2所示、黄曲霉uox，其氨基酸序列如seqidno.3所示、黑曲霉uox，其氨基酸序列如seqidno.4所示、里氏木霉uox，其氨基酸序列如seqidno.5所示、球形节杆菌uox，其氨基酸序列如seqidno.6所示、微杆菌uox，其氨基酸序列如seqidno.7所示、蛹虫草uox，其氨基酸序列如seqidno.8所示、克鲁维酵母uox，其氨基酸序列如seqidno.9所示、猪uox，其氨基酸序列如seqidno.10所示任一种。更优选的，所述的尿酸氧化酶具有如seqidno.2，seqidno.3，seqidno.5所示的氨基酸序列中的任一种。优选的，所述的尿酸透过酶基因来源于原核生物，包括枯草芽孢杆菌pucj，其氨基酸序列如seqidno.11所示、枯草芽孢杆菌puck，其氨基酸序列如seqidno.12所示、嗜铬单胞菌puck，其氨基酸序列如seqidno.13所示、链霉菌puck，其氨基酸序列如seqidno.14所示、拟杆菌pucj，其氨基酸序列如seqidno.15所示、格氏链球菌pbux，其氨基酸序列如seqidno.16所示、副干酪乳杆菌puck，其氨基酸序列如seqidno.17、大肠杆菌ygfu，其氨基酸序列如seqidno.18、大肠杆菌uact，其氨基酸序列如seqidno.19中的任一种。更优选的，所述的尿酸透过酶具有如seqidno.11，seqidno.17，seqidno.18所示的氨基酸序列中的任一种。优选的，上述第一方面、第二方面所述的工程益生菌，其宿主细胞包括但不限于乳杆菌属(lactobacillus)、芽孢杆菌属(bacillus)、乳球菌属(lactococcus)。更优选的，所述工程益生菌的宿主细胞为干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)。第三方面，提供上述工程益生菌的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)尿酸透过酶基因或尿酸氧化酶和尿酸透过酶基因的克隆获得；(2)尿酸透过酶或尿酸透过酶和尿酸氧化酶重组表达整合载体的构建；(3)将(2)中所获得的重组整合载体电转入相应的宿主菌，筛选阳性转化子；(4)将(3)中阳性转化子通过提高培养温度至42℃，迫使其发生单交换，筛选阳性菌株；(5)将(4)中所获得的阳性单交换菌株，继续传代培养，筛选抗性丢失菌株，通过pcr鉴定筛选阳性整合菌株。本发明的原理：为提高肠道工程益生菌的尿酸降解能力，需增加其外源尿酸摄入能力。本专利发明人筛选了各种增强尿酸透过酶表达的启动子，包括p59，p32，pslpa，hcepromotor等，以及不同物种来源的尿酸透过酶和尿酸氧化酶，以期提升益生菌的尿酸摄取能力，直接有效的降低了肠道内游离尿酸的浓度，从而提升血中尿酸向肠道内排泄的比例。人体每日排泄粪便的50％是肠道菌，摄取了外源游离尿酸的益生菌，被排出体外的同时，也带走了尿酸，同样有助于降低肠道中的游离尿酸浓度。构建了尿酸透过酶的益生菌与原始益生菌相比，可显著的增加外源尿酸的摄入，从而降低胞外尿酸的浓度。第四方面，提供上述工程益生菌在制备预防和/或治疗高尿酸血症、痛风或痛风并发症的产品中的应用。优选的，所述产品为药物、特殊医学用途配方食品、保健食品或食品。第五方面，提供一种能降低血尿酸的口服微生物制剂，其特征在于，所述口服微生物制剂含有一种或一种以上上述工程益生菌。第六方面，提供上述口服微生物制剂在制备预防和/或治疗高尿酸血症、痛风或痛风并发症的产品中的应用。优选的，所述产品为药物、特殊医学用途配方食品、保健食品或食品。优选的，所述口服微生物制剂单独应用或者与其他药物联合应用。本发明与现有技术相比，具有如下优点：本申请将尿酸透过酶，尿酸透过酶和尿酸氧化酶用强启动子元件分别构建入不同的肠道益生菌株，比较其降尿酸的能力，惊奇的发现，构建了高效表达尿酸透过酶的益生菌与原始益生菌相比，可显著的增加外源尿酸的摄入，从而降低胞外尿酸的浓度，并且，同时构建了高效表达尿酸透过酶与尿酸氧化酶的菌种，其降低胞外尿酸的能力更强，显著高于原始益生菌种，也优于只含有尿酸透过酶的工程菌种，体外孵育20h降尿酸能力最高达到96％。本发明专利的降尿酸工程益生菌，较仅表达尿酸氧化酶的降尿酸益生菌，其降尿酸能力显著增强，且在高尿酸血症动物模型中降尿酸的效果试验显示，具有明显的降血尿酸效果，血清尿酸浓度下降最高达到45.4％，尿尿酸浓度下降最高达到73.3％。作为降低血尿酸和痛风治疗的新手段，具有广阔的应用前景。附图说明图1为载体peberm194-gfp结构示意图，携带红霉素抗性基因。图2为载体pebkan194-gfp结构示意图，携带卡那霉素抗性基因。图3为实施例2中重组质粒peberm194-gfp-tfr结构示意图。图4为实施例2中重组质粒peberm194-gfp-tfr-puck结构示意图。图5为实施例3中重组质粒peberm194-gfp-tfr-cuuox结构示意图。图6为实施例4中重组质粒peberm194-gfp-tfr-cuuox-puck结构示意图。图7为实施例5中重组质粒pebkan194-gfp-aprefr结构示意图。图8为实施例5中重组质粒pebkan194-gfp-aprefr-pucj结构示意图。图9为实施例6中重组质粒pebkan194-gfp-aprefr-truox结构示意图。图10为实施例7中重组质粒pebkan194-gfp-aprefr-truox-pucj结构示意图。图11为实施例8中重组质粒peberm194-gfp-usp45fr结构示意图。图12为实施例8中重组质粒peberm194-gfp-usp45fr-ygfu结构示意图。图13为实施例9中重组质粒peberm194-gfp-usp45fr-afuox结构示意图。图14为实施例10中重组质粒peberm194-gfp-usp45fr-afuox-ygfu结构示意图。图15为实施例12中不同菌株在生长过程中降尿酸能力分析图。图16为实施例12中不同菌株在孵育过程中降尿酸能力分析图。具体实施方式本发明以来源于副干酪乳杆菌的尿酸透过酶和来源于产朊假丝酵母的尿酸氧化酶在干酪乳杆菌中的重组表达，以来源于枯草芽孢杆菌的尿酸透过酶和来源于里氏木霉的尿酸氧化酶在枯草芽孢杆菌中的重组表达，以来源于大肠杆菌的尿酸转运蛋白和来源于黄曲霉的尿酸氧化酶在乳酸乳球菌中的重组表达为具体实施例进行说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。下面结合实施例对本发明进行进一步说明，实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用到的原材料及来源如下所示，如无特殊说明，均可以从商业途径得到。实施例中采用的pebkan194-gfp质粒为申请人的另外一份专利申请(申请号：21610410811.8)中的pkgfp194ts，其构建信息参考该申请的说明书实施例1；而peberm194-gfp质粒是在pebkan194-gfp的质粒基础上将kan基因替换成来源于商业化质粒pmg36e上的erm基因序列。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。dna聚合酶、dnamarker为北京全式金公司产品。大肠杆菌感受态细胞dh5α为北京全式金公司产品。限制性内切酶dpni等为thermofisher公司产品。无缝克隆试剂盒为南京诺唯赞公司产品。质粒提取试剂盒与胶回收试剂盒为promega公司产品。干酪乳杆菌atcc393、副干酪乳杆菌购自美国典型培养物保藏中心(atcc)。枯草芽孢杆菌bs168购自中国工业微生物菌种保藏中心(cicc)。黑曲霉2439、里氏木霉rut-c30、马克斯克鲁维酵母、产朊假丝酵母购自广东微生物菌种保藏中心。基因序列的合成、引物合成以及基因测序均由武汉天一辉远生物科技有限公司完成。实施例1尿酸氧化酶编码序列的获得枯草芽孢杆菌尿酸氧化酶(genbank：wp_003242600.1)、产朊假丝酵母尿酸氧化酶(genbank：p78609.1)、黑曲霉尿酸氧化酶(genbank：xp_001399739.1)、里氏木霉尿酸氧化酶(genbank：xp_006963697.1)、蛹虫草尿酸氧化酶(genbank：xp_006674629.1)、马克斯克鲁维酵母尿酸氧化酶(genbank：xp_022674397.1)编码序列，是经过抽提相应物种的基因组dna，用表1中的引物扩增尿酸氧化酶全长序列，经序列比对与分析，来源于真核生物的基因经人工去除内含子后将序列拼接而成。黄曲霉尿酸氧化酶(genbank：xp_001826198.1)、球状节杆菌尿酸氧化酶(genbank：d0vwq1.1)、微杆菌尿酸氧化酶(genbank：aey68606.1)、猪尿酸氧化酶(genbank：np_999435.1)序列是根据数据库序列，经密码子优化，由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。表1.尿酸氧化酶基因扩增引物引物名称引物序列(5’-3’)bs-uox-fatgttcacaatggatgacctgbs-uox-rtcaggctttcaggctccgaccu-uox-fatgtcaacaacgctctcatccu-uox-rttacaacttggtcttctccttaaf-uox-fatgagcgcagttaaagccgcaf-uox-rttacagtttgcttttcaggctgan-uox-fatgtcttccccagttactgcan-uox-rttacagcttcgccttcgtgttgtr-uox-fatggcctcttccgcctacgtctr-uox-rttacagatgcgagccacgggag-uox-fatgaccgcaaccgcagaaacag-uox-rttaacaaaaacctgcaatattgccm-uox-fatgcccaccatctcggccgccm-uox-rttacaatttggaggacggtcckm-uox-fatgtcgtactcatatctagckm-uox-rctataacttagcttgtttgcggms-uox-fatgaccaacattatcctgggms-uox-rttaacaaaaacctgcaataccss-uox-fatggcacactaccgcaacgacss-uox-rttacagacggctggtcagtttac在25μl反应体系中pcr扩增各尿酸氧化酶基因序列，反应条件为94℃预变性2min，98℃/10sec，55℃/30sec，68℃/30sec，反应30个循环，再68℃延伸5min。pcr产物加“a尾”后，用pcr产物回收试剂盒回收，连接t载体，转化大肠杆菌后，挑取阳性转化子，进一步dna测序确认。经测序验证正确的基因片段保存备用。实施例2重组表达尿酸透过酶的干酪乳杆菌工程菌的构建2.1peberm194-gfp-tfr载体构建以干酪乳杆菌atcc393基因组dna为模板，用表2中的引物tf-up-f/tf-up-r，tf-down-f/tf-down-r，pcr扩增上游同源臂tf-up和下游同源臂tf-down，然后以tf-up-f/tf-down-r为引物，通过重叠pcr扩增tf-up+down，并用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pcr片段；以peberm194-gfp质粒为模板，用表2中的引物peberm194-f/peberm194-r，pcr扩增约5300bp的载体骨架片段，用dpni消化2h后用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体片段；将消化回收的载体骨架与up+down重叠片段按照无缝克隆试剂盒的方法进行组装，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布lb平板(加入终浓度为600μg/ml的红霉素)，倒置于30℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液pcr筛选，筛选到的阳性菌株测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用，质粒命名为peberm194-gfp-tfr。表2.peberm194-gfp-tfr载体构建引物2.2尿酸透过酶整合载体的构建以数据库序列(genbank:dj022754.1)全基因合成的hcepromotor为模板，用表3中的引物hce-f/hce-r，pcr扩增强组成型启动子hcepromotor(seqno.20)；以副干酪乳杆菌的基因组dna为模板，用表3中的引物puck-f/puck-r，pcr扩增puck基因序列；以全基因合成的rrnbt1t2为模板，用表3中的引物rrnbt1t2-f/rrnbt1t2-r，pcr扩增终止子rrnbt1t2(seqno.21)。然后以这三个片段为模板，用引物hce-f/rrnbt1t2-r，重叠pcr扩增hcepromotor+puck+rrnbt1t2，并用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pcr片段。以质粒peberm194-gfp-tfr为模板，用表3中的引物p-down-f/p-up-r，pcr扩增约6700bp的载体骨架，用dpni消化2h后用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体片段；将消化回收的载体骨架与up+down重叠片段按照无缝克隆试剂盒的方法进行组装，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布lb平板(加入终浓度为600μg/ml的红霉素)，倒置于30℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液pcr筛选，筛选到的阳性菌株测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用，质粒命名为peberm194-gfp-tfr-puck。表3.peberm194-gfp-tfr-puck载体构建引物引物名称引物序列(5’-3’)hce-faagcgaggaacaaatgatctctccttcacagattcchce-rgaaatcgctttattcttcatcagatctcctttttccagaagpuck-fctggaaaaaggagatctgatgaagaataaagcgatttcgpuck-rccgccaaaacagcccttttttatttatctgaatcgcgttcgrrnbt1t2-fcgattcagataaataaaaaagggctgttttggcggatgagagrrnbt1t2-raataaattgcgtcacagagtttgtagaaacgcaaaaagp-down-fgtgacgcaatttattagtccaggp-up-ratttgttcctcgctttgacttta2.3重组质粒转化干酪乳杆菌及重组菌株的筛选从mrs琼脂平板上挑取干酪乳杆菌atcc393，接入5ml新鲜的mrs液体培养基中，37℃静置培养过夜；吸取1ml过夜培养的培养液于100ml含1％甘氨酸的mrs液体培养基中，37℃培养至od600＝1.1-1.3；培养物置于冰上，冰浴10min，将培养物分装至50ml无菌离心管中，4℃，4000rpm离心10min，弃上清液，离心管倒置1min，除尽残留的培养基；每只离心管加20ml冰预冷的ddh2o，小心悬浮细胞，4℃，4000rpm离心10min，弃上清液，重复一次。用15ml冰预冷的电击缓冲液(0.5m蔗糖，10％甘油)重悬细胞，4℃，4000rpm离心10min，弃上清，重复一次；每只离心管加1-2ml预冰冷的电击缓冲液，小心悬浮细胞；分装感受态细胞于灭菌的1.5ml离心管中备用(80μl每份)。将100-500ngpeberm194-gfp-tfr-puck质粒dna加到80μl感受态细胞中，轻轻混匀，置冰上备用；将含有重组质粒的感受态细胞混合液小心加入电转杯中，调节电击电压至800v，电击完成后，立即加入800μl新鲜的mrs培养基，静置于37℃复苏3h。取菌液涂布含红霉素的mrs平板，过夜培养筛选转化子。从转化平板上挑取单菌落，用表2中的引物peberm194-f(ce)/peberm194-r(ce)进行鉴定，阳性菌株接种至含5μg/ml红霉素的mrs培养基，42℃静置培养，每隔8-12h按1％的比例转接至新鲜的含5μg/ml红霉素的mrs培养基，连续转接数代，取传代培养数次的菌液在含5μg/ml红霉素的mrs琼脂平板上划线，倒置于37℃过夜培养，挑取单菌落，用表2中的引物peberm194-f(ce)/is-r进行菌液pcr筛选发生单交换的菌株。将阳性单交换菌株接种至新鲜无抗mrs培养基，37℃静置培养，每隔8-12h按1％的比例转接至新鲜的mrs培养基，连续转接数代后，取菌液稀释合适的倍数，涂布mrs琼脂平板，倒置于37℃培养至长出单菌落，挑取单菌落分别点至含5μg/ml红霉素的mrs平板和无抗性的mrs平板，做好标记，一一对应，倒置于37℃，观察在含5μg/ml红霉素的mrs平板上未生长的菌落，用表2中的引物is-f/is-r，进行菌落pcr鉴定，若整合成功，则扩增到约3500bp的条带，若未整合成功，则扩增到约1500bp的条带；构建成功的菌株命名为lac.casei-1。实施例3重组表达尿酸氧化酶的干酪乳杆菌工程菌的构建3.1尿酸氧化酶整合载体构建以数据库序列(genbank:dj022754.1)全基因合成的hcepromotor为模板，用表4中的引物hce-f/hce-r，pcr扩增强组成型启动子hcepromotor(seqno.20)；以cu-uox基因序列为模板，用表4中的引物cuuox-f/cuuox-r，pcr扩cu-uox基因序列；以全基因合成的rrnbt1t2为模板，用表4中的引物rrnbt1t2-f/rrnbt1t2-r，pcr扩增终止子rrnbt1t2(seqno.21)。然后以这三个片段为模板，用引物hce-f/rrnbt1t2-r，重叠pcr扩增hcepromotor+cuuox+rrnbt1t2，并用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pcr片段。以质粒peberm194-gfp-tfr为模板，用表4中的引物p-down-f/p-up-r，pcr扩增约6700bp的载体骨架，用dpni消化2h后用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体片段；将消化回收的载体骨架与up+down重叠片段按照无缝克隆试剂盒的方法进行组装，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布lb平板(加入终浓度为600μg/ml的红霉素)，倒置于30℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液pcr筛选，筛选到的阳性菌株测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用，质粒命名为peberm194-gfp-tfr-cuuox。表4.peberm194-gfp-tfr-cuuox载体构建引物引物名称引物序列(5’-3’)hce-faagcgaggaacaaatgatctctccttcacagattcchce-r1gatgatgagagcgttgttgacatcagatctcctttttccagaagcuuox-fctggaaaaaggagatctgatgtcaacaacgctctcatcatccuuox-rccgccaaaacagcccttttttacaacttggtcttctccttacrrnbt1t2-f1gaagaccaagttgtaaaaaagggctgttttggcggatgagagrrnbt1t2-raataaattgcgtcacagagtttgtagaaacgcaaaaagp-down-fgtgacgcaatttattagtccaggp-up-ratttgttcctcgctttgacttta3.2重组质粒转化干酪乳杆菌及重组菌株的筛选按照实施例2.3的方法，将重组质粒peberm194-gfp-cuuox转化经干酪乳杆菌atcc393，并筛选单交换菌株及双交换菌株，用表2中的引物is-f/is-r，进行菌落pcr鉴定，若整合成功，则扩增到约3100bp的条带，若未整合成功，则扩增到约1500bp的条带；构建成功的菌株命名为lac.casei-2。实施例4重组表达尿酸氧化酶和尿酸透过酶的干酪乳杆菌工程菌的构建4.1尿酸氧化酶和尿酸透过酶整合载体构建以cu-uox基因序列为模板，用表5中的引物cu-uox-f/cu-uox-r，pcr扩增cu-uox；以副干酪乳杆菌基因组dna为模板，用表5中的引物puck-f1/puck-r，pcr扩增puck基因；然后以这两个片段为模板，用引物cu-uox-f/puck-r，通过重叠pcr扩增cu-uox+puck。以质粒peberm194-gfp-tfr-puck为模板，用表5中的引物p-t1t2-f/p-hce-r，pcr扩增约7200bp的载体骨架，用dpni消化2h后用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体片段；将消化回收的载体骨架与up+down重叠片段按照无缝克隆试剂盒的方法进行组装，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布lb平板(加入终浓度为600μg/ml的红霉素)，倒置于30℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液pcr筛选，筛选到的阳性菌株测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用，质粒命名为peberm194-gfp-tfr-cuuox-puck。表5.peberm194-gfp-tfr-cuuox-puck载体构建引物引物名称引物序列(5’-3’)cu-uox-fctggaaaaaggagatctgatgtcaacaacgctctcatcatccu-uox-r1gaaatcgctttattcttcatttacaacttggtcttctccttacpuck-f1gagaagaccaagttgtaaatgaagaataaagcgatttcgpuck-rccgccaaaacagcccttttttatttatctgaatcgcgttcgp-t1t2-fggctgttttggcggatgagagp-hce-rcagatctcctttttccagaagtg4.2重组质粒转化干酪乳杆菌及重组菌株的筛选按照实施例2.3的方法，将重组质粒peberm194-gfp-cuuox-puck转化经干酪乳杆菌atcc393，并筛选单交换菌株及双交换菌株，用表2中的引物is-f/is-r，进行菌落pcr鉴定，若整合成功，则扩增到约4500bp的条带，若未整合成功，则扩增到约1500bp的条带；构建成功的菌株命名为lac.casei-3。实施例5重组表达尿酸透过酶的枯草芽孢杆菌工程菌的构建5.1pebkan194-gfp-aprefr载体构建以枯草芽孢杆菌bacillussubtilis168基因组dna为模板，用表6中的引物apre-up-f/apre-up-r，apre-down-f/apre-down-r，pcr扩增上游同源臂apre-up和下游同源臂apre-down，然后以apre-up-f/apre-down-r为引物，通过重叠pcr扩增apre-up+down，并用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pcr片段；以pebkan194-gfp质粒为模板，用表2中的引物peberm194-f/peberm194-r，pcr扩增约5300bp的载体骨架片段，用dpni消化2h后用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体片段；将消化回收的载体骨架与up+down重叠片段按照无缝克隆试剂盒的方法进行组装，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布lb平板(加入终浓度为20μg/ml的卡那霉素)，倒置于30℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液pcr筛选，筛选到的阳性菌株测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用，质粒命名为pebkan194-gfp-aprefr。表6.pebkan194-gfp-aprefr载体构建引物引物名称引物序列(5’-3’)apre-up-fgactctagaggatcctgctcagtctgaagtgttaaacapre-up-raacctgcttctttttactattcagagtagacttacttaaaagacapre-down-fttaagtaagtctactctgaatagtaaaaagaagcaggttcctcapre-down-rgagctcggtacccggtgaagccaatattccggctgacapre-fccggtatcctcttcatagccapre-rtcagccggtcattatcgatc5.2尿酸透过酶整合载体的构建以质粒pebkan194-gfp-aprefr为模板，将来源于枯草芽孢杆菌bs168的尿酸透过酶基因pucj基因，用表7中的引物，按照实施例2.2中的方法，构建重组质粒pebkan194-gfp-aprefr-pucj。表7.pebkan194-gfp-aprefr-pucj载体构建引物5.3重组质粒转化枯草芽孢杆菌及重组菌株的筛选将冻存枯草芽孢杆菌菌种在lb平板上划线，置于37℃培养箱过夜培养。从新鲜平板上挑单菌落接种于5mllb培养基中，37℃，220rpm过夜培养。吸取过夜培养的菌液转接至gm培养基，控制好接种量，使接种完后的od600在0.19-0.2之间。37℃，200rpm培养至od600＝1.0(大约需要3-4小时)左右。取全部菌液转移至50ml无菌离心管，冰水浴10min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。用40ml在4℃预冷的电转缓冲液(etm)洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此重复漂洗3次。将洗涤后的菌体重悬于等500μl的etm中，每管分装60μl，冻存于-80℃冰箱。取一管冻存的60μl感受态细胞，插入冰上，微微解冻时加入5-10μl目的重组质粒，轻弹管底混匀，冰浴孵育5min，转移至预冷的电转杯(1mm)中，电击一次。电转仪参数设置：2.1kv，电击1次。(持续时间4.5ms-5ms之间)。电击完毕立即加入1ml复苏培养基rm，37℃，200rpm复苏培养3h后，涂lb板(加入终浓度为20μg/ml的卡那霉素)，倒置于37℃培养箱过夜培养。从转化平板上挑取单菌落，用表2中的引物peberm194-f(ce)/peberm194-r(ce)进行鉴定，阳性菌株接种至含20μg/mlkan的lb培养基，42℃，200rpm振荡培养，每隔8-12h按1％的比例转接至新鲜的含20μg/mlkan的lb培养基，连续转接数代，取传代培养数次的菌液在含20μg/mlkan的lb琼脂平板上划线，倒置于37℃过夜培养，挑取单菌落，用表2和表6中的引物peberm194-f(ce)/apre-r进行菌液pcr筛选发生单交换的菌株。将阳性单交换菌株接种至新鲜无抗lb培养基，37℃，200rpm振荡培养，每隔8-12h按1％的比例转接至新鲜的lb培养基，连续转接数代后，取菌液稀释合适的倍数，涂布lb琼脂平板，倒置于37℃培养至长出单菌落，挑取单菌落分别点至含20μg/mlkan的lb平板和无抗性的lb平板，做好标记，一一对应，倒置于37℃，观察在含20μg/mlkan的lb平板上未生长的菌落，用表6中的引物apre-f/apre-r，进行菌落pcr鉴定，若整合成功，则扩增到约3500bp的条带，若未整合成功，则扩增到约2700bp的条带；构建成功的菌株命名为bsu-1。实施例6重组表达尿酸氧化酶的枯草芽孢杆菌工程菌的构建6.1尿酸氧化酶整合载体的构建以质粒pebkan194-gfp-aprefr为模板，以来源于里氏木霉的尿酸氧化酶truox基因，用表8中的引物，按照实施例3.1中的方法，构建重组质粒pebkan194-gfp-aprefr-truox。表8.pebkan194-gfp-aprefr-truox载体构建引物引物名称引物序列(5’-3’)hce-f2taagtctactctgaagatctctccttcacagattcchce-r3gtaggcggaagaggccatcagatctcctttttccagaagtgtruox-fgaaaaaggagatctgatggcctcttccgcctacgtctruox-rctcatccgccaaaacagccttacagatgcgagccacggrrnbt1t2-f3cccgtggctcgcatctgtaaggctgttttggcggatgagagrrnbt1t2-r2tgcttctttttactaagagtttgtagaaacgcaaaaagp-down-f1tagtaaaaagaagcaggttcctccp-up-r1ttcagagtagacttacttaaaagactattc6.2重组质粒转化枯草芽孢杆菌及重组菌株的筛选按实施例5.3的方法将重组质粒pebkan194-gfp-aprefr-truox转化进枯草芽孢杆菌，并筛选单交换及双交换菌株，用表6中的引物apre-f/apre-r，进行菌落pcr鉴定，若整合成功，则扩增到约3100bp的条带，若未整合成功，则扩增到约2700bp的条带；构建成功的菌株命名为bsu-2。实施例7重组表达尿酸氧化酶和尿酸透过酶的枯草芽孢杆菌工程菌的构建7.1尿酸氧化酶和尿酸透过酶整合载体构建以pebkan194-gfp-aprefr-pucj质粒为模板，用表9中的引物，按照实施例4.1中的方法构建重组质粒pebkan194-gfp-aprefr-truox-pucj。表9.pebkan194-gfp-aprefr-truox-pucj载体构建引物引物名称引物序列(5’-3’)tr-uox-fgaaaaaggagatctgatggcctcttccgcctacgtctr-uox-r1taacataatatcgttccggtcttacagatgcgagccacggpucj-f1cgtggctcgcatctgtaagaccggaacgatattatgttacpucj-rctcatccgccaaaacagcccttttttacacctctttttctaatgp-t1t2-fggctgttttggcggatgagagp-hce-rcagatctcctttttccagaagtg7.2重组质粒转化枯草芽孢杆菌及重组菌株的筛选按实施例5.3的方法将重组质粒pebkan194-gfp-aprefr-truox-pucj转化进枯草芽孢杆菌，并筛选单交换及双交换菌株，用表6中的引物apre-f/apre-r，进行菌落pcr鉴定，若整合成功，则扩增到约4500bp的条带，若未整合成功，则扩增到约2700bp的条带；构建成功的菌株命名为bsu-3。实施例8重组表达尿酸透过酶的的乳酸乳球菌工程菌的构建8.1peberm194-gfp-usp45fr载体构建以乳酸乳球菌nz9000基因组dna为模板，用表8中的引物usp45-up-f/usp45-up-r，usp45-down-f/usp45-down-r，pcr扩增上游同源臂usp45-up和下游同源臂usp45-down，然后以usp45-up-f/usp45-down-r为引物，通过重叠pcr扩增usp45-up+down，并用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pcr片段；以peberm194-gfp质粒为模板，用表1中的引物peberm194-f/peberm194-r，pcr扩增约5300bp的载体骨架片段，用dpni消化2h后用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体片段；将消化回收的载体骨架与up+down重叠片段按照无缝克隆试剂盒的方法进行组装，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布lb平板(加入终浓度为600μg/ml的红霉素)，倒置于30℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液pcr筛选，筛选到的阳性菌株测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用，质粒命名为peberm194-gfp-usp45fr。表10.peberm194-gfp-usp45fr载体构建引物引物名称引物序列(5’-3’)usp45-up-fgactctagaggatccatttgtctttgttattaagagcausp45-up-rtattattataccacaataatcactttctaattgtatcttacatgusp45-down-fgtaagatacaattagaaagtgattattgtggtataataataaggusp45-down-rgagctcggtacccggaaagaaagtttcatcaagagcagusp45-fgtcttggcaaaatggtctatgusp45-rctttcatatcccaataaggc8.2尿酸透过酶整合载体的构建以质粒peberm194-gfp-usp45fr为模板，以来源于大肠杆菌的尿酸转运蛋白ygfu基因，用表11中的引物，按照实施例2.2中的方法，构建重组质粒peberm194-gfp-usp45fr-ygfu。表11.peberm194-gfp-usp45fr-ygfu载体构建引物引物名称引物序列(5’-3’)hce-f4tacaattagaaagtggatctctccttcacagattcchce-r4tgggaatctatggcgctcatcagatctcctttttccagaagygfu-ftctggaaaaaggagatctgatgagcgccatagattcccaacygfu-rcgccaaaacagcccttttttattctccatgctcatttttcttcrrnbt1t2-f4gagcatggagaataaaaaagggctgttttggcggatgagagrrnbt1t2-r4ttataccacaataatagagtttgtagaaacgcaaaaagp-down-f2attattgtggtataataataaggp-up-r2cactttctaattgtatcttacatg8.3重组质粒转化乳酸乳球菌及重组菌株的筛选从mrs琼脂平板上挑取乳酸乳球菌nz9000，接入5ml新鲜的mrs液体培养基中，37℃静置培养过夜；吸取1ml过夜培养的培养液于100ml含1％甘氨酸的mrs液体培养基中，37℃培养至od600＝1.1-1.3；培养物置于冰上，冰浴10min，将培养物分装至50ml无菌离心管中，4℃，4000rpm离心10min，弃上清液，离心管倒置1min，除尽残留的培养基；每只离心管加20ml冰预冷的ddh2o，小心悬浮细胞，4℃，4000rpm离心10min，弃上清液，重复一次。用15ml冰预冷的电击缓冲液(0.5m蔗糖，10％甘油)重悬细胞，4℃，4000rpm离心10min，弃上清，重复一次；每只离心管加1-2ml预冰冷的电击缓冲液，小心悬浮细胞；分装感受态细胞于灭菌的1.5ml离心管中备用(80μl每份)。将100-500ngpeberm194-gfp-usp45fr-ygfu质粒dna加到80μl感受态细胞中，轻轻混匀，置冰上备用；将含有重组质粒的感受态细胞混合液小心加入电转杯中，调节电击电压至800v，电击完成后，立即加入800μl新鲜的mrs培养基，静置于37℃复苏3h。取菌液涂布含红霉素的mrs平板，过夜培养筛选转化子。从转化平板上挑取单菌落，用表2中的引物peberm194-f(ce)/peberm194-r(ce)进行鉴定，阳性菌株接种至含5μg/mlerm的mrs培养基，42℃静置培养，每隔8-12h按1％的比例转接至新鲜的含5μg/mlerm的mrs培养基，连续转接数代，取传代培养数次的菌液在含5μg/mlerm的mrs琼脂平板上划线，倒置于37℃过夜培养，挑取单菌落，用表2和表8中的引物peberm194-f(ce)/usp45-r进行菌液pcr筛选发生单交换的菌株。将阳性单交换菌株接种至新鲜无抗mrs培养基，37℃静置培养，每隔8-12h按1％的比例转接至新鲜的mrs培养基，连续转接数代后，取菌液稀释合适的倍数，涂布mrs琼脂平板，倒置于37℃培养至长出单菌落，挑取单菌落分别点至含5μg/mlerm的mrs平板和无抗性的mrs平板，做好标记，一一对应，倒置于37℃，观察在含5μg/mlerm的mrs平板上未生长的菌落，用表8中的引物usp45-f/usp45-r，进行菌落pcr鉴定，若整合成功，则扩增到约3400bp的条带，若未整合成功，则扩增到约3000bp的条带；构建成功的菌株命名为lac.sub-1。实施例9重组表达尿酸氧化酶的的乳酸乳球菌工程菌的构建9.1尿酸氧化酶整合载体的构建以质粒peberm194-gfp-usp45fr质粒为模板，以来源于黄曲霉的尿酸氧化酶afuox基因，用表12中的引物，按照实施例3.1中的方法，构建重组质粒peberm194-gfp-usp45fr-afuox。表12.peberm194-gfp-usp45fr-afuox载体构建引物引物名称引物序列(5’-3’)hce-f4tacaattagaaagtggatctctccttcacagattcchce-r5gctgcttttactgcggacatcagatctcctttttccagaagafuox-ftctggaaaaaggagatctgatgtccgcagtaaaagcagccafuox-rccgccaaaacagcccttttttacaatttagacttcagagaggrrnbt1t2-f5ctgaagtctaaattgtaaaaaagggctgttttggcggatgagagrrnbt1t2-r4ttataccacaataatagagtttgtagaaacgcaaaaagp-down-f2attattgtggtataataataaggp-up-r2cactttctaattgtatcttacatg9.2重组质粒转化乳酸乳球菌及重组菌株的筛选按实施例8.3的方法将重组质粒peberm194-gfp-afuox转化进乳酸乳球菌nz9000，并筛选单交换及双交换菌株，用表10中的引物usp45-f/usp45-r，进行菌落pcr鉴定，若整合成功，则扩增到约3400bp的条带，若未整合成功，则扩增到约3000bp的条带；构建成功的菌株命名为lac.sub-2。实施例10重组表达尿酸氧化酶和尿酸透过酶的乳酸乳球菌工程菌的构建10.1尿酸氧化酶和尿酸透过酶整合载体构建以peberm194-gfp-usp45fr-ygfu质粒为模板，用表13中的引物，按照实施例4.1中的方法构建重组质粒peberm194-gfp-usp45fr-afuox-ygfu。表13.peberm194-gfp-usp45fr-afuox-ygfu载体构建引物引物名称引物序列(5’-3’)af-uox-ftctggaaaaaggagatctgatgtccgcagtaaaagcagccaf-uox-r1ggaatctatggcgctcatttacaatttagacttcagagaggygfu-f1ctctgaagtctaaattgtaaatgagcgccatagattcccaacygfu-rcgccaaaacagcccttttttattctccatgctcatttttcttcp-t1t2-fggctgttttggcggatgagagp-hce-rcagatctcctttttccagaagtg10.2重组质粒转化乳酸乳球菌及重组菌株的筛选按实施例8.3的方法将重组质粒peberm194-gfp-afuox-ygfu转化进乳酸乳球菌nz9000，并筛选单交换及双交换菌株，用表10中的引物usp45-f/usp45-r，进行菌落pcr鉴定，若整合成功，则扩增到约4500bp的条带，若未整合成功，则扩增到约1500bp的条带；构建成功的菌株命名为lac.sub-3。实施例11重组菌株的抗性评价将6株乳酸菌重组菌株(lac.casei-1～3；lac.sub-1～3)和2株原始菌株(lac.casei与lac.sub)，分别在mrs琼脂平板和含5μg/ml红霉素(erm)的mrs琼脂平板上划线，倒置于37℃静置培养；同时接种至mrs液体培养基和含5μg/mlerm的mrs液体培养基，37℃静置培养超过24h。结果8株菌在mrs无抗琼脂平板和mrs无抗液体培养基中均生长良好，而在mrs抗性平板上未见菌落长出，在含5μg/mlerm的mrs液体培养基中未见浑浊，由此说明，重组菌株和原始宿主菌均不携带红霉素抗性。将3株芽孢杆菌重组菌株(bsu-1～3)和原始宿主菌株(bsu)，分别在lb琼脂平板和含20μg/mlkan的lb琼脂平板上划线，倒置于37℃过夜培养；同时接种至lb液体培养基和含20μg/mlkan的lb液体培养基，37℃静置培养超过24h。结果3株菌在lb无抗琼脂平板和lb无抗液体培养基中均生长良好，而在lb抗性平板上未见菌落长出，在含20μg/mlkan的lb液体培养基中未见浑浊，由此说明，重组菌株和原始宿主菌均不携带卡那霉素抗性。实施例12各种重组工程益生菌的体外降尿酸能力比较方法一：将2株乳酸菌宿主菌和6株重组菌株分别接种至5mlmrs培养基，37℃静置培养过夜，按2％的接种量转接至含0.5g/l尿酸的mrs培养基，37℃静置培养不同时间点，取样检测上清中尿酸浓度。将枯草芽孢杆菌bs168和3株芽孢杆菌重组菌株分别接种至5mllb培养基，37℃静置培养过夜，按2％的接种量转接至含0.5g/l尿酸的lb培养基，37℃静置培养不同时间点，取样检测上清中尿酸浓度。培养基上清中尿酸浓度检测方法(尿酸氧化酶法)：取1ml不同时间点的培养物，12000rpm离心10min，取上清用武汉生之源生物工程有限公司尿酸检测试剂盒进行检测，计算上清中尿酸残余浓度，从而评价重组菌株的降解尿酸的能力，结果如表14所示。结果表明，宿主菌几乎没有降尿酸的能力，但重组菌株有明显降解尿酸的能力，而且同时整合尿酸透过酶和尿酸氧化酶的重组菌株降解尿酸的能力比单纯只整合尿酸透过酶的重组菌株，降解尿酸的能力增强。表14.不同菌株在生长过程中降尿酸能力分析方法二：将2株乳酸菌宿主菌和6株重组菌株分别接种至100mlmrs培养基，将枯草芽孢杆菌bs168和3株重组菌株分别接种至100mllb培养基，37℃静置培养过夜，12000rpm离心10min收集菌体，然后用ph7.5的50mm硼酸盐缓冲液重悬菌体，清洗菌体三次，用少量ph7.5的50mm硼酸盐缓冲液重悬菌体调节菌体od600＝50，然后在ph7.5的含0.5g/l尿酸的50mm硼酸盐缓冲液中加入菌体，至od600＝5，在37℃下静置孵育，在不同时间点取样检测上清中的尿酸浓度。上清中尿酸浓度检测方法(尿酸氧化酶法)：取1ml不同时间点的培养物，12000rpm离心10min，取上清用武汉生之源生物工程有限公司尿酸检测试剂盒进行检测，计算上清中尿酸残余浓度，从而评价重组菌株的降解尿酸的能力，结果见表15所示。结果表明，宿主菌几乎没有降尿酸的能力，尿酸氧化酶重组菌株有明显降解尿酸的能力，而且同时整合尿酸透过酶和尿酸氧化酶的重组菌株降解尿酸的能力比单纯只整合尿酸透过酶的重组菌株，降解尿酸的能力增强。表15.不同重组菌株在孵育过程中降尿酸能力分析实施例13口服重组菌株对大鼠血清尿酸和尿尿酸水平的影响13.1高尿酸血症动物模型的建立选体重在100g左右的雄性sd大鼠66只，每6只为一组，随机分成11组；先经过3天的适应性喂养后，开始造模。空白组的6只大鼠正常饮食饮水，腹腔注射生理盐水；其余各组正常饮食，每日饮水替换成20％的酵母粉水溶液，30ml/24h，同时腹腔注射氧嗪酸钾(250mg/(kg/d))，连续喂养5天，每24h收集尿液、尾部采血，检测血清尿酸和尿尿酸水平，样本检测用武汉生之源生物工程有限公司尿酸检测试剂盒检测。检测结果见表16和表17。结果表明获得了稳定的高尿酸血症动物模型。13.2重组菌株效果验证用mrs培养基分别培养6种重组菌株，待生长至饱和浓度时，12000rpm离心收集菌体，用无菌生理盐水清洗菌体3次，称量菌体湿重，用无菌生理盐水调节菌体5*1010cfu/ml，混匀后进行大鼠灌胃实验，实验组每只灌胃1ml，每天灌胃2次。连续灌胃3天，每24h收集尿液、尾部采血，检测血清尿酸和尿尿酸水平。检测结果见表16和表17。结果表明，通过口服灌喂尿酸氧化酶重组菌株，能略微降低血清尿酸水平和24h尿尿酸总量，通过口服灌喂尿酸透过酶重组菌株或尿酸透过酶和尿酸氧化酶重组菌株，均能够显著降低血清尿酸水平和24h尿尿酸总量，血尿酸与尿尿酸已趋向正常喂养组水平。表16.血清尿酸浓度变化表17.24h尿尿酸总量变化序列表<110>深圳市诺维健生物技术有限责任公司<120>一种能在肠道中降解尿酸的工程益生菌及其制备方法与应用<160>21<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>494<212>prt<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)<400>1metphethrmetaspaspleuasnglnmetaspthrglnthrleuthr151015aspthrleuglyserilephegluhissersertrpilealagluarg202530seralaalaleuargpropheserserleuseraspleuhisarglys354045metthrglyilevallysalaalaasparggluthrglnleuaspleu505560ilelyslyshisproargleuglythrlyslysthrmetseraspasp65707580servalarggluglnglnasnalaglyleuglylysleugluglngln859095glutyrgluglupheleumetleuasngluhistyrtyraspargphe100105110glyphepropheileleualavallysglylysthrlysglnaspile115120125hisglnalaleuleualaargleuglusergluarggluthrgluphe130135140glnglnalaleuilegluiletyrargilealaargpheargleuala145150155160aspileilethrglulysglygluthrglnmetlysargthrmetser165170175tyrglylysglyasnvalphealatyrargthrtyrleulysproleu180185190thrglyvallysglnileprogluserserphealaglyargaspasn195200205thrvalvalglyvalaspvalthrcysgluileglyglyglualaphe210215220leuproserphethraspglyaspasnthrleuvalvalalathrasp225230235240sermetlysasnpheileglnarghisleualasertyrgluglythr245250255thrthrgluglypheleuhistyrvalalahisargpheleuaspthr260265270tyrserhismetaspthrilethrleuthrglygluaspileprophe275280285glualametproalatyrgluglulysgluleuserthrserargleu290295300valpheargargserargasngluargserargservalleulysala305310315320gluargserglyasnthrilethrilethrgluglntyrsergluile325330335metaspleuglnleuvallysvalserglyasnserphevalglyphe340345350ileargaspglutyrthrthrleuprogluaspglyasnargproleu355360365phevaltyrleuasnilesertrpglntyrgluasnthrasnaspser370375380tyralaseraspproalaargtyrvalalaalagluglnvalargasp385390395400leualaserthrvalphehisgluleugluthrproserileglnasn405410415leuiletyrhisileglycysargileleualaargpheproglnleu420425430thraspvalserpheglnserglnasnhisthrtrpaspthrvalval435440445glugluileproglyserlysglylysvaltyrthrgluproargpro450455460protyrglypheglnhisphethrvalthrarggluaspalaglulys465470475480glulysglnlysalaalaglulyscysargserleulysala485490<210>2<211>303<212>prt<213>产朊假丝酵母(candidautilis)<400>2metserthrthrleuserserserthrtyrglylysaspasnvallys151015pheleulysvallyslysaspproglnasnprolyslysglngluval202530metglualathrvalthrcysleuleugluglyglypheaspthrser354045tyrthrglualaaspasnserserilevalprothraspthrvallys505560asnthrileleuvalleualalysthrthrgluiletrpproileglu65707580argphealaalalysleualathrhisphevalglulystyrserhis859095valserglyvalservallysilevalglnaspargtrpvallystyr100105110alavalaspglylysprohisasphisserpheilehisgluglygly115120125glulysargilethraspleutyrtyrlysargserglyasptyrlys130135140leuserseralailelysaspleuthrvalleulysserthrglyser145150155160metphetyrglytyrasnlyscysaspphethrthrleuglnprothr165170175thraspargileleuserthraspvalaspalathrtrpvaltrpasp180185190asnlyslysileglyservaltyraspilealalysalaalaasplys195200205glyilepheaspasnvaltyrasnglnalaarggluilethrleuthr210215220thrphealaleugluasnserproservalglnalathrmetpheasn225230235240metalathrglnileleuglulysalacysservaltyrservalser245250255tyralaleuproasnlyshistyrpheleuileaspleulystrplys260265270glyleugluasnaspasngluleuphetyrproserprohisproasn275280285glyleuilelyscysthrvalvalarglysglulysthrlysleu290295300<210>3<211>302<212>prt<213>黄曲霉(aspergillusflavus)<400>3metseralavallysalaalaargtyrglylysaspasnvalargval151015tyrlysvalhislysaspglulysthrglyvalglnthrvaltyrglu202530metthrvalcysvalleuleugluglygluilegluthrsertyrthr354045lysalaaspasnservalilevalalathraspserilelysasnthr505560iletyrilethralalysglnasnprovalthrproprogluleuphe65707580glyserileleuglythrhispheileglulystyrasnhisilehis859095alaalahisvalasnilevalcyshisargtrpthrargmetaspile100105110a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