一种表达酮式类胡萝卜素的融合基因、重组载体及其应用的制作方法

本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种表达酮式类胡萝卜素的融合基因、重组载体及其应用。

背景技术：

类胡萝卜素是除叶绿素外的第二大色素，在植物和自养微生物的光和代谢、光保护、抗氧化等方面有重要的功能，角黄质、虾青素等酮式类胡萝卜素对人们的身体健康有重要的作用。以虾青素为例，它的抗氧化能力是叶黄素、玉米黄素、β-胡萝卜素的10倍多，是维生素e的100倍。有实验证明虾青素可以有效提高人体免疫力，在预防心血管疾病、糖尿病、癌症等疾病方面有明显的作用；又由于其良好的着色能力，虾青素在水产养殖、医药、化妆品以及保健品领域具有广阔的应用前景。

目前市场上的虾青素主要来源于生物提取和化工合成，化工合成的虾青素主要由三种构型(3s,3’s、3r,3’s、3r,3’r)构成，生物体内的天然虾青素主要由(3s,3’s)构成。

天然虾青素主要来源于海洋微藻、真菌(红法夫酵母)和微生物(细菌)等，植物中只有夏侧金盏花可以在其花瓣中少量的合成虾青素。通过比较，雨生红球藻中天然虾青素的含量相对较高，可以达到细胞干重的4％，是天然虾青素生产的主要来源，但是雨生红球藻生长缓慢、自养周期长、易于污染并且藻类破壁提取虾青素困难等诸般难题成为虾青素大量生产的瓶颈。由于虾青素的自然资源有限，科学家们都在通过基因工程方法寻求不同的植物来生产更高产量的天然虾青素，并在莴苣、马铃薯、小麦、油菜、烟草、番茄和水稻等植物中获得成功。

油菜是我国广泛种植的一种油料作物，种植面积历年占全国油料作物总面积的40％以上，产量占全国油料作物总量的30％以上。脂肪酸是食用油的主要组成成分，主要包括饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，研究表明不饱和脂肪酸的摄入容易引起高血压和动脉粥样硬化等疾病，而亚油酸具有降低高血压和动脉粥样硬化的作用，菜籽油中的主要脂肪酸为油酸，亚油酸和亚麻酸的含量相对较少，通过各种食用油之间品质的比较发现菜籽油从脂肪酸、油酸以及各种微量元素组成方面有显著地优势。今后的油菜育种目标应在保证其营养价值的同时提高其保健功能，如利用转基因提高类胡萝卜素、维生素和植物甾醇类等次生代谢产物的含量。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达酮式类胡萝卜素的融合基因、重组载体及其应用，可在油菜全株中表达酮式类胡萝卜素，尤其是在种子中可高表达酮式类胡萝卜素、亚油酸和虾青素。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种表达酮式类胡萝卜素的融合基因，所述融合基因的结构包括：八氢番茄红素合成酶基因-β胡萝卜素羟化酶基因-β胡萝卜素酮化酶基因-血红蛋白基因；相邻两个基因间以2a序列和拟南芥核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因信号肽序列tp连接。

优选的，所述八氢番茄红素合成酶基因来源于欧文氏菌(erwiniauredovora)；所述β胡萝卜素羟化酶基因来源于雨生红球藻(haematococcμsplμvialis)；所述β胡萝卜素酮化酶基因来源于莱茵衣藻(chlamydomonasreinhartii)；所述血红蛋白基因来源于粪类玻璃体菌(vitreoscillastercoraria)；所述2a序列为手足口病2a自切割肽段。

优选的，所述融合基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了一种包含所述融合基因的重组载体。

优选的，所述重组载体以pbi121为基础载体，将所述融合基因构建到camv35s启动子下游。

本发明还提供了一种包含所述融合基因或所述重组载体的重组菌，所述重组菌以农杆菌为基础菌株。

本发明还提供了一种在油菜中表达酮式类胡萝卜素的方法，包括以下步骤：利用所述重组菌侵染甘蓝型油菜。

优选的，在所述侵染后，还包括转基因阳性验证。

优选的，所述转基因阳性验证包括观察验证，转基因阳性苗呈红色。

优选的，所述转基因阳性验证包括pcr验证，所述pcr验证的引物包括正向引物f和反向引物r，所述正向引物f的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述反向引物r的核苷酸序列如seqidno.3所示。

本发明提供了一种表达酮式类胡萝卜素的融合基因，将八氢番茄红素合成酶基因crtb、β胡萝卜素羟化酶基因hpbhy、β胡萝卜素酮化酶基因crbkt和血红蛋白基因vhb构建成融合基因，并用2a连接使基因使融合基因表达高效一致，在camv35s启动子调控下，通过转化再生，转基因植株的叶片、茎秆、花、种子，以及种子压榨后的油与对照相比都表现出明显的红色；通过对种子中色素进行分析发现，种子中总的类胡萝卜素含量达到153μg/g，是对照组的5倍，其中酮式类胡萝卜素含量可以达到41.11μg/g，是总类胡萝卜素的26.7％，而虾青素含量可以达到6.19μg/g；通过脂肪酸的测定发现，野生型油菜中油酸(68.3％)为主要脂肪酸，经转基因后油菜种子中的主要脂肪酸为亚油酸(68.65％)，总的不饱和脂肪酸的含量没有显著的变化；通过对转基因油菜和非转基因油菜种子的抗氧化能力进行检测，结果显示转基因油菜种子抗氧化能力为23.26μmoltrolox/g，高于非转基因油菜种子的抗氧化能力18.31μmoltrolox/g。

附图说明

图1为重组载体的结构图；

图2为转基因油菜与对照组油菜颜色对照；其中a为对照组(左)和转基因组(右)油菜幼苗；b为对照组(左)和转基因组(右)油菜花序；c为对照组(左)和转基因组(右)油菜种子；d为对照组(左)和转基因组(右)油菜油；

图3为bbbv转化油菜苗pcr检测的凝胶成像图；

图4为野生型和转基因油菜的种子色谱图，其中a为野生型westar的色素谱图；b为转基因油菜bbbv种子色素谱图，在图中峰1表示叶黄素；峰2表示叶绿素；峰3表示β-胡萝卜素；峰4表示双-酮式叶黄素；峰5表示虾青素；峰6表示单-酮式叶黄素；峰7表示角黄质；峰8表示酯化的酮式叶黄素；峰9表示β-隐黄质；峰10表示海胆酮；峰11表示番茄红素；峰12表示ε-胡萝卜素。

具体实施方式

本发明提供了一种表达酮式类胡萝卜素的融合基因，所述融合基因的结构包括：八氢番茄红素合成酶基因-β胡萝卜素羟化酶基因-β胡萝卜素酮化酶基因-血红蛋白基因；相邻两个基因间以2a序列和拟南芥核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因信号肽序列tp连接。

本发明所述融合基因自5’端至3’端的结构如图1所示，其中所述八氢番茄红素合成酶基因(crtb)优选来源于欧文氏菌(erwiniauredovora)；所述β胡萝卜素羟化酶基因(hpbhy)优选来源于雨生红球藻(haematococcμsplμvialis)；所述β胡萝卜素酮化酶基因(crbkt)优选来源于莱茵衣藻(chlamydomonasreinhartii)；所述血红蛋白基因(vhb)优选来源于粪类玻璃体菌(vitreoscillastercoraria)；所述2a序列优选为手足口病2a自切割肽段。本发明所述基因的登录号分别为：crtb(genbank:cp001875.2)，hpbhy(genbank:kp866868.1)，crbkt(genbank:ay860820.1)，vhb(genbank:af274976.1)，tp(genbank:bah57175.1)。本发明所述2a序列的核苷酸序列优选如seqidno.4所示：cagctgctgaactttgatctgctgaaactggctggtgacgtggagtctaaccct。本发明在将所述基因进行融合前，优选还包括根据不同生物密码子偏好性，对所用基因进行密码子优化，经优化后形成的融合基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明所述2a序列连接四个目的基因，使其可以协同一致的表达，克服了多基因转化中基因表达不一致的现象；且可以在融合基因完成翻译后，通过2a序列自切割实现每个基因的分离。本发明对所述融合基因的获得并没有特殊限定，优选利用全基因合成的方式获得。

本发明还提供了一种包含所述融合基因的重组载体。

本发明所述重组载体优选以pbi121为基础载体，将所述融合基因构建到camv35s启动子下游。本发明对所述重组载体的构建方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。本发明将所述重组载体命名为表达载体pbi121-bbbv(简称bbbv)。

本发明还提供了一种包含所述融合基因或所述重组载体的重组菌，所述重组菌以农杆菌为基础菌株。本发明对所述农杆菌的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售农杆菌感受态即可。在本发明实施例中，优选利用常规市售农杆菌lba4404。

本发明还提供了一种在油菜中表达酮式类胡萝卜素的方法，包括以下步骤：利用所述重组菌侵染甘蓝型油菜。

本发明对所述侵染的方法并没有特殊限定，优选通过农杆菌介导的遗传转化方法进行。本发明在所述侵染后，优选还包括转基因阳性验证，所述转基因阳性验证优选包括观察验证，因为表达载体所用启动子为camv35s，在植株生长各组织中都可以表达，因此转化苗为红色，通过红色可以确定阳性植株。本发明所述转基因阳性验证优选还包括pcr验证，所述pcr验证的引物包括正向引物f和反向引物r，所述正向引物f的核苷酸序列优选如seqidno.2所示：gaacctggcagtgtggttc，所述反向引物r的核苷酸序列优选如seqidno.3所示：aaaggactgcaggcgggatg。本发明对所述pcr验证的体系和程序并没有特殊限定。

下面结合实施例对本发明提供的表达酮式类胡萝卜素的融合基因、重组载体及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.油菜品种为甘蓝型油菜westar(参见李世升；何宇清.油菜种子发育早期的油体发生与调控.植物科学学报，卷:37期:3页:389-395)。

2.载体的构建：参考ncbi中各基因序列，欧文式菌crtb(genbank:cp001875.2),hpbhy(genbank:kp866868.1)，crbkt(genbank:ay860820.1)vhb(genbank:af274976.1)，拟南芥核酮糖羧化酶小亚基叶绿体导肽序列tp(genbank:bah57175.1)，根据油菜密码子偏好性进行密码子优化(密码子优化软件(https://sg.idtdna.com/codonopt)，合成基因，并插入到双元表达载体pbi121上，构成如图1所示的含有目的基因的表达载体pbi121-bbbv(简称为bbbv)。

3.油菜的转化

(1)通过电击转化的方法，将表达载体bbbv转入农杆菌lba4404，通过pcr鉴定获得含有目的片段的lba4404菌株。

(2)外植体制备。油菜种子通过10％naclo灭菌20min，用灭菌水洗种子3～5次，将种子在ms培养基中萌发，置于暗光下，25℃培养四天。取下胚轴，切成0.5～1cm的长度，置于预培养培养基上(ms0)，培养2天。

(4)挑取lba4404单克隆接种于2mllb培养基中28℃摇16h，以10％的比例接种于50mlab培养基中，28℃，220rpm至od600＝0.8～1。4000rpm离心收集菌体，并用ms+100μmas悬浮液悬浮，配置成用于外植体侵染的菌液。

(5)将培养两天的下胚轴置于悬浮菌液中，轻轻摇动，浸染10min，用过滤筛过滤掉菌液，于灭菌的滤纸上吸干水分，置于共培养培养基(ms1)中，25℃暗光培养2天。

(6)将共培养的下胚轴转到抑制农杆菌生长的培养基(ms1+200mg/ltimentin)中，25℃光照培养2周。

(7)将上述下胚轴转到生芽培养基中(ms2)，每两周继代一次，直至有芽发生。

(8)将2cm左右的芽转移到转移至生根培养基(ms3)中。将长势良好的植株移植到土壤中，在温室培养。

转化过程中应用的培养基组成如表1所示：

表1培养基组成

4.阳性转化植株的检测：

因为表达载体所用启动子为camv35s，在植株生长各组织中都可以表达，因此在筛选培养基上长出的转化苗为红色，通过红色可以确定阳性植株。为进一步确定该植株含有目的基因，通过提取对照组wt和转化组bbbv转化株的dna(图2)，通过pcr进行检测，确定阳性植株(图3)。检测引物为crbkt基因的特异性引物，扩增产物为250bp。

扩增引物序列为：

crbkt-f(seqidno.2)：5'-gaacctggcagtgtggttc-3'；

crbkt-r(seqidno.3)：5'-aaaggactgcaggcgggatg-3'。

通过转化再生，获得植株呈红色的组培苗，通过pcr检测进一步确定含目的基因的阳性株(如图2和3)，将其种到盆中进行种植，直至开花结果；表型调查bbbv转化苗叶片、茎秆、花、种子和油与对照相比都表现出明显的红色(如图2)。

5.色素的检测(每个样品做三次重复)

(1)色素的提取：称取0.2g左右的成熟还没有完全干燥的种子放入2ml离心管中，加入钢珠，100μl的丙酮，用快速研磨仪(频率65hz，99s)进行研磨，最大速度离心2min，将上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入200μl丙酮反复提取3～5次，直至沉淀物颜色不再变化。将丙酮提取的色素溶液用0.22μm的滤膜过滤，制成可用于上样测定的样品。

(2)uhplc方法：仪器：agilenttechnologies1290infinity；色谱柱：zorbaxeclipse(3.0×50mm1.8-micron,agilent,usa)；流速：1ml/min；进样量：5μl；流动相程序：0-1.0min：水：20％，乙腈：60％，异丙醇：5％，甲醇：15％；1.0-2.0min：水：0％，乙腈：80％，异丙醇：5％，甲醇：15％；2.0-8.0min：水：0％，乙腈：80％，异丙醇：5％，甲醇：15％；

(3)类胡萝卜素定量：采用外标法对样品中的类胡萝卜素含量进行定量。

转基因油菜和对照组油菜种子主要类胡萝卜素含量分析结果如表2所示：通过对种子中色素进行分析发现，种子中总的类胡萝卜素含量达到153.89±5.64μg/g，是对照组的5倍，其中酮式类胡萝卜素含量可以达到41.11μg/g，是总类胡萝卜素的26.7％，而虾青素含量可以达到6.19μg/g(如图2中c和图4)。

表2类胡萝卜素含量分析(μg/g，湿重)

nd:未检出

6.脂肪酸的提取和检测(每个样品做三次重复)

(1)取0.2g种子，加液氮在研磨仪中研磨成粉末，加入6ml氯仿甲醇混合液(2:1，v:v)，在摇床中150rpm一个小时充分反应；

(2)加入1.5ml的0.7％氯化钾溶液，混合均匀，离心1000rpm，5min；吸取下层溶液置于玻璃试管中，烘干；

(3)烘干的玻璃试管中加入9ml2％的硫酸甲醇溶液，加入60μl标样(10mg/ml十五烷酸甲酯)，85℃水浴一个小时直到油滴完全溶解，溶液没有颜色；

(4)室温降温，加入1.5ml的饱和氯化钠溶液，1ml正己烷，离心10min，2000rpm，取上清(即为待测样品)离心去除杂质后上gc-ms测定脂肪酸。

分析仪器为agilenttechnologies7890/5975,柱子为db-5(30m*250μm*0.25μm，agilent，usa)；氦气的流速为1.2ml/min，进样量为1μl，分流比为20:1，进样口的温度为250℃；柱温的程序为：初始温度为170℃，随后以5℃/min的速度升到250℃，并在此温度保持5min。通过比较样品于标样和化合物库(nist)的出峰时间以及每个峰的质荷比来确定脂肪酸的组分。脂肪酸的含量可以通过比较每个脂肪酸甲酯与标样十五烷酸甲酯的峰面积来确定。

转基因油菜种子中脂肪酸的含量和组成如表3所示，野生型油菜中油酸(68.3％)为主要脂肪酸，bbbv油菜种子中的主要脂肪酸为亚油酸(68.65％)，总的不饱和脂肪酸的含量没有显著的变化。

表3转基因油菜种子中脂肪酸的含量和组成

ta:traceamount(微量)

7.总抗氧化能力的测定

使用苏州格瑞生物科技有限公司的总抗氧化能力试剂盒(g0115f)对转基因bbbv油菜和非转基因油菜种子进行总抗氧化能力的测定，每个样品做三次重复，具体步骤如下：

(1)称取0.1g左右的种子，加入1ml提取液，进行冰浴匀浆，12000rpm，25℃离心15min，取上清置冰上待测。

(2)配置显色液：试剂一、试剂二、试剂三比例为10:1:1，使用前37℃预温，现配现用，注意避光

(3)配置反应液：测定管75μl样本加75μl蒸馏水加850μl显色液，空白管150μl蒸馏水加850μl显色液，混合均匀后，室温反应10min，在590nm波长下测定吸光值a；△a＝a测定-a空白；

(4)总抗氧化能力(μmoltrolox/g)＝1.27*(△a+0.004)/w

转基因油菜种子和非转基因油菜种子的抗氧化能力(μmoltrolox/g)结果如表4所示，转基因油菜种子抗氧化能力为23.26μmoltrolox/g，高于非转基因油菜种子的抗氧化能力18.31μumoltrolox/g。

表4抗氧化能力(μmoltrolox/g)变化

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国科学院昆明植物研究所

<120>一种表达酮式类胡萝卜素的融合基因、重组载体及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3918

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atggcatcttctatgctgtcttctgcgactatggttgcgtctccggctcaggctactatg60

gtggcaccgttcaacggtctgaagtcctccgcggctttcccggctactcgtaaagcgaac120

aacgacattaccagcattacctctaacggtggtcgtgtgaactgcatgaacaacccgtct180

ctgctgaaccatgcggtggaaaccatggcggtgggttccaaatccttcgcgaccgcgtct240

aagctgttcgatgcaaagacccgtcgttctgtgctgatgctgtatgcatggtgccgccat300

tgtgacgacgttatcgacgaccagactctgggcttccaggcacgtcagccggcgctgcag360

actccggaacagcgtctgatgcagctggagatgaagactcgccaggcttatgcaggctct420

cagatgcacgaaccggcgttcgctgctttccaggaagttgcgatggcgcatgatatcgct480

ccggcatacgcgtttgatcatctggaaggcttcgctatggacgtgcgcgaggcgcagtac540

tcccagctggacgataccctgcgctactgctaccacgttgctggtgttgtgggcctgatg600

atggcacagatcatgggtgttcgtgataacgcgaccctggatcgcgcatgtgacctgggt660

ctggcattccagctgactaacattgcgcgtgacattgttgacgatgcgcacgcaggccgt720

tgttatctgccggcgtcttggctggaacacgaaggcctgaacaaagaaaactacgctgca780

ccggaaaaccgtcaggcactgtctcgcatcgctcgccgcctggtgcaggaagcagagccg840

tactatctgagcgcgactgcgggcctggctggcctgccgctgcgtagcgcttgggcgatt900

gctaccgctaagcaggtgtaccgcaaaatcggtgtgaaggttgagcaggcaggtcagcag960

gcgtgggatcagcgtcagtccaccactaccccggaaaaactgaccctgctgctggcagct1020

agcggccaggcgctgacttctcgtatgcgtgcacatccgccgcgtccggcacacctgtgg1080

cagcgtccgctgtctagacagctgctgaactttgatctgctgaaactggctggtgacgtg1140

gagtctaaccctggtccgatggcgtcctctatgctgtcttctgctactatggtggcatct1200

ccggctcaggcaactatggtggcaccgtttaacggtctgaagtcttccgcagctttcccg1260

gcaactcgcaaggcaaacaacgatattactagcattacttccaacggtggccgtgttaac1320

tgcatgctgagcaagctgcagtctattagcgttaaggctcgccgtgtggagctggctcgt1380

gacattacccgtccgaaagtttgtctgcacgcgcagcgttgtagcctggtgcgtctgcgt1440

gtggcggctccgcagactgaagaggcactgggtaccgttcaggctgcaggtgcgggcgac1500

gaacactccgctgatgtggctctgcagcagctggatcgtgcgattgcagaacgtcgtgcg1560

cgtcgcaaacgcgaacagctgagctatcaggcagcggctatcgctgcttctattggtgtg1620

tccggtattgcgatcttcgcgacctatctgcgtttcgctatgcacatgactgtgggtggt1680

gcggttccgtggggcgaagttgcgggtactctgctgctggttgttggtggcgctctgggc1740

atggagatgtatgcgcgttatgcgcacaaagcgatctggcacgagtccccgctgggttgg1800

ctgctgcacaaaagccatcacaccccgcgtaccggtccgttcgaggctaacgatctgttt1860

gcaatcatcaacggcctgccggcgatgctgctgtgcaccttcggcttctggctgccgaac1920

gtgctgggcgcggcttgtttcggcgcaggtctgggtatcactctgtacggcatggcgtac1980

atgttcgtgcatgatggtctggttcatcgtcgtttcccgactggcccgatcgcgggtctg2040

ccgtatatgaaacgcctgactgttgctcatcagctgcatcattctggcaaatatggcggt2100

gcgccgtggggtatgttcctgggtccgcaggaactgcagcatattccgggtgcggctgag2160

gaagtggaacgtctggtgctggaactggactggtccaaacgtcagctgctgaacttcgat2220

ctgctgaaactggcgggtgacgtggaatctaaccctggtccgatggctagctctatgctg2280

tcctccgctaccatggttgcgtccccggcacaggcgactatggtggctccgttcaacggc2340

ctgaaatctagcgctgcatttccggcgactcgtaaggcgaacaacgacatcacttctatc2400

accagcaacggcggtcgcgttaactgtatgggtccgggtatccagccgaccagcgcgcgt2460

ccgtgttctcgtactaaacactctcgttttgcactgctggcggcagcactgaccgctcgt2520

cgtgtgaaacagttcaccaagcagtttcgttctcgccgcatggcagaggacattctgaag2580

ctgtggcagcgtcagtatcatctgccgcgtgaagattctgacaagcgtaccctgcgtgag2640

cgcgttcatctgtatcgtccgccgcgtagcgacctgggcggcatcgcggttgcggttacc2700

gttattgctctgtgggcaaccctgtttgtttatggcctgtggttcgttaagctgccgtgg2760

gcgctgaaagttggtgagaccgctacttcttgggcgaccatcgcagcggttttcttctct2820

ctggaattcctgtacactggtctgttcatcaccactcacgatgcgatgcacggtactatc2880

gcactgcgtaaccgtcgtctgaacgattttctgggtcagctggcaatttccctgtacgcg2940

tggtttgactattctgtgctgcaccgtaaacattgggaacatcataaccataccggcgaa3000

ccgcgtgttgacccggacttccatcgtggcaacccgaacctggcagtgtggttcgcgcag3060

tttatggtgagctacatgactctgtcccagtttctgaagatcgcggtttggtccaacctg3120

ctgctgctggcgggtgcgccgctggcaaaccagctgctgtttatgaccgcagcaccgatc3180

ctgtctgcgttccgcctgttctattacggcacttatgttccgcaccatccggagaagggc3240

catactggcgcgatgccgtggcaggtttcccgcacttcttccgcatcccgcctgcagtcc3300

tttctgacttgctatcatttcgacctgcactgggagcatcatcgttggccgtatgctccg3360

tggtgggagctgccgaaatgccgtcagatcgcacgtggcgcagctctggctcagctgctg3420

aacttcgatctgctgaagctggcaggcgacgttgaatccaaccctgggcccatgctggac3480

cagcagactattaacattatcaaagcgaccgttccggttctgaaagaacacggcgtgacc3540

atcactaccaccttctacaaaaacctgttcgcaaagcacccggaagttcgcccgctgttt3600

gacatgggtcgtcaggagtctctggagcagccgaaagcgctggcgatgaccgtgctggct3660

gcggcgcagaacattgagaacctgccggctattctgccggcggtgaaaaaaatcgcagtg3720

aagcattgtcaggctggcgttgcggctgcgcactatccgatcgtgggccaggaactgctg3780

ggtgcgattaaagaagttctgggtgacgcagctaccgacgatatcctggacgcatggggc3840

aaagcgtatggcgtgattgcagatgtgttcatccaggttgaagcggatctgtacgcgcag3900

gctgttgaataagagctc3918

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gaacctggcagtgtggttc19

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aaaggactgcaggcgggatg20

<210>4

<211>54

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cagctgctgaactttgatctgctgaaactggctggtgacgtggagtctaaccct54