一种益生丁酸梭菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物应用
技术领域：
，涉及一种益生丁酸梭菌及其应用。
背景技术：
：微生态制剂作为一种新型的抗生素替代品，具有无毒副作用、无耐药性、无残留等诸多优点，得到了养殖业的肯定。以建设环境友好型、生态健康型畜禽养殖为目标，本发明通过研究发现的一株性能优异的丁酸梭菌，应用于畜禽养殖中，提高畜禽生长性能，降低腹泻率，减少抗生素使用，推动畜禽养殖可持续发展，最终实现畜禽养殖与生态环境协调发展。畜禽养殖过程中，腹泻疾病具有很高的死亡率，畜禽急性腹泻采用常规方法难以预防，而且急性腹泻发生后，常规药物治疗往往具有滞后性，导致畜禽死亡率难以降低。丁酸梭菌是一种严格厌氧生长的益生菌，一方面可以形成梭状芽孢，具有优良的抗逆性、耐高温等生物学特性，另一方面可以代谢产生乙酸、丁酸等多种代谢产物，促进乳酸菌和双歧杆菌增殖，并有效抑制肠道致病菌生长。作为一种新的微生态制剂，丁酸梭菌具有可以产酸和产芽孢的优点，以及在预防畜禽养殖常见的腹泻效果显著。良好的加工性能和突出的饲喂功能，使得丁酸梭菌逐渐成为饲料微生态制剂行业中重要一员。丁酸梭菌应用于畜禽规模化养殖中，为实现绿色养殖，减少抗生素添加具有重要的作用。技术实现要素：本发明针对传统畜禽养殖过程中存在的腹泻问题提出一种新型的益生丁酸梭菌及其应用。为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：一种丁酸梭菌,从鸡粪中分离得到,该菌株命名为丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)wl-53，已于2019年4月12日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏编号为cctccno:m2019252。菌株制备方法为：采集养鸡场的新鲜鸡粪10份，分别称取25g样品，加入225ml无菌水，制备成悬液，涂布于厌氧菌琼脂平板上，37℃厌氧培养72小时。选取单个菌落逐一观察菌体形态，筛选出镜检为梭状的菌体，进一步划线，纯化3次，以获得纯菌株。菌株种子液制备方法为：挑取一个丁酸梭菌wl-53单菌落，接种于50ml新鲜肉汤培养基中，组分为葡萄糖10g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠5g/l、硫乙醇酸钠1g/l，37℃厌氧培养48h，即为种子液。扩大培养：以10％的接种量转接至新鲜肉汤培养基中，37℃厌氧培养，芽孢形成达90％以上时，停培，即可制成液体菌剂。菌粉制备方法为：首先，厌氧培养好的丁酸梭菌wl-53菌液分装于样品瓶中，冷藏于4℃条件下，保持菌液新鲜；然后，设定离心条件为4000rpm，10min，菌液经过离心后，弃去上清液，收集丁酸梭菌wl-53菌体备用；最后，选择玉米淀粉为载体，将玉米淀粉与收集的丁酸梭菌wl-53菌体按照1:1的比例搅拌混匀，在干燥箱中60℃烘干24h，粉碎后即得丁酸梭菌wl-53菌粉。上述丁酸梭菌在饲料添加剂中的应用。包含上述丁酸梭菌的微生物制剂。上述生物制剂为丁酸梭菌的液体制剂或菌粉。上述的微生物制剂为包括丁酸梭菌wl-53的液体菌剂，按体积百分比为0.001％-1％的比例添加至畜禽饮用中。上述的微生物制剂为包括丁酸梭菌wl-53的菌粉，按质量百分比为0.01％-1％的比例添加至畜禽饲料中。上述的微生态制剂应用于畜禽养殖中，有效改善日增重、料重比等生产性能，降低畜禽腹泻率，提高养殖经济效益。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：本发明丁酸梭菌分离自养鸡场的新鲜鸡粪便中，对养殖动物的病原性大肠杆菌、产气荚膜梭菌有显著抑制作用。丁酸梭菌厌氧发酵培养后，可制成液体菌剂产品，供养殖动物饮用发挥益生作用。发酵菌液可以进一步干燥加工，制成活菌菌粉，作为固体菌剂添加到畜禽饲料后，饲喂动物。该菌应用于畜禽养殖，有效改善养殖动物健康状况，提高生产性能，降低畜禽肠炎腹泻发生率，减少抗生素使用，为畜禽行业绿色养殖提供支持。附图说明图1为丁酸梭菌wl-53芽孢形态图。具体实施方式为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。实施例1丁酸梭菌wl-53分离及鉴定：1、丁酸梭菌分离及纯化采集养鸡场的新鲜鸡粪10份，分别称取25g样品，加入225ml无菌水，制备成悬液，涂布于厌氧菌琼脂平板上，37℃厌氧培养72小时。选取单个菌落逐一观察菌体形态，筛选出镜检为梭状的菌体，进一步划线，纯化3次，以获得纯菌株。2、丁酸梭菌鉴定1)生理生化特征：在厌氧琼脂培养基上培养72小时，呈现为灰白色、不透明、表面光滑、直径约1-3mm菌落；经革兰氏染色观察，呈阳性、对生杆状，芽孢为梭状，位于中间或端部；v-p试验(-)，明胶水解(-)，吲哚试验(-)，水解淀粉(+)，水解酪蛋白(-)。2)16srrna基因测定：提取上述菌株的基因组dna，利用pcr技术扩增16srrna序列，测序后获得长度为1428bp的片段。通过blast比对分析，与公布的多株丁酸梭菌的16srrna序列相似度为99.99％，与其他菌株16srrna序列菌相似度低于99％。鉴定证实该菌株为丁酸梭菌，与生化鉴定结果一致。将该菌株命名为丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)wl-53，已于2019年4月12日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏编号为cctccno:m2019252。实施例2：丁酸梭菌wl-53菌液制备1、种子液制备：挑取一个丁酸梭菌wl-53单菌落，接种于50ml新鲜肉汤培养基中，组分为葡萄糖10g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠5g/l、硫乙醇酸钠1g/l，37℃厌氧培养48h，即为种子液；2、扩大培养：以10％的接种量转接至新鲜肉汤培养基中，37℃厌氧培养，芽孢形成达90％以上时，停培，即可制成液体菌剂。实施例3：丁酸梭菌wl-53菌粉制备1、菌液收集：将实施例2中厌氧培养好的丁酸梭菌wl-53菌液分装于样品瓶中，冷藏于4℃条件下，保持菌液新鲜；2、菌体离心：设定离心条件为4000rpm，10min，菌液经过离心后，弃去上清液，收集丁酸梭菌wl-53菌体备用；3、干燥：本实施例选择玉米淀粉为载体，将玉米淀粉与收集的丁酸梭菌wl-53菌体按照1:1的比例搅拌混匀，在干燥箱中60℃烘干24h，粉碎后即得丁酸梭菌wl-53菌粉。4、菌粉菌量测定：称取1g丁酸梭菌wl-53菌粉，加入9ml无菌水，振荡混匀，用无菌水以10倍梯度逐级稀释，采用厌氧琼脂倾注法计数菌量，经统计菌粉活菌量为100亿cfu/g。对本实施例制得的菌粉进行稳定性和耐热性研究,结果如下表所示。表1丁酸梭菌wl-53菌粉存放稳定性实验(25℃)存储时间(月)活菌量检测(cfu/g)菌株存活率01.0×1010100％31.0×1010100％69.9×10999％99.6×10996％129.6×10996％159.4×10994％189.3×10993％249.0×10990％将本实施例制得的丁酸梭菌放入烘箱中,对应表2中的试验温度和干燥时间分别进行处理,每个实验条件重复3次,统计实验数据。考察不同温度和干燥时间下丁酸梭菌的存活率，进而得到丁酸梭菌wl-53的耐热性数据。活菌测定采用稀释倒平板法。结果如表2所示。表2丁酸梭菌wl-53菌粉耐热性实验从表1和表2检测结果可知，本实施例制得的丁酸梭菌wl-53具有非常好的稳定性和耐热性。实施例4：丁酸梭菌wl-53拮抗肠道病原菌能力丁酸梭菌wl-53属于严格厌氧菌，在其生长过程中，代谢产生多种有机酸，包括乙酸、丁酸等，能有效抑制肠道病原微生物的生长和繁殖。1、制备指示平板：本实施例所用的病原菌为分离自病鸡肠道的大肠杆菌(血清型o1)，及购买的产气荚膜梭菌atcc13124标准株，在营养肉汤中培养至对数期，按照比例0.1％添加在营养琼脂中，倾倒至90mm培养皿中，凝固后，用打孔器在培养基上打孔；2、制备wl-53上清：将37℃培养的丁酸梭菌wl-53菌液，分装在无菌的离心管中，设定离心条件为4000rpm，10min，离心结束，收集上清液；3、抑菌：取20μl步骤2的上清液，加入培养基孔中，放置于37℃培养箱中，过夜培养；4、测量抑菌圈：结果如表3所示，抑菌圈直径越大，表明丁酸梭菌wl-53对肠道病原菌抑菌效果越显著。表3丁酸梭菌对病原菌抑制情况实施例5：丁酸梭菌wl-53对肉鸡生产性能的影响采购1000只健康1日龄白羽肉鸡，随机分成两组，即对照组和实验组，每个处理组10个重复，每个重复50只鸡，生产试验期为35天，其中对照组仅为饲喂普通商品日粮+自来水饮水，实验组为饲喂普通商品日粮+0.005％丁酸梭菌wl-53液体菌剂饮水，测量试验过程中各组肉鸡的平均日增重、料重比和腹泻率情况，收集第28日各组的新鲜鸡粪便，考察粪便中的乳酸菌、大肠菌群、产气荚膜梭菌变化情况，实验结果如表4所示：表4肉鸡生产性能统计分析经统计分析，由表4可知，全期来看，实验组和对照组肉鸡料重比差异不显著，而实验组平均日增重、腹泻率与对照差异显著(p＜0.05)。测试指标中，实验组平均日增重和腹泻率显著优于对照组。通过在肉鸡养殖中，饮水添加0.005％丁酸梭菌wl-53后，显著地改善了肉鸡的平均日增重，降低腹泻率，减少了养殖户损失，增加了经济效益。表528日龄肉鸡粪便菌群检测情况在饲喂实验中，28日龄肉鸡肠道菌群接近稳定，因此，选取第28日新鲜粪便进行菌群检测分析，由表5试验分析，1)益生菌乳酸菌实验组菌量显著高于对照组(p＜0.05)，2)肠道病原菌大肠菌群和产气荚膜梭菌的菌量，实验组远低于对照组(p＜0.05)，这说明饲喂过程中，实验组饮水添加丁酸梭菌wl-53，对肉鸡肠道的益生菌增殖有明显促进作用，而对肠道病原菌起到显著抑制作用，优于对照组。在肉鸡饲喂过程中添加丁酸梭菌wl-53，实现了改善并提高肉鸡肠道菌群结构。实施例6：丁酸梭菌wl-53对断奶仔猪养殖的影响选择180头25日龄大白二元断奶仔猪，随机分成3个处理组，每个处理组6个重复，每个重复10头猪，公母各半，其中对照组饲喂普通仔猪日粮，处理组1饲喂添加0.01％丁酸梭菌wl-53菌粉的普通仔猪日粮，处理组2饲喂添加0.05％丁酸梭菌wl-53菌粉的普通仔猪日粮，考察断奶仔猪从25日后的四周时间内的生长性能和腹泻情况，实验结果如表6所示：表6仔猪生长性能统计分析实验对断奶仔猪进行平均日增重、料重比和腹泻率进行测定，由表6的统计分析结果可知，处理组1和2在平均日增重、料重比、腹泻率方面，与对照组差异性显著(p＜0.05)。处理组1和2对比，差异不显著。表明，处理组1和2添加丁酸梭菌wl-53后，对断奶仔猪生长性能均有显著提升。因此，从饲喂成本和生长性能综合评估，处理组1在普通仔猪日粮中添加0.01％丁酸梭菌wl-53菌粉，可以满足断奶仔猪养殖所需，达到改善断奶仔猪生长性能和降低腹泻率的效果。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。sequencelisting<110>山东蔚蓝生物科技有限公司<120>一种益生丁酸梭菌及其应用<130>1<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1428<212>dna<213>人工序列<400>1tgagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgagc60gatgaagctccttcgggagtggattagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctg120cctcatagaggggaatagcctttcgaaaggaagattaataccgcataagattgtagtacc180gcatggtacagcaattaaaggagtaatccgctatgagatggacccgcgtcgcattagcta240gttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcgg300ccacattgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgc360acaatgggggaaaccctgatgcagcaacgccgcgtgagtgatgacggtcttcggattgta420aagctctgtctttagggacgataatgacggtacctaaggaggaagccacggctaactacg480tgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttactgggcgtaaag540ggagcgtaggtggatatttaagtgggatgtgaaatacccgggcttaacctgggtgctgca600ttccaaactggatatctagagtgcaggagaggaaaggagaattcctagtgtagcggtgaa660atgcgtagagattaggaagaataccagtggcgaaggcgcctttctggactgtaactgaca720ctgaggctcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaa780acgatgaatactaggtgtaggggttgtcatgacctctgtgccgccgctaacgcattaagt840attccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacgggggcccgca900caagcagcggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacctagacttgac960atctcctgaattactctgtaatggaggaagccacttcggtggcaggaagacaggtggtgc1020atggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccc1080ttattgttagttgctaccatttagttgagcactctagcgagactgcccgggttaaccggg1140aggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtctagggctacacacgtgct1200acaatggtcggtacaatgagatgcaacctcgcgagagtgagcaaaactataaaaccgatc1260tcagttcggattgtaggctgaaactcgcctacatgaagctggagttgctagtaatcgcga1320atcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatga1380gagttggcaatacccaaagttcgtgagctaaccgcaaggaggcagcga1428当前第1页1 2 3