1.一种runx3过表达、pd-1敲减的car慢病毒载体质粒,其特征在于,所述载体质粒为plvx慢病毒载体质粒,包含人runx3、pd-1shrna、car三个部分,所述载体质粒序列如seqidno.16所示。
2.根据权利要求1所述的runx3过表达、pd-1敲减的car慢病毒载体质粒,其特征在于,敲减人pd-1的shrna模板链序列如seqidno.10所示核苷酸序列。
3.一种runx3过表达、pd-1敲减的car慢病毒载体质粒的构建方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)利用化学合成法得到基因片段ca9car-p2a,并利用酶切位点ecori和bamhi将基因片段ca9car-p2a克隆至plvx慢病毒质粒载体;
(2)以pcmv3-runx3质粒为模板,利用序列如seqidno.4所示正向引物和序列如seqidno.5所示反向引物进行pcr,扩增序列如seqidno.6所示基因片段runx3,并利用酶切位点bamhi和mlui克隆入(1)中所得载体p2a之后,得到质粒plvx-ef1a-ca9car-p2a-runx3;
(3)以plenti-crispr-v2为模板,利用序列如seqidno.11所示正向引物和序列如seqidno.12所示反向引物进行pcr,扩增序列如seqidno.13所示基因片段u6-shpd1,并利用酶切位点clai克隆入上述载体质粒plvx-ef1a-ca9car-p2a-runx3,得到质粒plvx-u6-shpd1-ef1a-ca9car-p2a-runx3。
4.一种runx3过表达、pd-1敲减的car慢病毒载体质粒在生产runx3过表达、pd-1敲减的car慢病毒中的应用。
5.根据权利要求4所述的runx3过表达、pd-1敲减的car慢病毒载体质粒在生产runx3过表达、pd-1敲减的car慢病毒中的应用,其特征在于,所述慢病毒包装和浓缩方法包括以下步骤:
(1)将慢病毒载体质粒与pspax2包装质粒、pmd2.g包膜质粒共同转染293t细胞,48h和72h后分别收集包含慢病毒的上清液;
(2)将收集的慢病毒上清液装于无菌50ml离心管,在管底加入5ml20%surcose-pbs溶液,4℃12000g离心4h,管底可见白色病毒颗粒,用适量pbs溶解病毒,4℃复苏24h,分装-80℃保存。
6.根据权利要求4所述的runx3过表达、pd-1敲减的car慢病毒载体质粒在生产runx3过表达、pd-1敲减的car慢病毒中的应用,其特征在于,一种runx3过表达、pd-1敲减的car-jurkatt细胞,所述car-jurkatt制备方法包括以下步骤:
(1)利用权利要求5所述runx3过表达、pd-1敲减的car慢病毒感染jurkatt细胞;
(2)检测jurkatt细胞car、runx3表达情况;
(3)检测pd-1shrna敲减效率,pd-1shrna敲减效率检测方法,包括以下步骤:jurkatt细胞转染pd-1shrna慢病毒或对照慢病毒,3天后用10ug/mlpha和50ng/mlpma诱导pd-1表达,5天后流式细胞术检测jurkatt细胞pd-1表达情况,确定pd-1敲减效率。