一种快速检测紫藤脉花叶病毒的LAMP引物组、试剂盒和方法与流程

本发明涉及一种快速检测紫藤脉花叶病毒的lamp引物组、试剂盒和方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

紫藤(wisteriasinensis)是一种大型落叶植物，紫藤花叶病是紫藤的一种严重病害。其最早在美国被报道(brierley和lorentz，1957)。bos(1970)将其命名为紫藤脉花叶病毒(wvmv)。紫藤花叶病毒(wisteriaveneinmosaicvirus，wvmv)是马铃薯y病毒属(potyvirus)的一员，由紫藤花叶病毒引起的紫藤花叶病已成为世界性病害。感染叶片呈黄化、花叶斑点、变窄、扭曲、坏死斑点，降低开花能力，使它们无法出售，对园艺产业造成了严重的经济损失。

wvmv可由桃蚜(myzuspersica)和豆蚜(aphiscraccivora)非持久性传播，也可摩擦接种传播，但不能由种子传播。在田间防控难度极大，所以早期病害的预警对病害的传播和蔓延尤为重要。但现有传统的鉴定方法耗时耗力，对实验环境要求较高。因此，建立一种快速检测紫藤脉花叶病毒的lamp引物组、试剂盒，可为紫藤脉花叶病的早期预警提供重要的支撑。

目前，对于病害的诊断，主要有atp荧光检测法，酶联免疫吸附法(elisa)，生物传感器技术，基因芯片技术以及目前被广泛应用的pcr的检测技术，其中elisa免疫反应特异性强，对试剂的选择性高，但很难同时分析多种成分，对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应。近年来，环介导等温扩增反应(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是一种等温的核酸扩增技术，该技术特异性强、灵敏度高，最大的特点是简单易行、成本低。反应在恒温条件下1个小时即可完成，结果通过肉眼观察产物浊度或颜色变化即可判断。自2000年由日本学者notomi等首次开发的一种在恒温条件下特异、高效且快速扩增核酸的技术，该技术针对目的序列设计2对特异引物，在具有链置换活性的dna聚合酶的作用下实现高效扩增，具有高灵敏度和特异性，且操作简单的特点，目前在植物病害诊断方面得到了广泛的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述现有问题，提供一种快速检测紫藤脉花叶病毒的lamp引物组、试剂盒和方法，可用于快速检测紫藤中的紫藤脉花叶病毒，具有快速、灵敏、特异性强等优势。

本发明的目的是这样实现的，一种快速检测紫藤脉花叶病毒的lamp引物组，其特征在于，包括正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物fip、反向内引物bip四种反应引物，所述四种反应引物依为：

正向外引物f3：5'-gtcgtctccagatgtgaat-3'；

反向外引物b3：5'-cagaccatacctaggcatat-3'；

正向内引物fip：5'-ggcattttcaactatgggtttaagttgtttgggttatgatggatgg-3'；

反向内引物bip：5'-aagccaactctgagacaaatcatatggtccttcagcattcc-3'。

一种包含快速检测紫藤脉花叶病毒的lamp引物组的检测紫藤脉花叶病毒的lamp检测试剂盒。

含有lamp检测优化体系，该lamp检测体系包括：正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3、lamp反应基础液（10×thermopobuffer，8ubstdna聚合酶，dntps，betain和mgcl2），其中，内引物与外引物的浓度比为4:1，内引物包括正向内引物fip、反向内引物bip，外引物包括正向外引物f3、反向外引物b3。

lamp检测体系中各主成分终浓度为：正向内引物fip和反向内引物bip0.8μm、正向外引物f3和反向外引物b30.2μm，8ubstdna聚合酶0.32u/μl，dntps1.0mm，betain0.8m，mgcl21.6mm。

lamp检测试剂盒进行快速检测紫藤脉花叶病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

s1.粗提待测样品rna，利用反转录试剂盒进行逆转录，获得cdna；

s2.以s1所获得的cdna为模板，lamp引物组进行lamp扩增反应；

s3.根据扩增结果判断待测样品中是否受紫藤脉花叶病毒侵染。

步骤s2中所述lamp扩增反应的体系为：10×thermopobuffer2.5μl，8ubstdna聚合酶1μl，10mmo1dntps2.5μl，3mbetain2.0μl，20mmmgcl22.0μl，10μm外引物fip/bip2.0μl，10μm内引物f3/b30.5μl，模板2.5μl，去离子水补至25μl。

步骤s2中所述lamp扩增反应的条件为：水浴65℃，孵育45min。

步骤s3所述根据扩增结果判断待测样品中是否含受紫藤脉花叶病毒侵染的方法为：利用琼脂糖凝胶电泳检测和荧光染料sybrgreeni对lamp扩增产物进行检测，根据检测结果判断待测样品中是否受紫藤脉花叶病毒侵染。

所述琼脂糖凝胶电泳检测结果呈现阶梯式条带，则为阳性结果，表示待测样受到紫藤脉花叶病毒的侵染；若无阶梯式条带，表示待测样未受到紫藤脉花叶病毒的侵染；所述荧光染料法为将染料sybrgreeni加入到lamp扩增产物中，观察显示的颜色，若呈现荧光绿则为阳性，表示待测样受到紫藤脉花叶病毒的侵染；若为橙色则为阴性，表示待测样未受到紫藤脉花叶病毒的侵染。

通过本发明，本发明的第一个目的是提供一种用于检测紫藤脉花叶病毒的外壳蛋白序列。本发明的第二个目的是提供一种检测紫藤脉花叶病毒的lamp的反应引物组。本发明的第三个目的是提供一种检测紫藤脉花叶病毒的试剂盒。本发明的第四个目的是提供一种检测紫藤脉花叶病毒的方法。本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一组用于检测紫藤脉花叶病毒的lamp引物，由一对外引物对f3、b3和一对内引物fip、bip组成；所述lamp检测引物包括f3、b3、fip、bip四种反应引物，所述四种反应引物核苷酸序列依次为：

正向外引物f3：5'-gtcgtctccagatgtgaat-3'；

反向外引物b3：5'-cagaccatacctaggcatat-3'；正向内引物fip：5'-ggcattttcaactatgggtttaagttgtttgggttatgatggatgg-3'；

反向内引物bip：5'-aagccaactctgagacaaatcatatggtccttcagcattcc-3'。

所述四种lamp引物是针对紫藤脉花叶病毒（wvmv登录号：no.mk119780）外壳蛋白基因作为靶标设计得到。

一种快速检测紫藤脉花叶病毒的试剂盒和方法，包含上述4种检测紫藤脉花叶病毒的lamp反应引物引物。

优选地，所述外引物对和内引物对的终浓度比为1:4。更优选地，所述外引物对和内引物对的终浓度分别为0.2μm和0.8μm。

优选地，所述试剂盒还包括10×thermopobuffer，dntps，mgcl2，betain，bstdna聚合酶，去离子水，显色液，阴性对照液，阳性对照液。

优选地，mgcl2终浓度为1.6mm，dntps终浓度为1.0mm，betain终浓度为0.8m。

优选地，显色液为sybrgreeni。所述阴性对照液为不含wvmv的紫藤叶片总核酸，所述阳性对照液为含wvmv的紫藤叶片总核酸。

优选地，所述lamp引物组、试剂盒25μl反应体系为：10×thermopobuffer2.5μl，8ubstdna聚合酶1μl，10mmo1dntps2.5μl，3mbetain2.0μl，20mmmgcl22.0μl，10μm外引物fip/bip2.0μl，10μm内引物f3/b30.5μl，模板2.5μl，去离子水补至25μl。

优选地，所述lamp引物组、试剂盒的反应条件为水浴65℃孵育45min，4℃避光保存。

本发明还请求保护一种紫藤脉花叶病毒的lamp检测方法，包括如下步骤:

s1.提取待测样品rna，利用反转录试剂盒进行逆转录，获得cdna；

s2.环介导等温扩增：以s1所述cdna为模板，利用lamp引物扩增得到扩增产物；所述的引物包含一对外引物f3/b3和一对内引物fip和bip，序列如下：

正向外引物f3：5'-gtcgtctccagatgtgaat-3'；

反向外引物b3：5'-cagaccatacctaggcatat-3'；正向内引物fip：5'-ggcattttcaactatgggtttaagttgtttgggttatgatggatgg-3'；

反向内引物bip：5'-aagccaactctgagacaaatcatatggtccttcagcattcc-3'。

s3.根据扩增结果判断待测样品中是否受紫藤脉花叶病毒侵染。

优选地，所述lamp扩增反应的体系为：10×thermopobuffer2.5μl，8ubstdna聚合酶1μl，10mmo1dntps2.5μl，3mbetain2.0μl，20mmmgcl22.0μl，10μm外引物fip/bip2.0μl，10μm内引物f3/b30.5μl，模板2.5μl，去离子水补至25μl。

优选地，s1所述lamp扩增反应的条件为：水浴65℃，孵育45min，4℃避光保存。

优选地，s3所述根据扩增结果判断待测样品中是否含受紫藤脉花叶病毒侵染的方法为：利用琼脂糖凝胶电泳检测和荧光染料sybrgreeni对lamp扩增产物进行检测，根据检测结果判断待测样品中是否受紫藤脉花叶病毒侵染。

更优选地，所述琼脂糖凝胶电泳检测结果呈现阶梯式条带，则为阳性结果，表示待测样品受到紫藤脉花叶病毒的侵染。若检测结果无阶梯式条带，表示待测样品未受到紫藤脉花叶病毒的侵染；所述荧光染料法为将染料sybrgreeni加入到lamp扩增产物中，观察显示的颜色，若呈现荧光绿则为阳性，表示待测样受到紫藤脉花叶病毒的侵染，若呈现橙色则为阴性，表示待测样未受到紫藤脉花叶病毒的侵染。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明的紫藤脉花叶病毒lamp快速检测方法成本低、操作简单、实用性好。降低了成本，实现了恒温扩增，结果易判断，反应结束后，直接观察产物的颜色变化或者琼脂糖凝胶电泳检测的方法结束后，直接观察产物的颜色变化即可判断结果。

(2)本发明的紫藤脉花叶病毒lamp快速检测方法快速、高效。只需45min即可完成反应，从前期的样品制备到结果观察2个小时即可完成，大大缩短了检测时间，简化了操作过程。

(3)本发明的紫藤脉花叶病毒lamp快速检测方法假阳性低，发明中用到的sybrgreeni经稀释后加入管盖，有效避免了气溶胶的污染。

(4)本发明的紫藤脉花叶病毒lamp快速检测方法特异性强，本发明中引物的设计是其中关键的步骤，利用紫藤脉花叶病毒的外壳蛋白序列设计引物，包括外引物f3和b3、内引物fip和bip，并由此发明了用于检测紫藤脉花叶病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法。

附图说明

图1为lamp反应的灵敏度检测电泳示意图；

m.dnamarker，1：7.56×10⁰；2：7.56×10^-1；3：7.56×10^-2；4：7.56×10^-3；5：7.56×10^-4；6：7.56×10^-5；7：去离子水。单位:ng/μl。

图2为紫藤脉花叶病毒rt-pcr反应的灵敏度检测电泳示意图；

m.dnamarker，1：7.56×10⁰；2：7.56×10^-1；3：7.56×10^-2；4：7.56×10^-3；5：7.56×10^-4；6：7.56×10^-5；7：去离子水。单位:ng/μl。

图3为紫藤脉花叶病毒lamp反应的特异性电泳示意图；

其中，m为dnamarker；第1泳道为紫藤脉花叶病毒(wisteriaveneinmosaicvirus，wvmv)；第2泳道为番茄黄化曲叶病毒(tomatoyellowleafcurlviruses，tylcv)；第3泳道为烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus，trv)；第4泳道为烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus，tmv)；第5泳道为甘蔗线条花叶病毒(sugarcanestreakmosaicvirus，scsmv)；第6泳道为阳性对照（wisteriaveneinmosaicvirus，wvmv）质粒；第7泳道为阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

以下实施例中使用的主要试剂及仪器bstdna聚合酶(newenglandbiolabs)、mgcl2(takara)、dntps(takara)、betain(solarbio)、去离子水、dnamaker(tsingke生物科技公司)、伯乐pcr仪、常州市国旺仪器制造有限公司数显恒温水浴锅。

以下所用的所有病毒，均已事先检测证明了其定性的正确性。

实施例1、一种用于检测紫藤脉花叶病毒环介导等温扩增lamp引物组、试剂盒。

根据genebank中已提交的wvmv(登录号：no.mk119780)基因的cp序列引物设计，获得lamp引物组，所述的lamp引物组包括f3、b3、fip和bip四种引物：

正向外引物f3：5'-gtcgtctccagatgtgaat-3'；

反向外引物b3：5'-cagaccatacctaggcatat-3'；

正向内引物fip：5'-ggcattttcaactatgggtttaagttgtttgggttatgatggatgg-3'；

反向内引物bip：5'-aagccaactctgagacaaatcatatggtccttcagcattcc-3'。

试剂盒包含:10×thermopolbuffer、10mmdntps、25mmmgcl2、3mbetain、8ubstdna聚合酶、去离子水、10μm的正内向引物fip，10μm的反向内引物bip，10μm正向外引物f3、10μm反向外引物b3，sybrgreeni染料。

试验使用的25μl反应体系由以下成分配制而成:8u/μlbstdna聚合酶1μl、10×thermopolbuffer2.5μl、10μmfip2.0μl、10μmbip2.0μl、10μmf30.5μl、10μmb30.5μl、25mmmgcl24.0μl、10mmdntps2.5μl、3mbetain2.0μl、sybrgreeni0.3μl、模板2.5μl，双蒸水补足至25μl。

实施例2、一种用于检测紫藤脉花叶病毒的环介导等温扩增方法:

利用所述25μl检测反应体系进行lamp扩增反应，选择以下任一方法:

方法一、先在扩增前加入核酸染料sybrgreeni作为反应指示剂，以sybrgreeni的颜色变化判断，经lamp扩增反应结束后，颜色发生变化，即显色结果观察到荧光绿判断为阳性，即显示检测到紫藤脉花叶病毒;颜色如果没有发生变化，显色结果为橙色判断为阴性，即显示样品无紫藤脉花叶病毒，或其中紫藤脉花叶病毒含量未达检测最低限度;

方法二、取3μl扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，即显示检测到紫藤脉花叶病毒，无扩增条带则判断为阴性，即显示无紫藤脉花叶病毒，或所含紫藤脉花叶病毒未达检测最低限度。

lamp扩增反应程序为:水浴65℃，扩增45min。

实施例3、rt-pcr与lamp灵敏性检测

为了确定rt-pcr和lamp两种方法检测紫藤脉花叶病毒的灵敏性，将紫藤脉花叶病毒的cdna测定浓度，测量的溶液浓度为176ng/μl。将cdna溶液稀释，梯度为1：7.56×10⁰；2：7.56×10^-1；3：7.56×10^-2；4：7.56×10^-3；5：7.56×10^-4；6：7.56×10^-5；7：去离子水，以梯度稀释的cdna为模板，配置25μl反应体系，体系由以下成分配制而成:8ubstdna聚合酶1μl、10×thermopolbuffer2.5μl、10μmfip2μl、10μmbip2μl、10μmf30.5μl、10μmb30.5μl、25mmmgcl22μl、10mmdntps2.5μl、3mbetain2.0μl、sybrgreeni0.3μl、模板2.5μl，去离子水补足至25μl。上述各浓度梯度的cdna模板2.5μl，去离子水2.5μl作为空白对照，最后用去离子水补足至25μl。使用的lamp扩增反应程序为:65℃水浴，孵育45min；结果判断见实施例2（结果见图1）。

同时，pcr反应以cdna稀释液作为模板，对样品进行pcr扩增，反应完成后，同样取5μl扩增产物利用1%琼脂糖凝胶检测。（结果见图2）

结果显示，lamp方法可以检测到紫藤脉花叶病毒cdna浓度为7.56×10^-5ng/μl，而rt-pcr仅能检测到紫藤脉花叶病毒浓度为7.56×10^-3ng/μl，检测灵敏度lamp是pcr的100倍。

实施例4lamp特异性检测

按照实施例1中的检测体系，采用实施例1中lamp试剂盒，分别以wvmv、tylcv、trv、tmv、scsmvcdna为模板，wvmv阳性质粒为阳性对照，去离子水为阴性对照，进行样品检测，反应条件均为65℃，水浴45min。

结果如图3所示，只有含wvmv样品检测结果为荧光绿或者产生阶梯型条带，其余均为橙色，无阶梯型条带，表明本发明所提供的引物对wvmv的特异性强，准确率高。

序列表

<110>扬州大学

<120>一种快速检测紫藤脉花叶病毒的lamp引物组、试剂盒和方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gtcgtctccagatgtgaat19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cagaccatacctaggcatat20

<210>3

<211>46

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggcattttcaactatgggtttaagttgtttgggttatgatggatgg46

<210>4

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aagccaactctgagacaaatcatatggtccttcagcattcc41