环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物、制备方法及其应用与流程

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物、制备方法及其应用。

背景技术：

具有高效、低毒、广谱等生物活性的吡咯环，广泛存在于动植物体内和微生物代谢产物中，有着广泛的医药活性，包括抗菌、消炎、抗病毒及抗肿瘤活性，也有着广泛的农药活性，包括杀菌、除虫活性，植物生长调节活性，以及昆虫的驱避、拒食和引诱活性等。吡咯烷酮也是其中重要的一类化合物，据文献报道其衍生物可用作抗毒蕈碱、抗癫痫、抗艾滋和抗病毒的药物；并且吡咯烷酮类衍生物作为一类非常重要的药物中间体，其在医药、农药、化工等领域也有着广泛应用，目前广泛用于合成抗癌和抗病毒活性化合物、抗组胺剂和速激肽阻抗剂、催眠镇静药佐匹克隆类似物、hiv蛋白酶阻抗剂等。

吡咯烷酮类化合物应用广泛，但其合成方法多采用分步法，其合成过程繁琐，步骤多且收率较低。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有明显抗肿瘤活性，对宫颈癌细胞有明显抑制作用，能增加肿瘤细胞的凋亡率的化合物及这种化合物的制备方法和用途。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物，其结构式如式ⅰ所示：

本发明还提供所述的环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物的制备方法，通过多组分缩合与关环反应串联一锅法合成。

进一步的，所述制备方法包括以下步骤：

步骤一、将对氟苯胺和3-对氯苯基丙烯醛置于反应容器中，加入甲醇，搅拌半小时；

步骤二、待有沉淀产生后，依次加入干燥的z-2-溴甲基-3-对氯苯基丙烯酸和环己基异腈，室温反应24小时；

步骤三、tlc监测聚合反应完全后，加入碳酸钾，升温至60℃回流反应12小时，tlc监测关环反应完全；

步骤四、过滤，滤液置于冰箱中冷冻过夜，待固体析出完全后抽滤，水洗，并用乙醚重结晶得到产物。

进一步的，步骤一中对氟苯胺和3-对氯苯基丙烯醛的摩尔比为1:1，每摩尔对氟苯胺加入5毫升甲醇。

进一步的，步骤二中z-2-溴甲基-3-对氯苯基丙烯酸和环己基异腈的摩尔比为1:1。

进一步的，步骤三中碳酸钾与对氟苯胺的摩尔比为1.5:1。

本发明提供一种包含环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺的药物组合物，其包含0.01％-5％的环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物和95％-99.99％的药学上可接受的辅料。

本发明提供包含环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物的注射用组合物，其包含0.01％-5％的环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物和95％-99.99％的药学上可接受的辅料，所述的药学上可接受的辅料包含增溶剂。

所述的药学上可接受的辅料还包含ph调节剂。

所述注射用组合物优选为冻干粉针剂。

所述的ph调节剂为氢氧化钠，使得环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物转变为钠盐形式，以制备成冻干粉针剂。其中的转变为部分转变或全部转变。

本发明提供一种制剂，具体如下：

一种冻干粉针剂，由0.01－5％的环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物及95％－99.99％的药学上可接受的辅料制备而成；其中，药学上可接受的辅料包含作为ph调节剂的氢氧化钠，其能使得环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物转变为钠盐形式。其中的转变为部分转变或全部转变。所述的部分转变为至少20％、30％、40％、50％、60％或80％转变为钠盐形式。

本发明还提供所述的环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步的，所述肿瘤为宫颈癌。

本发明公开了以下技术效果：

本发明采用多组分缩合与关环反应串联一锅合成新型环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物，没有中间体的分离步骤，故反应总收率升高，总收率为89％，且通过多组分缩合，可以减少反应步骤而获得相应较多的官能团取代。若使用目前已知方法设计合成类似的多官能团取代的吡咯烷酮衍生物，不仅合成步骤较多，导致总收率较低，且部分反应条件也较为严苛。该反应具有反应效率高，避免了分离中间体的损失和麻烦；具有反应条件温和、收率高、操作简便、环境污染小等特点。

活性测试证明，本发明得到的环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物是一种适合的抗肿瘤候选药物，尤其是作为抗宫颈癌治疗的候选药物。相对于阳性对照药品顺铂，提高了药物对癌细胞的抑制活性。本发明的环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物的合成方法简单，原料易得，合成路线收率高，并且操作过程简便。本发明所述化合物在抗肿瘤药物开发应用方面具有广阔的前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明所述环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物的合成路线图；

图2为本发明实施例1所述环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物的氢谱图；

图3为本发明环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物对宫颈癌c-33a细胞的迁移作用；

图4为本发明环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物对凋亡因子bax、caspase-3的作用。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物的制备

称取对氟苯胺(1mmol)和3-对氯苯基丙烯醛(1mmol)于25ml圆底烧瓶中，加入5ml甲醇，搅拌半小时，待有沉淀产生后，依次加入干燥的z-2-溴甲基-3-对氯苯基丙烯酸(1mmol)和环己基异腈(1mmol)，室温反应24小时；tlc监测聚合反应完全后，加入碳酸钾(1.5mmol)，升温至60℃回流反应12小时，tlc监测关环反应完全后；过滤，滤液置于冰箱中冷冻过夜，待固体析出完全后抽滤，水洗，并用乙醚重结晶得环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物，总收率为89％。本实施例制备得到的环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物结构式见式ⅰ，本实施例得到的化合物环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物，化学名为4e-n-环己基-2-对氯苯乙烯基-1-对氟苯基-4-对氯苄叉基-5-吡咯烷酮-2-酰胺，其波谱数据如下：白色固体(0.50g,总收率:89％).熔点:128-130℃.¹hnmr(cdcl3,600mhz):δ7.55-6.98(m,14h,12ar-hand2＝ch),6.34(d,j＝16.2hz,1h,＝ch),5.68(s,1h,nh),3.74-3.72(m,1h,nch),3.45(d,j＝16.8hz,1h,ch2^a),3.33(d,j＝16.8hz,1h,ch2^b),1.77-0.80(m,10h,5ch2).ir(kbr)1707,1643(c＝o)cm-¹.msm/z(％):562(m⁺,2),436(21),341(45),95(100).anal.calcdforc32h29cl2fn2o2:c,68.21；h,5.19；n,4.97；.found:c,68.03；h,5.26；n,4.91.其¹hnmr谱图如图2所示。

对比实验：如上述实验步骤，将关环反应使用的k2co3更换为其他碱进行总收率的对比，见表1。从表1可知，使用碳酸钾和碳酸铯，产率最佳，但选择碳酸钾更为经济。

表1：环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物的合成条件优化

实施例2环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物对宫颈癌c-33a细胞增殖的影响

收集对数生长期的宫颈癌细胞c-33a，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，然后进行离心。倒掉细胞上清，用含10％胎牛血清的dmem培养基配制成单个细胞悬液，调整细胞悬液浓度，使每毫升含有2×10⁵个c-33a细胞，移种到96孔板中培养，每孔加入200μl细胞悬液，96孔板边缘用无菌pbs填充。在5％co2、37℃培养箱孵育24h。设置空白以及3.125、6.25、12.5、25、50、100μm不同浓度的环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物及同样终浓度的顺铂分别处理对数生长期c-33a细胞48h。然后加入mtt试剂，用酶标仪测定吸光值，求出各浓度的抑制率。各浓度的抑制率见表2。

表2环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物和顺铂对c-33a细胞的抑制率

注：n＝3，与对照组1比较，*p<0.05，#p<0.01。

从表2中可以得出，环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物和顺铂可以抑制宫颈癌细胞c-33a的增殖，并且环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物具有比顺铂更好的抑制效果。

根据mtt法的结果，宫颈癌细胞抑制率随环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物的浓度增加而明显上升。环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物浓度从3.125μm到100μm，宫颈癌细胞c-33a的抑制率分别从(18.62％±3.20％)增加到(94.68％±0.19％)。

实施例3环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺对宫颈癌c-33a细胞凋亡的影响

收集对数生长期的宫颈癌细胞c-33a，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，然后进行离心。倒掉细胞上清，用含10％胎牛血清的dmem培养基配制成单个细胞悬液，调整细胞悬液浓度，使每毫升含有2×10⁵个c-33a细胞，6孔板每孔加入2ml细胞悬液。5％co2，37℃培养箱孵育24h。设置空白对照组、以及按照环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物对c-33a细胞的ic50的大小设置低、中、高的浓度(2μm、4μm、6μm)分别处理细胞48h。48h后收集细胞，消化细胞时，用不含edta的0.25％的胰蛋白酶消化，然后进行离心。按rhannexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪测定环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物对c-33a细胞凋亡的作用。细胞的凋亡率见表3。

表3环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物对c-33a细胞凋亡的影响

注：n＝3，与对照组比较，*p<0.01

从表3可以看出，流式细胞仪鉴定结果中，c-33a细胞的凋亡率从7.38％增加到28.92％。

实施例4环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺对c-33a细胞迁移的影响

收集对数生长期的宫颈癌细胞c-33a，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，然后进行离心。倒掉细胞上清，用含10％胎牛血清的dmem培养基配制成单个细胞悬液，调整细胞悬液浓度，使每毫升含有2×10⁵个c-33a细胞，6孔板每孔加入2ml细胞悬液。5％co2，37℃培养箱孵育24h。待细胞融合至70％左右，用提前消毒好的直尺放在六孔板上方，用200μl的枪头于每个孔里划三条直线，将细胞上清吸出，用pbs清洗两遍，显微镜下拍照。设置空白对照组以及4μm、6μm、8μm、10μm不同浓度的环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物分别处理细胞0h、24h、48h、72h，显微镜下拍照观察细胞的迁移情况，迁移结果如图3所示。

根据图3迁移的结果，不同浓度的环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物作用于宫颈癌c-33a细胞0h、24h、48h、72h后，通过与对照组划痕宽带的比较，环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物作用c-33a细胞后均能不同程度的抑制细胞迁移。

实施例5环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺对凋亡因子bax、caspase-3的作用

收集对数生长期的宫颈癌细胞c-33a，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，然后进行离心。倒掉细胞上清，用含10％胎牛血清的dmem培养基配制成单个细胞悬液，调整细胞悬液浓度，使每毫升含有2×10⁵个c-33a细胞，6孔板每孔加入2ml细胞悬液。5％co2，37℃培养箱孵育24h。设置空白对照组以及4μm、6μm、8μm不同浓度的环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物分别处理细胞分别处理细胞48h。48h后收集细胞，提取细胞内总的rna，然后进行rt-qpcr。根据扩增出来的ct值计算结果，扩增结果如图4所示。从图4可以看出，bax和caspase-3的表达均增加，且二者都属于促凋亡基因。实验结果说明环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物通过促进促凋亡基因bax和caspase-3的表达来诱导细胞凋亡。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。