水稻白叶枯病抗性相关基因OsDuf6及其应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及水稻抗病相关基因的功能与应用，具体涉及水稻白叶枯病抗性相关基因osduf6及其应用。

背景技术：

水稻白叶枯病是由黄单胞杆菌水稻致病变种(xanthomonasoryzaepv.oryzae,xoo)引起的一种重要的细菌性病害，发病范围遍及世界各稻区。一般可导致水稻减产10％左右，严重时减产50％-60％。利用抗性基因培育抗病品种是目前防治水稻白叶枯病最经济有效的措施。迄今，国内外已报道45个水稻白叶枯病抗性基因(http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/gene/list)。然而，来源于野生稻的抗病基因难以利用；部分抗性基因仅具有成株期抗性；大多抗性基因的抗谱较窄。在已鉴定的水稻白叶枯病抗性基因中，仅xa3、xa4、xa21和xa23等基因在生产中得以广泛应用。由于水稻白叶枯病菌具有高度的变异性，携带单个主效基因的抗病品种大面积推广种植后，潜在的毒性小种变为优势小种或病菌变异出现新的毒性小种，极易导致品种抗性丧失。

因此，获取水稻白叶枯病抗性相关基因有助于进一步培育抗白叶枯病品种，增强植物的抗病性，以降低水稻白叶枯病的危害。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题为如何提高水稻的白叶枯病抗性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质，命名为蛋白osduf6，来源于水稻(oryzasatival.)，是如下任一所示的蛋白质：

a1)氨基酸序列为seqidno.1的蛋白质；

a2)在seqidno.1所示的氨基酸序列的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；

a3)将seqidno.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。

其中，seqidno.1由459个氨基酸残基组成。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。

所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gapexistencecost，perresiduegapcost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述蛋白质在调控植物白叶枯病抗性中的应用也在本发明的保护范围之内。

为解决上述技术问题，本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料及其在调控植物白叶枯病抗性中的应用，所述生物材料为如下任一所示：

b1)编码上述蛋白质的核酸分子；

b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有b3)所述重组载体的转基因植物组织；

b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有b3)所述重组载体的转基因植物器官；

b8)含有b1)所述核酸分子的转基因植株、或含有b2)所述表达盒的转基因植株、或含有b3)所述重组载体的转基因植株；

b9)由b8)所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；

b10)由b9)所述组织培养物产生的原生质体；

b11)破坏上述蛋白质的基因的表达量和/或抑制上述蛋白质的活性和/或降低上述蛋白质的含量的核酸分子；

b12)含有b11)所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

上述相关生物材料中，b1)所述核酸分子为如下任一所示：

c1)seqidno.2所示的dna分子；

c2)seqidno.4所示的dna分子

c3)编码序列是seqidno.3所示的dna分子；

c4)在严格条件下与c1)或c2)或c3)限定的dna分子杂交，且编码上述蛋白质的dna分子。

其中，seqidno.2由2183个核苷酸组成，编码序列为seqidno.3所示，由1380个核苷酸组成，编码seqidno.1所示的蛋白质。

所述严格条件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

上述生物材料中，c2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述蛋白质的dna分子，该dna分子不但可包括启动osduf6基因转录的启动子，还可包括终止osduf6基因的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：osduf6基因自身的启动子，组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plantphysiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057，422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(beachy等人(1985)emboj.4:3047-3053)。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：osduf6基因自身的终止子、农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv35s终止子、tml终止子、豌豆rbcse9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i⁹⁸⁵)nature313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genesdev.,5:141；mogen等人(1990)plantcell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleicacidsres.17:7891；joshi等人(1987)nucleicacidres.,15:9627)。

上述生物材料中，c3)所述重组载体可含有seqidno.2或seqidno.3或seqidno.4所示的能编码上述蛋白质的dna分子。

可用现有的植物表达载体构建含有上述蛋白质的基因或上述蛋白质的基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pgwb411、pgwb412、pgwb405、pbin438、pcambia1302、pcambia2300、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb。使用上述蛋白质的基因构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛生素基因ubiqutin启动子(pubi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

在本发明具体的实施方式中，所述重组载体为pcambia1300-osduf6，该重组载体pcambia1300-osduf6是将载体pcambia1300的限制性内切酶bamhi和hindiii识别位点间的序列替换为seqidno.4所示的osduf6基因自身启动子驱动基因组全长序列，且保持其他序列不变得到的载体。

上述生物材料中，c11)所述核酸分子的核苷酸序列为靶向c1)所述核酸分子的dna片段，即靶序列。在本发明具体的实施方式中，所述靶序列为seqidno.3第477-496位的反向互补序列和/或seqidno.3第707-726位。

上述生物材料中，c12)所述重组载体可为利用crispr/cas9技术制备的可以破坏上述蛋白质的基因的表达量和/或抑制上述蛋白质的活性和/或降低上述蛋白质的含量的重组载体。

在本发明的具体的实施方式中，所述重组载体为crispr/cas9-osduf6，该重组载体crispr/cas9-osduf6含有u6a-sgrna-osduf6、u6b-sgrna-osduf6和cas9编码基因，u6a-sgrna-osduf6具有20个核苷酸组成的seqidno.3第477-496位的反向互补序列所示的靶序列1，u6b-sgrna-osduf6具有20个核苷酸组成的seqidno.3第707-726位所示的靶序列2。

上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌；如所述细菌可以为农杆菌dh5α。

上述生物材料中，所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。

上述生物材料中，所述组织培养物可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明进一步提供了调控植物白叶枯病抗性的产品，含有上述蛋白质或其相关的生物材料。

上述蛋白质或其相关的生物材料在如下任一中的应用也在本发明的保护范围之内：

d1)在培育白叶枯病抗性增强的转基因植物中的应用；

d2)在制备培育白叶枯病抗性增强的转基因植物产品中的应用；

d3)在培育白叶枯病抗性降低的基因敲除植物中的应用；

d4)在制备培育白叶枯病抗性降低的基因敲除植物产品中的应用；

d5)在植物育种中的应用。

上述应用中，所述植物育种中的应用具体可为将提高了上述蛋白质的基因的表达和/或提高了上述蛋白质的活性和/或含量的植物与其它植物进行杂交以进行植物育种；

或将破坏了上述蛋白质的基因的表达和/或抑制了上述蛋白质的活性和/或降低了上述蛋白质的含量的植物与其它植物进行杂交以进行植物育种。

为解决上述技术问题，本发明还提供了培育白叶枯病抗性增强的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育白叶枯病抗性增强的基因突变植物的方法，包括提高目的植物中上述蛋白质的基因的表达和/或上述蛋白质的活性和/或含量，得到转基因植物；所述转基因植物的白叶枯病抗性高于目的植物。

上述方法中，所述提高目的植物中上述蛋白质的基因的表达和/或上述蛋白质的活性和/或含量为将上述蛋白质的基因导入到目的植物中。

上述方法中，将上述蛋白质的基因导入到目的植物可通过携带有本发明上述蛋白质的基因的植物表达载体导入目的植物中。携带有本发明上述蛋白质的基因的植物表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。

携带有本发明上述蛋白质的基因的植物表达载体可为pcambia1300-osduf6，该重组载体pcambia1300-osduf6是将载体pcambia1300的限制性内切酶bamhi和hindiii识别位点间的序列替换为seqidno.4所示的osduf6基因自身启动子驱动基因组全长序列，且保持其他序列不变得到的载体。

上述蛋白质的基因的核苷酸可为seqidno.2或seqidno.3或seqidno.4所示的dna分子。

为解决上述技术问题，本发明还提供了培育白叶枯病抗性降低的基因敲除植物的方法。

本发明所提供的培育白叶枯病抗性降低的基因敲除植物的方法包括：破坏目的植物中上述蛋白质的基因的表达量和/或抑制目的植物中上述蛋白质的活性和/或降低目的植物中上述蛋白质的含量，得到基因敲除植物；所述基因敲除植物比所述目的植物的白叶枯病抗性低。

上述方法中，所述破坏目的植物中上述蛋白质的基因的表达量和/或抑制目的植物中上述蛋白质的活性和/或降低目的植物中上述蛋白质的含量的方法为通过对所述目的植物中上述蛋白质的基因进行敲除或抑制或改变来实现的。

在本发明中，使用任何生物技术破坏目的植物中上述蛋白质的基因的表达量和/或抑制目的植物中上述蛋白质的活性和/或降低目的植物中上述蛋白质的含量均能达到降低白叶枯病抗性的目的。

在本发明具体的实施方式中，所述破坏目的植物中上述蛋白质的基因的表达量和/或抑制目的植物中上述蛋白质的活性和/或降低目的植物中上述蛋白质的含量的方法是利用crispr/cas9技术对所述目的植物中上述蛋白质的基因进行敲除来实现的。其中，上述蛋白质的基因为seqidno.2或seqidno.3所示的dna分子。

在本发明具体的实施方式中，所述crispr/cas9技术中的靶序列为seqidno.3第477-496位的反向互补序列和/或seqidno.3第707-726位。所述crispr/cas9技术具体为先构建含有seqidno.3第477-496位的反向互补序列和/或seqidno.3第707-726位所示的靶序列结合区的重组载体；将含所述重组载体的根癌农杆菌转入水稻中，实现水稻中在seqidno.3第477-496位的反向互补序列和/或seqidno.3第707-726位发生插入或缺失，使得水稻的osduf6基因的编码蛋白的生物学功能被破坏，使得水稻表现出白叶枯病抗性水平降低的性状。

在本发明的具体的实施方式中，在本发明的具体的实施方式中，所述重组载体为crispr/cas9-osduf6，该重组载体crispr/cas9-osduf6含有u6a-sgrna-osduf6、u6b-sgrna-osduf6和cas9编码基因，能表达sgrna1和sgrna2以及cas9。u6a-sgrna-osduf6具有20个核苷酸组成的seqidno.3第477-496位的反向互补序列所示的靶序列1，u6b-sgrna-osduf6具有20个核苷酸组成的seqidno.3第707-726位所示的靶序列2。

本发明中，所述植物为m1)或m2)或m3)或m4)：

m1)单子叶植物或双子叶植物；

m2)禾本科植物；

m3)稻属植物；

m4)水稻。

本发明中，所述水稻具体可为黄华占(hhz)或ff329。

本发明中，所述白叶枯病抗性增强具体表现为植物白枯病的病斑长度减少；所述白叶枯病抗性降低具体表现为植物白枯病的病斑长度增加。

本发明中，所述白叶枯病抗性为对白叶枯病菌株pxo99a的抗性。

本发明中，所述转基因植物或基因敲除植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物或基因敲除植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物或基因敲除植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明发现水稻osduf6基因具有正向调控水稻的白叶枯病抗性的功能，可用于改良水稻对白叶枯病的抗性，对于培育抗白叶枯病水稻新品种具有重要意义。

附图说明

图1为osduf6互补转基因植株的pcr鉴定结果；其中，1为阴性对照，2为阳性对照，3为osduf6互补转基因阳性株系cp-1，4为osduf6互补转基因阳性株系cp-2，5为osduf6互补转基因阳性株系cp-3。

图2为osduf6基因敲除植株ko-1、ko-2和ko-3的测序峰图。

图3为osduf6基因敲除植株ko-1、ko-2和ko-3的序列变化情况。

图4为黄华占和osduf6互补转基因株系cp-1、cp-2、cp-3的病斑长度。

图5为ff329和osduf6基因敲除株系ko-1、ko-2和ko-3的病斑长度。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna的3′末端核苷酸。

本发明下述实施例中用到的生物材料的来源：

载体pcambia1300：购自biovectorntcc典型培养物保藏中心。

根癌农杆菌eha105：购自biovectorntcc典型培养物保藏中心。

pylcrispr/cas9pubi-h、pylsgrna-osu6a和pylsgrna-osu6b载体：记载在文献“max,zhangq,zhuq.etal.arobustcrispr/cas9systemforconvenient,high-efficiencymultiplexgenomeeditinginmonocotanddicotplants,molplant.2015,8(8):1274-84)”中，公众可从华南农业大学处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

白叶枯病菌菌株pxo99a：记载在文献“salzbergsl,sommerdd,schatzmc,phillippyam,etal.genomesequenceandrapidevolutionofthericepathogenxanthomonasoryzaepv.oryzaepxo99a.bmcgenomic,2008,9:534”中，公众可从国际水稻研究所处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

水稻品种ff329为籼稻回交导入系：记载在文献“zhangf,zhuodl,zhangf,etal.xa39,anoveldominantgeneconferringbroad-spectrumresistancetoxanthomonasoryzaepv.oryzaeinrice.plantpathology,2015,64,568–575”中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

黄华占为：记载在文献“zhangf,zhuodl,zhangf,etal.xa39,anoveldominantgeneconferringbroad-spectrumresistancetoxanthomonasoryzaepv.oryzaeinrice.plantpathology,2015,64,568–575”中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、水稻osduf6基因的克隆

1.水稻osduf6基因序列的获得

提取水稻品种ff329(对白叶枯病菌株pxo99a表现高抗)的叶片的基因组dna,并以此dna为模板，利用正向引物osduf6-f:5’-agtgataagattatagtctaat-3’和反向引物osduf6-r:5’-tttatagcaaaaagaaatgtcga-3’，用primestarg×ldnapolymerase(code:r050a，takara)进行pcr扩增，得到扩增产物(即osduf6基因序列，经测序，其核苷酸序列为seqidno.2)。

2.水稻osduf6基因的编码序列的获得

提取水稻品种ff329的叶片的总rna,并以该rna为模板，采用fastkinggdnadispellingrtsupermix(code:kr118，tiangen)合成cdna，以此cdna为模板，利用引物osduf6-cds-f:5’-atggaggagggacacgagct-3’和osduf6-cds-r:5’-ttagtgtcgtcgagataagagtg-3’，用primestarg×ldnapolymerase(code:r050a，takara)进行pcr扩增，得到扩增产物(即osduf6基因的编码序列，经测序，其核苷酸序列为seqidno.3，编码的蛋白质命名osduf6，其氨基酸序列为seqidno.1)

实施例2、osduf6基因互补载体和基因敲除载体的构建

1.osduf6基因互补载体的构建

构建包含osduf6基因自身启动子驱动基因组全长序列(seqidno.4，包括2221bp的启动子序列、2183bp的osduf6基因序列和810bp的终止区序列)的osduf6基因互补载体pcambia1300-osduf6。操作步骤如下：

(1)提取水稻品种ff329的叶片的基因组dna，以该dna为模板，利用正向引物osduf6-cp-f:5’-tgagctgatcaaacaacgaaag-3’和反向引物osduf6-cp-r:5’-atgcacaggaatgtcggtactt-3’，用primestarg×ldnapolymerase(code:r050a，takara)进行pcr扩增，得到扩增产物(即osduf6基因自身启动子驱动基因组全长序列，经测序，其核苷酸序列为seqidno.4)，并进行切胶回收。

(2)将步骤(1)得到的扩增产物添加载体同源序列，具体步骤如下：

以步骤(1)得到的扩增产物为模板，利用正向引物osduf6-cp-bamhif:5’-cggtacccggggatcctgagctgatcaaacaacgaaag-3’和反向引物osduf6-cp-hindiiir:5’-ggccagtgccaagcttatgcacaggaatgtcggtactt，用primestarg×ldnapolymerase(code:r050a，takara)进行pcr扩增，得到扩增产物(即两端连接有载体同源序列的osduf6基因自身启动子驱动基因组全长序列)，并进行切胶回收。

(3)将步骤(2)得到的扩增产物与经bamhi和hindiii酶切的载体pcambia1300进行同源重组连接，得到反应产物。

其中，同源重组的反应体系为：经bamhi和hindiii酶切的载体pcambia130050ng，步骤(2)得到的扩增产物50ng，5×in-fusionhdenzymepremix2μl，加ddh2o补充至10μl。

同源重组的反应条件为：50℃孵育15min

(4)将步骤(3)得到的反应产物转化大肠杆菌dh5α，筛选阳性克隆，得到正确的含有seqidno.4所示的osduf6基因自身启动子驱动基因组全长序列的表达载体，并将该表达载体命名为重组载体pcambia1300-osduf6。

该重组载体pcambia1300-osduf6是将载体pcambia1300的限制性内切酶bamhi和hindiii识别位点间的序列替换为seqidno.4所示的osduf6基因自身启动子驱动基因组全长序列，且保持其他序列不变得到的载体。

2.osduf6基因敲除载体crispr/cas9-osduf6的构建

利用crispr/cas9方法构建敲除osduf6基因的重组载体：

(1)所用靶序列为如下靶序列1和靶序列2：

靶序列1：gctccagcgcgacggagaac(即seqidno.3第477-496位的反向互补序列)；将crispr/cas9方法中靶向靶序列1的sgrna记为sgrna1；

靶序列2：gcctccgctgctgctacacc(即seqidno.3第707-726位)；将crispr/cas9方法中靶向靶序列2的sgrna记为sgrna2。

(2)sgrna表达盒构建：

以pylsgrna-osu6a载体为模板，使用引物u-f(5’-ctccgttttacctgtggaatcg-3’)和u6a-osduf6-r(5’-gttctccgtcgcgctggagcggcagccaagccagca-3’)进行pcr扩增，得到扩增产物，将测序正确的扩增产物命名为u6a-osduf6；以pylsgrna-osu6a载体为模板，使用引物gr-osduf6-1f(5’-ctccagcgcgacggagaacgttttagagctagaaat-3’)和gr-r(5’-cggaggaaaattccatccac-3’)进行pcr扩增，得到扩增产物，将测序正确的扩增产物命名为sgrna-osduf6-1。采用overlappingpcr方法将u6a-osduf6和sgrna-osduf6-1连在一起，随后用pps-ggl(5’-ttcagaggtctctctcgactagtatggaatcggcagcaaagg-3’，下划线的序列为bsai识别位点序列)和pgs-gg2(5’-agcgtgggtctcgtcagggtccatccactccaagctc-3’，下划线的序列为bsai识别位点序列)进行pcr扩增加上酶切接头，将测序正确的dna片段命名为u6a-sgrna-osduf6(即为sgrna1表达盒)。u6a-sgrna-osduf6的序列为seqidno.5，seqidno.5的第44-490位为u6a启动子，第491-592位为sgrna1的编码序列。u6a-sgrna-osduf6能表达sgrna1。

以pylsgrna-osu6b载体为模板，使用引物u-f(5’-ctccgttttacctgtggaatcg-3’)和u6b-osduf6-r(5’-ggtgtagcagcagcggaggcaacacaagcggcagc-3’)进行pcr扩增，将序列正确的dna片段命名为u6b-osduf6；以pylsgrna-osu6b载体为模板，使用引物gr-osduf6-2f(5’-cctccgctgctgctacaccgttttagagctagaaat-3’)和gr-r(5’-cggaggaaaattccatccac-3’)进行pcr扩增，将序列正确的dna片段命名为sgrna-osduf6-2。采用overlappingpcr方法将u6b-osduf6和sgrna-osduf6-2连在一起，随后用pps-gg2(5’-ttcagaggtctctctgacactggaatcggcagcaaagg-3’，下划线的序列为bsai识别位点序列)和pgs-ggr(5’-agcgtgggtctcgaccgacgcgtatccatccactccaagctc-3’，下划线的序列为bsai识别位点序列)扩增加上bsai酶切接头，将得到的序列正确的dna片段命名为u6b-sgrna-osduf6(即为sgrna2表达盒)。u6b-sgrna-osduf6的序列为seqidno.6，seqidno.6的第40-372位为u6b启动子，第373-475位为sgrna2的编码序列。u6b-sgrna-osduf6能表达sgrna2。

(3)重组载体的构建：

将上述u6a-sgrna-osduf6和u6b-sgrna-osduf6分别与pylcrispr/cas9pubi-h载体进行酶切-连接反应，得到重组载体；

其中，酶切-连接反应的体系为：u6a-sgrna-osduf6(15ng)，u6b-sgrna-osduf6(15ng)，pylcrispr/cas9pubi-h载体(80ng)，10×cutsmartbuffer1.5μl，10mmatp1.5μl，bsai-hf10u,t4dnaligase35u,加ddh2o补充至15μl。

酶切-连接反应体程序：37℃10min，10℃5min，20℃5min，进行3个循环；37℃3min，10℃5min，20℃5min，进行10个循环。

取重组载体15μl转化大肠杆菌dh5α，筛选阳性克隆，将测序正确的重组载体命名为crispr/cas9-osduf6，crispr/cas9-osduf6含有sgrna1表达盒(u6a-sgrna-osduf6)、sgrna2表达盒(u6b-sgrna-osduf6)和cas9编码基因，能表达sgrna1和sgrna2以及cas9。

实施例3、转基因水稻的获得

一、osduf6基因互补转基因植株的获得

以对白叶枯病菌株pxo99a表现高感的水稻品种黄华占(hhz)作为制备转基因水稻的受体植物，利用实施例2中的pcambia1300-osduf6制备转基因水稻，并利用空白载体pcambia1300作为对照。具体步骤如下：

1、取出黄华占(hhz)的成熟种子，去壳，挑取饱满光洁无菌斑的种子进行消毒。

2、将消毒后的种子接种到诱导培养基上，28℃、暗培养14天左右，选取外观良好，生长力好的愈伤组织。

3、取实施例2中构建的重组载体pcambia1300-osduf6导入根癌农杆菌eha105，得到重组菌。

4、取步骤3得到的重组菌，用侵染培养基重悬菌体，得到菌悬液eha105/pcambia1300-osduf6。

5、将步骤2的黄华占愈伤组织浸泡于步骤4制备的菌悬液eha105/pcambia1300-osduf6中，侵染20min，侵染后将菌悬液倒掉，取愈伤组织，用无菌滤纸吸干水分，然后置于共培养培养基上，培养28℃暗培养50-55h。

6、完成步骤5后，挑选表面没有明显农杆菌的愈伤组织移至抑菌培养基中，28℃暗培养3-4天。

7、完成步骤6后，将愈伤组织移至筛选培养基上28℃暗培养培养30天，每10天继代一次。

8、完成步骤7后，取新鲜潮霉素抗性的愈伤组织，接于预再生培养基中，28℃暗培养7天，然后置于光照培养间(12h光照/12h黑暗)继续培养7天后转入再生培养基上，继续光照培养，直至生长出再生植株，得到转基因植株，记为osduf6基因互补转基因植株。

将上述方法中的“重组载体pcambia1300-osduf6”替换为“载体pcambia1300”，其他步骤均不变，得到转基因植株，记为转基因空载对照植株。

其中，遗传转化所用培养基及配方：

诱导培养基：cacl2·2h2o440mg，kh2po4170mg，mgso4·7h2o370mg，nh4no31650mg，kno31900mg，ki0.83mg，cocl2·6h2o0.025mg，h3bo36.2mg，na2moo4·2h2o0.25mg，mnso4·4h2o22.3mg，cuso4·5h2o0.025mg，znso4·7h2o8.6mg，na2-edta·2h2o37.3mg，feso4·7h2o27.8mg，vb10.1mg，vb60.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，2，4-d2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，去离子水加至1l。

侵染培养基：配制方法参见参考文献：hieiy,ohtas,komarit,etal.efficienttransformationofrice(oryzasativa,l.)mediatedbyagrobacterium,andsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna[j].plantjournal,1994,6(2):271–282.。将参考文献中乙酰丁香酮的浓度替换为200μm。

共培养培养基：在诱导培养基中加入乙酰丁香酮和葡萄糖，使乙酰丁香酮在培养基中的终浓度为200μm，葡萄糖在培养基中的终浓度为10g/l。

抑菌培养基：在诱导培养基中头孢霉素，使头孢霉素在培养基中的终浓度为500mg/l。

筛选培养基：在诱导培养基中加入潮霉素和头孢霉素，使潮霉素在培养基中的终浓度为65mg/l，头孢霉素在培养基中的终浓度为500mg/l。

预再生培养基：cacl2·2h2o440mg，kh2po4170mg，mgso4·7h2o370mg，nh4no31650mg，kno31900mg，ki0.83mg，cocl2·6h2o0.025mg，h3bo36.2mg，na2moo4·2h2o0.25mg，mnso4·4h2o22.3mg，cuso4·5h2o0.025mg，znso4·7h2o8.6mg，na2-edta·2h2o37.3mg，feso4·7h2o27.8mg，vb10.1mg，vb60.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1l；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/l。

再生培养基：cacl2·2h2o440mg，kh2po4170mg，mgso4·7h2o370mg，nh4no31650mg，kno31900mg，ki0.83mg，cocl2·6h2o0.025mg，h3bo36.2mg，na2moo4·2h2o0.25mg，mnso4·4h2o22.3mg，cuso4·5h2o0.025mg，znso4·7h2o8.6mg，na2-edta·2h2o37.3mg，feso4·7h2o27.8mg，vb10.1mg，vb60.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂6g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1l；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/l。

二、osduf6基因敲除植株的获得

以对白叶枯病菌株pxo99a表现高抗的水稻品种ff329作为制备转基因水稻的受体植物，利用实施例2中的crispr/cas9-osduf6制备转基因水稻，并利用空白载体pylcrispr/cas9pubi-h作为对照，具体步骤为：

按照步骤1所述的方法，将黄华占替换为ff329，将pcambia1300-osduf6替换为crispr/cas9-osduf6，其他步骤均不变，得到转基因植株，记为osduf6基因敲除植株。

将上述方法中的“crispr/cas9-osduf6”替换为“pylcrispr/cas9pubi-h”，其他步骤均不变，得到转基因植株，记为基因敲除空载对照植株。

三、转基因水稻的分子鉴定

1.阳性osduf6互补转基因植株的鉴定

待测植株：黄华占、步骤二得到的osduf6互补转基因植株和步骤二得到的转基因空载对照植株。

分别提取各待测植株基因组dna，以基因组dna为模板，利用osduf6-cpf(5’-ccaccggaatcacattaa-3’)和p1300-vr(5’-tgtaaaacgacggccagt-3’)组成的引物对进行pcr扩增，用pcambia1300-osduf6质粒作为阳性对照，用受体水稻品种黄华占作为阴性对照，获得pcr扩增产物。

将pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，转基因空载对照植株与阴性对照不能扩增出任何条带，如果osduf6互补转基因植株pcr扩增后的条带大小为588bp，则鉴定为阳性osduf6互补转基因植株，部分样品的电泳图如图1所示：阳性对照和osduf6互补转基因植株均显示约588bp的条带，因此获得了阳性osduf6互补转基因植株。选取三个阳性osduf6互补转基因株系分别记为cp-1、cp-2、cp-3进行抗白叶枯病的鉴定。

2.osduf6基因敲除植株的鉴定

待测植株：受体水稻品种ff329、步骤二得到的osduf6基因敲除植株和步骤二得到的基因敲除空载对照植株。

分别提取各待测植株的基因组dna，以基因组dna为模板，以osduf6-tf(5’-gatgagatcgacatgcacggat-3’)和osduf6-tr(5’-gacgctcatggtgatggc-3’)为引物进行pcr扩增，以受体水稻品种ff329为阴性对照，获得pcr扩增产物。

将得到的pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，阴性对照显示约803bp的条带。

将pcr扩增产物进行测序和比对，部分样品的结果如图2和图3所示：将osduf6基因敲除植株和基因敲除空载对照植株的pcr扩增产物序列与阴性对照进行比对发现，基因敲除空载对照植株中osduf6基因未发生改变，3个独立的osduf6基因敲除植株均在osduf6基因的靶点1处发生了单碱基的插入(在靶点1的第17位和第18位插入一个碱基t，其他序列不变)，因此获得了阳性osduf6基因敲除植株。选取三个阳性osduf6基因敲除株系分别记ko-1、ko-2和ko-3进行抗白叶枯病的鉴定。

四、转基因株系的抗白叶枯病鉴定

待测植株为：黄华占(hhz)，阳性osduf6基因互补转基因株系cp-1、cp-2、cp-3(t1代植株，均为纯合基因型)，转基因空载对照植株；ff329，阳性osduf6基因基因敲除株系ko-1、ko-2和ko-3(t1代植株，均为纯合基因型)，基因敲除空载对照植株。

1、将各待测植株在温室中培养约25天后移栽至网室中进行种植，单株种植，每种待测植株种植20株。

2、在步骤1的植株的分蘖盛期，用白叶枯病菌株pxo99a进行接种，采用剪叶法对植株进行人工接种，每株接种5张叶片(菌液浓度为1×10⁹cfu/ml)，每个叶片的接种量均相等，均为40μl。

3、接菌约14天后测量各植株叶片的病斑长度，每个叶片沿叶脉有一个病斑，每个植株测量3张接种叶片的病斑长度，计算平均值。

基因互补转基因植株的病斑长度结果如图4所示：黄华占(hhz)的病斑长度为17.6cm，转基因空载对照植株的病斑长度与受体植物hhz的病斑长度无显著差异。阳性osduf6基因互补转基因株系cp-1、cp-2和cp-3的病斑长度分别为6.8cm、7.1cm和8.0cm，均显著短于黄华占的病斑长度，表明osduf6基因能够提高水稻对白叶枯病的抗病性。

基因敲除植株的病斑长度结果如图5所示：ff329的病斑长度为0.5cm，基因敲除空载对照植株的病斑长度与受体植物ff329的病斑长度无显著差异。阳性osduf6基因敲除株系ko-1、ko-2和ko-3的病斑长度分别为5.3cm、5.8cm和6.8cm，均显著长于ff329的病斑长度，表明敲除osduf6基因能够提高水稻对白叶枯病的感病性。

以上结果表明，osduf6基因正向调控水稻对白叶枯病的抗性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

sequencelisting

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>水稻白叶枯病抗性相关基因osduf6及其应用

<130>gncfy200503

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>459

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

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gatcgatcatggcgggacgcatgtcatgccatgtcgcgcccaaaaataggttctcctcct180

cccacctcccgcccgacaatcgagcggcatcgatcgatcgacgacgtacgacccaccgac240

cgatggccgaccacgccgtgcacgtcctctcgccgccgtgcgtctgcgccaccctcgtcg300

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<212>dna

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