RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR表达载体的构建方法和应用与流程

本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种runx3过表达、pd-1敲减的car表达载体的构建方法和应用。

背景技术：

car-t(chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy)即嵌合抗原受体t细胞免疫疗法，通常指获取肿瘤患者自体t细胞进行改造，体外扩增后回输从而杀伤肿瘤的一种免疫疗法。其基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，taa)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的singlechainantibodyfragment,scfv)，是整个car-t的核心部件，其他结构包括一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区，跨膜区起到连接细胞内外区域的作用，当scfv与肿瘤抗原结合后，信号即可通过tcrε传导至胞内，产生淋巴细胞活化的生物学效应。car-t赋予t细胞以非hla依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，避免肿瘤细胞通过下调hla分子的表达逃避免疫攻击。这使得经过car改造的t细胞相较于天然t细胞表面受体tcr能够识别更广泛的目标，因而更有利于使用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞。

从全球大量开展的car-t临床实验来看，car-t技术在血液肿瘤、淋巴瘤的治疗上具有令人印象深刻的卓越疗效，而在实体瘤方面，有一些令人鼓舞的突破，但还面临着诸多难点问题需要攻克。这些难点主要包括：缺乏肿瘤细胞特异性表达的抗原，屏障存在使得淋巴细胞不易到达肿瘤组织中，免疫抑制微环境常常导致癌细胞免疫逃逸。因此寻找特异表达在癌细胞表面的膜蛋白抗原，增加肿瘤微环境中效应t淋巴细胞浸润，逆转肿瘤微环境中杀伤性t细胞功能耗竭是实体瘤car-t免疫治疗的重点与难点，亦是临床提高肿瘤免疫治疗效果的关键。

runx3是runx家族的转录因子，能与cbfb结合形成异二聚体核心结合因子(cbf)。runx成员通过runt结构域识别dna结合序列5'-tgtggt-3'或5'-tgcggt-3'来调节其靶基因的转录，而cbfb是一个非dna结合调节亚基，它通过变构增强runx特异性结合dna的能力。最近报道显示，runx3能够促进淋巴细胞发育成组织滞留记忆t细胞。在car-t细胞中过表达runx3，促进其发育成组织滞留记忆t细胞，从而利用淋巴细胞组织滞留特性能帮助实体瘤car-t锚定在肿瘤部位，这一策略可能解决肿瘤微环境中效应淋巴细胞浸润不足的困境。

pd-1是一种重要的免疫抑制分子，t细胞被激活后会上调pd-1表达，pd-1被肿瘤细胞或其他免疫性(如巨噬细胞)表面的pdl1激活后，会抑制t细胞杀伤功能，诱导效应t细胞耗竭。而且研究显示，过表达runx3在促进淋巴细胞组织滞留的同时，也会促进pd-1的表达。在car-t细胞中使用敲降pd-1策略，能够抑制pd-1表达，从而延缓通过pd-1途径介导的t细胞功能耗竭，增强car-t细胞杀伤能力。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种runx3过表达、pd-1敲减的car表达载体的构建方法。

本发明的目的是提供一种runx3过表达、pd-1敲减的car表达载体的构建方法和应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予实现：

一种runx3过表达、pd-1敲减的car慢病毒载体质粒，所述载体质粒为plvx慢病毒载体质粒，包含人runx3、pd-1shrna、car三个部分，所述载体质粒序列如seqidno.16所示。

所述runx3基因为人runt-relatedtranscriptionfactor3。

本发明提供了一种敲减人pd-1的shrna，所述shrna为：模板链序列如seqidno.10所述的核苷酸序列。

本发明提供了一种runx3过表达、pd-1敲减的car表达载体，所述载体包括上述runx3和pd-1shrna。

优选的，所述表达载体为plvx慢病毒表达载体，所述car为人ca9car。

本发明还提供一种runx3过表达、pd-1敲减的car重组慢病毒载体质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)利用化学合成法得到基因片段ca9car-p2a，并利用酶切位点ecori和bamhi将基因片段ca9car-p2a克隆至plvx慢病毒质粒载体；

(2)以pcmv3-runx3质粒(义翘神州)为模板，利用序列如seqidno.4所示正向引物和序列如seqidno.5所示反向引物进行pcr，扩增序列如seqidno.6所示基因片段runx3，并利用酶切位点bamhi和mlui克隆入(1)中所得载体p2a之后，得到序列如seqidno.9所示的runx3过表达的ca9car慢病毒质粒载体，命名为plvx-ef1a-ca9car-p2a-runx3；

(3)以plenti-crispr-v2(addgene)为模板，利用序列如seqidno.11所示正向引物和序列如seqidno.12所示反向引物进行pcr，扩增序列如seqidno.13所示基因片段u6-shpd1，并利用酶切位点clai克隆入上述载体质粒plvx-ef1a-ca9car-p2a-runx3，得到序列如seqidno.16所示的runx3过表达、pd-1敲减的ca9car重组慢病毒载体质粒，命名为plvx-u6-shpd1-ef1a-ca9car-p2a-runx3。

优选的，所述步骤(1)中ca9car采用二代car的组成方式，所述ca9car由识别ca9分子的scfv片段，cd8胞外区，cd28跨膜区，4-1bb片段，cd3ζ片段组成。

本发明还提供利用runx3过表达、pd-1敲减的car重组慢病毒表达载体包装慢病毒的方法。

优选的，将重组plvx载体质粒与pspax2包装质粒、pmd2.g包膜质粒共同转染293t细胞，在293t细胞中进行基因转录表达后，包装成功的重组plvx慢病毒载体会释放到细胞培养上清中，收集包含慢病毒的上清液。

本发明还提供慢病毒浓缩的方法。

优选的，将收集的慢病毒上清液装于无菌50ml离心管，在管底加入5ml20％surcose-pbs溶液，4℃12000g离心4h，管底可见白色病毒颗粒。用适量pbs溶解病毒，4℃复苏24h，分装-80℃保存。

本发明还提供一种runx3过表达、pd-1敲减的car-jurkatt细胞。

优选的，所述car-jurkatt细胞的制备方法包括以下步骤：(1)jurkatt细胞的培养；(2)通过所述runx3过表达、pd-1敲减的car慢病毒转染jurkatt细胞；(3)检测jurkatt细胞car和runx3表达。

本发明还提供一种检测pd-1敲减效率的方法。

优选的，jurkatt细胞转染pd-1shrna慢病毒或对照慢病毒，3天后用10ug/mlpha和50ng/mlpma诱导pd-1表达，5天后流式细胞术检测jurkatt细胞pd-1表达情况，确定pd-1敲减效率。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种runx3过表达、pd-1敲减的car慢病毒表达载体的构建和使用方法。

本发明提供了利用runx3过表达、pd-1敲减的car慢病毒表达载体进行慢病毒包装、浓缩、滴度测定的方法。

本发明提供了一种runx3过表达、pd-1敲减的car-jurkatt细胞，证实了利用该runx3过表达、pd-1敲减的car慢病毒表达载体能够生产runx3过表达、pd-1敲减的car-t细胞，pd-1敲减效率约75％。

如背景技术所述，过表达runx3能帮助实体瘤car-t锚定在肿瘤部位，同时敲减pd-1能延缓通过pd-1途径介导的t细胞功能耗竭，从而增强car-t细胞对肿瘤的杀伤能力。本发明将runx3过表达和pd-1敲减策略一起加入car慢病毒表达载体，并验证了利用该慢病毒表达载体包装的慢病毒能够成功使jurkatt细胞表达car的同时，过表达runx3和敲低pd-1，为后续生产runx3过表达、pd-1敲减的car-t细胞提供了基础。

附图说明

图1：ca9car基因的具体构成；

图2：runx3过表达的ca9car重组慢病毒质粒载体plvx-ef1a-ca9car-p2a-runx3的结构图；

图3：runx3过表达、pd-1敲减的ca9car重组慢病毒质粒载体plvx-u6-shpd1-ef1a-ca9car-p2a-runx3的结构图；

图4：runx3过表达、pd-1敲减的ca9car-jurkatt细胞的ca9car流式细胞术检测结果图；

图5：runx3过表达、pd-1敲减的ca9car-jurkatt细胞的runx3蛋白westernblot检测结果图；

图6：pd-1敲减的重组慢病毒质粒载体plvx-u6-shpd1-ef1a-ires-mcherry的结构图；

图7：pd-1shrna敲减效率的流式细胞术检测结果图。

具体实施方式

实施例1：runx3过表达的ca9car重组慢病毒载体构建

目的基因片段ca9car-p2a由安徽通用生物有限公司合成，两端分别带有ecori,bamhi酶切位点，序列如seqidno.1所示，克隆于puc57-simple载体，命名为puc57-ca9car-p2a。puc57-ca9car-p2a和慢病毒载体plvx-ef1a-ires-mcherry用fdecori、fdbamhi(thermofisher)双酶切，经0.7％琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并利用axyprepdnagelextractionkit(axygen)回收。利用t4dnaligase(neb)将plvx载体与ca9car-p2a目的片段连接。酶切、连接的体系和反应条件如下：

表1：thermofisherfastdigest酶切体系和反应条件：

表2：t4dnaligase连接体系和反应条件：

重组质粒转化大肠杆菌：取1支100μlstabl3感受态细胞(康体生命)于冰上化冻，转移至冰上预冷的15ml离心管，加入10μl过夜连接的重组质粒，冰上静置30min。42℃水浴热激60s后，立即置于冰浴2-5min。加入2ml无抗生素的lb培养基，37℃200rpm60min，使抗性基因表达。然后取100μl涂布于含100μg/ml青霉素的lb固体平板，37℃培养16h。

挑选和鉴定成功插入ca9car-p2a的质粒：挑选8个单克隆分别于有10μlddh2o的1.5ml离心管，吹打混匀。取1μl菌液作为模板，利用正向引物ef1a-f-cttccatttcaggtgtcgtg(seqidno.2)和反向引物ca9car-r-ctgatggtcactctctgtccag(seqidno.3)作菌落pcr。pcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，成功插入ca9car-p2a的克隆可见约600bp条带，命名为plvx-ef1a-ca9car-p2a。菌落pcr反应体系和反应条件如下：

表3：菌落pcr反应体系如下：

表4：菌落pcr反应条件如下：

菌落pcr阳性的克隆剩余菌液于4ml含100μg/ml青霉素的lb中扩增，37℃200rpm16h。用axyprepminiplasmidkit(axygen)提取质粒，并送商业公司测序。

pcr扩增目的基因片段runx3：以pcmv3-runx3(义翘神州)为模板，利用正向引物runx3-f-ecori-aacaacggatccatggcatcgaacagcat(seqidno.4)和反向引物runx3-r-bamhi-aacaacacgcgtcatcagtagggccgccacac(seqidno.5)作pcr扩增目的基因片段runx3(seqidno.6)。下划线序列为酶切位点。pcr反应体系和扩增条件如下：

表5：pcr反应体系如下：

表6：pcr扩增条件如下：

pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并利用axyprepdnagelextractionkit(axygen)回收。质粒plvx-ef1a-ca9car-p2a和回收的目的基因片段runx3经fdbamhi、mlui(neb)双酶切，酶切体系和条件同表1。酶切的pcr产物经axypreppcrclean-upkit(axygen)纯化回收，酶切的载体经琼脂糖凝胶电泳分离后切出目的条带并利用axyprepdnagelextractionkit(axygen)回收。利用t4dnaligase(neb)将载体与目的片段连接，连接体系和条件同表2。接着转化至大肠杆菌stabl3，转化步骤同“重组质粒转化大肠杆菌”。

挑选和鉴定成功插入runx3的质粒：挑选8个单克隆分别于有10μlddh2o的1.5ml离心管，吹打混匀。取1μl菌液作为模板，利用正向引物wpre-r-gcagcgtatccacatagcgt(seqidno.7)和反向引物runx3-f-aggaccagaccaagccgtt(seqidno.8)作菌落pcr，菌落pcr反应体系同表3，反应条件同表4。pcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，成功插入runx3的克隆可见约800bp条带，命名为plvx-ef1a-ca9car-p2a-runx3，序列如seqidno.9所示。

菌落pcr阳性的克隆剩余菌液于4ml含100μg/ml青霉素的lb中扩增，37℃200rpm16h。用axyprepminiplasmidkit(axygen)提取质粒，并送商业公司测序。测序正确的质粒-20℃保存备用。

实施例2：runx3过表达、pd-1敲减的ca9car重组慢病毒载体构建

在sigma公司的shrna库查找人pd-1的shrna，得到一条pd-1shrna模板链序列为ccggggatttccagtggcgagagaactcgagttctctcgccactggaaatccttttttg，下划线为shrna正反义链序列。替换loop环序列为cctctcaacactgg，去除粘性末端，得pd-1shrna模板链序列为ggatttccagtggcgagagaacctctcaacactggttctctcgccactggaaatccttttt(seqidno.10)。

pcr扩增目的基因片段u6-shpd1：以plenti-crispr-v2(addgene)为模板，利用正向引物u6-f-clai-aacaacatcgatgagggcctatttcccatgat(seqidno.11)和反向引物shpd1-r-clai-accaccatcgataaaaaggatttccagtggcgagagaaccagtgttgagaggttctctcgccactggaaatccggtgtttcgtcctttccac(seqidno.12)作pcr扩增目的基因片段u6-shpd1(seqidno.13)。pcr反应体系同表5，扩增条件同表6。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并利用axyprepdnagelextractionkit(axygen)回收。

质粒plvx-ef1a-ca9car-p2a-runx3转化trans110感受态细胞并涂板，挑取单克隆扩增后，利用axyprepminiplasmidkit(axygen)提取质粒，去除clai位点甲基化。去甲基化的质粒plvx-ef1a-ca9car-p2a-runx3和回收的目的基因u6-shpd1利用fdclai(thermofisher)单酶切，酶切体系同表1。酶切的质粒和pcr产物经axypreppcrclean-upkit(axygen)纯化回收。利用t4dnaligase(neb)将载体与目的片段连接，连接体系同表2。接着转化至大肠杆菌stabl3，转化步骤同“重组质粒转化大肠杆菌”。

挑选和鉴定成功插入u6-shpd1的质粒：挑选8个单克隆分别于有10μlddh2o的1.5ml离心管，吹打混匀。取1μl菌液作为模板，利用正向引物clai-f-tacagggacagcagagatccag(seqidno.14)和反向引物clai-r-(seqidno.15)作菌落pcr，菌落pcr反应体系同表3，反应条件同表4。pcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，成功插入u6-shpd1的克隆可见约350bp条带，命名为plvx-u6-shpd1-ef1a-ca9car-p2a-runx3，序列如seqidno.16所示。

菌落pcr阳性的克隆剩余菌液于4ml含100μg/ml青霉素的lb中扩增，37℃200rpm16h。用axyprepminiplasmidkit(axygen)提取质粒，并送商业公司测序。测序正确的质粒-20℃保存备用。用含100μg/ml青霉素的lb培养基扩增测序正确的克隆，用endo-freeplasmidmaxikit(omega)大量抽提质粒备用。

实施例3：慢病毒包装和浓缩

hek293t(atcc)用10％fbs、4mmglutamin、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的dmem(下简称dmem完全培养基)培养和扩增。包装病毒用hek293t保证状态良好，传代次数小于20。

准备1个无菌1.5ml离心管，加入无血清无双抗optimem培养基0.5ml，再加入载体质粒(如plvx-ef1a-ires-mcherry、plvx-u6-shpd1-ef1a-ca9car-p2a-runx3)5μg、包装质粒pspax23.75μg、包膜质粒pmd2.g1.25μg，吹打混匀。准备1个无菌1.5ml离心管，加入无血清无双抗optimem培养基0.5ml，再加入3μlpeimax(1mg/ml,polysciences)，吹打混匀。将peimax溶液加入dna溶液中，轻轻吹打混匀，室温静置10-30min。

用胰酶消化和收集hek293t细胞，用10％fbs的optimem重悬hek293t细胞，计数。每个10cm培养皿加入100万细胞，用10％fbs的optimem补充培养基体积至9ml，混匀。

将孵育完毕的dna/peimax混合溶液均匀加入上述10cm培养皿，轻轻混匀，37℃5％co2培养16h。16h后换液，加入10mldmem完全培养基。

48h后收集含病毒上清液，加入10mldmem完全培养基。病毒上清于4℃保存。72h再次收集病毒上清。

两次收集的病毒上清1200g离心10min，上清用0.45μm的滤网过滤，收集于无菌50ml离心管。在管底加入5ml20％surcose-pbs溶液，12000g4℃离心4h，离心机升速7降速3。4h后可见管底白色病毒沉淀，弃上清，用1/200病毒上清体积的pbs溶解病毒，4℃复苏24h，分装-80℃保存。

实施例4：慢病毒的滴度检测

在96孔细胞培养板中接种hek293t细胞(2×10⁵/ml)，每孔10⁴，50μl/孔。培养基中含有10μg/ml的polybrene。

每孔补加50μl带有1μl、0.1μl、0.01μl、0.001μl病毒浓缩液的培养基，混匀。

37℃，5％co2，培养72h。然后利用胰酶消化回收细胞，流式细胞术检测hek293t细胞感染阳性率。

流式细胞术检测细胞感染阳性率：胰酶消化和收集细胞，plvx-ef1a-ires-mcherry包装的慢病毒带有红色荧光，可用mcherry或pe通道直接检测。表达ca9car的细胞，收集后用100μl2％fbs-pbs重悬细胞，然后用重组人ca9-fc蛋白(义翘神州)孵育，使之与ca9car结合；用2％fbs-pbs清洗细胞，再用二抗pe-anti-human-fcantibody(biolegend)孵育，使之与ca9-fc蛋白结合；最后用2％fbs-pbs清洗细胞后用pe通道检测。

取感染率约10％-30％的组计算病毒滴度，病毒滴度(tu/ml)＝感染阳性率×10⁴×1000/加入的病毒液体积(μl)。一般，检测浓缩的plvx-ef1a-ires-mcherry慢病毒滴度约1-10x10^8tu/ml。

实施例5：runx3过表达、pd-1敲减的ca9car-jurkatt细胞的制备

为方便检测runx3过表达、pd-1敲减的ca9car慢病毒是否有效，本发明先转染jurkatt细胞系进行检测。

jurkatt细胞感染慢病毒：jurkat细胞用10％fbsrmpi培养基培养。取2x10^5jurkat细胞于无菌1.5ml离心管，体积不超过0.5ml，按moi1-5加入慢病毒，再加入polybrene使终浓度为8μg/ml，然后800g32℃水平离心45min。离心完毕后重悬并转移细胞至24孔板，补充培养基至1ml，37℃5％co2培养24h，换液。72h后检测ca9car和runx3表达情况。

流式细胞术检测ca9car表达：收集细胞，用100μl2％fbs-pbs重悬细胞，然后用重组人ca9-fc蛋白(义翘神州)孵育，使之与ca9car结合；用2％fbs-pbs清洗细胞，再用二抗pe-anti-human-fcantibody(biolegend)孵育，使之与ca9-fc蛋白结合；用2％fbs-pbs清洗细胞后用pe通道检测。成功检测到ca9car表达，结果如附图4所示。

westernblot检测runx3表达：收集细胞，ripa法裂解细胞提取总蛋白，bsa法测定总蛋白浓度后，加入4xsds-pageloadingbuffer(introgen)并调整蛋白浓度为2mg/ml，100℃加热5min灭活蛋白，-80℃保存。以jurkatt细胞总蛋白为空白对照，以pcdh-cmv-runx3-ef1-gfp-puro质粒(本实验室构建)包装慢病毒并转染的jurkatt细胞总蛋白和plvx-u6-shpd1-ef1a-ca9car-p2a-runx3质粒转染的hek293t总蛋白为阳性对照，进行sds-page电泳，然后转移至硝酸纤维素膜。以gadph为参照，5％牛奶封闭后，硝酸纤维素膜裁出相应大小区段，分别孵育anti-human-gadph(碧云天)和anti-human-runx3(cst)一抗，洗膜后再孵育相应hrp二抗，然后利用化学曝光仪曝光拍照，成功检测到runx3过表达，结果如附图5所示。

实施例6：pd-1shrna敲减效率检测

为准确检测pd-1shrna的敲减效率，我们将质粒plvx-u6-shpd1-ef1a-ca9car-p2a-runx3中的ca9car-p2a-runx3用ires-mcherry替代，构建了质粒plvx-u6-shpd1-ef1a-ires-mcherry，质粒结构图如附图6所示，并包装慢病毒。

jurkatt细胞感染慢病毒，具体步骤同“jurkatt细胞感染慢病毒步骤”，72h后加入含10ug/mlpha(solarbio)和50ng/mlpma(sigma)的rmpi完全培养基，37℃5％co2培养48h。

流式细胞术检测pd-1表达：48h后收集细胞，用humanfcblocker封闭fc受体后，再用apc-anti-human-pd1antibody(biolegend)孵育，使之结合jurkatt细胞表面pd-1，2％fbs-pbs清洗细胞后用apc通道检测。与转染plvx-ef1a-ires-mcherry慢病毒的jurkatt细胞相比，转染plvx-u6-shpd1-ef1a-ires-mcherry的jurkatt细胞表达pd-1明显减少，敲减效率约75％，结果如附图7所示。

序列表

<110>浙江大学医学院附属第一医院

<120>runx3过表达、pd-1敲减的car表达载体的构建方法和应用

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1695

<212>dna

<213>基因片段(ca9car-p2a)

<400>1

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>引物(ef1a-f)

<400>2

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>引物(ca9car-r)

<400>3

<210>4

<211>29

<212>dna

<213>引物(runx3-f-ecori)

<400>4

<210>5

<211>32

<212>dna

<213>引物(runx3-r-bamhi)

<400>5

<210>6

<211>1316

<212>dna

<213>基因片段(runx3)

<400>6

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>引物(wpre-r)

<400>7

<210>8

<211>19

<212>dna

<213>引物(runx3-f)

<400>8

<210>9

<211>10566

<212>dna

<213>质粒(plvx-ef1a-ca9car-p2a-runx3)

<400>9

<210>10

<211>61

<212>dna

<213>基因片段(pd-1shrna)

<400>10

<210>11

<211>32

<212>dna

<213>引物(u6-f-clai)

<400>11

<210>12

<211>92

<212>dna

<213>引物(shpd1-r-clai)

<400>12

<210>13

<211>334

<212>dna

<213>基因片段(u6-shpd1)

<400>13

<210>14

<211>22

<212>dna

<213>引物(clai-f)

<400>14

<210>15

<211>19

<212>dna

<213>引物(clai-r)

<400>15

<210>16

<211>10882

<212>dna

<213>质粒(plvx-u6-shpd1-ef1a-ca9car-p2a-runx3)

<400>16