1.一种基于rna恒温扩增-金探针层析技术联合检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因meca核酸的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:
1)扩增反应液:含40mmtris-hcl(ph8.0),12mmmgcl2,70mmkcl,15%dmso,5mmdtt,每种dntp各1mm,每种ntp各2mm,扩增引物各0.2µm;其中扩增引物包括三对:金黄色葡萄球菌、甲氧西林耐药基因meca、和人内参基因,具体扩增引物如下:
(1)金黄色葡萄球菌的扩增引物:
sa-r引物(5’-3’):taatacgactcactatagggagacgctttaattaatgtcgc;
sa-f引物(5’-3’):caaatgcatcacaaacag;
(2)甲氧西林耐药基因的扩增引物:
meca-r引物(5’-3’):taatacgactcactatagggagatgaagcaaccatcgttac;
meca-f引物(5’-3’):ctacaatgccaaaatctc;
(3)内参基因的扩增引物:
内参-r引物(5’-3’):taatacgactcactatagggagagcaactttaatatacgct;
内参-f引物(5’-3’):aggccctgtaattggaat;
2)扩增酶:包含三种,逆转录酶、t7rna聚合酶和rnaseh;优选地所述逆转录酶为amv或m-mlv;
3)细胞裂解液:购至美国signosis公司,货号cl-0001;
4)检测液:包含胶体金颗粒标记的核酸金探针、每个指标的特异探针、c线显色探针,每个指标特异探针有两种,分别为ces系列和les系列,其中ces系列和les系列又可以设计多条,具体如下:
(1)金黄色葡萄球菌特异探针:
sa-ces1(5’-3’):ataacggcgtaaatagttttacttggctacgtagctacgt;
sa-ces2(5’-3’):aagtggttctgaagatttttacttggctacgtagctacgt;
sa-les1(5’-3’):ccaacagtatatagtgtttttacagtacagcctgacacct
agct;
sa-les2(5’-3’):caacttcaactaaaaatttttacagtacagcctgacacctagct;
sa-les3(5’-3’):attacataaagaaccttttttacagtacagcctgacacctagct;
(2)耐甲氧西林基因特异探针:
meca-ces1(5’-3’):aggtaaagtgtatgattttttagtcgtattagtagca;
meca-ces2(5’-3’):gagctatatgagaacgtttttagtcgtattagtagca;
meca-les1(5’-3’):gtaataaaaaatacgatttttacagtacagcctgacacctagct;
meca-les2(5’-3’):tatagatgaataacaatttttacagtacagcctgacacctagct;
meca-les3(5’-3’):aacagtgaagcaatcctttttacagtacagcctgacacctagct;
(3)内参特异探针:
内参-ces1(5’-3’):gagtccactttaaatcttttgcttgtacatcggatgac;
内参-ces2(5’-3’):ctttaacgaggatccattttgcttgtacatcggatgac;
内参-les1(5’-3’):ttggagggcaagtctgtttttacagtacagcctgacacctagct;
内参-les2(5’-3’):gtgccagcagccgcggtttttacagtacagcctgacacctagct;
内参-les3(5’-3’):taattccagctccaattttttacagtacagcctgacacctagct;
(4)c线显色探针(5’-3’)
ctcactacagcatagcgagctttttacagtacagcctgacacctagct
(5)金探针
金探针5’端被巯基化修饰,所述序列为:
5’-catactctgtctacgtactggtagctatcaattttagctaggtgtcaggctgtactgt-3’
5)检测卡:所用试纸条被固定于pvc底板上,从左往右依次是样品垫、nc膜、吸水纸;nc膜上有c线(质控线)和三条t线(检测线),从样品垫到吸水纸方向分别为meca-t、sa-t、内参-t和c线(如图3);meca-t处包被meca被探针、sa-t处包被sa包被探针、内参-t处包被内参包被探针、c线处包被c线包被探针,具体序列为:
meca包被探针(5’-3’):tgctactaatacgactatttttgctactaatacgacta;
sa包被探针(5’-3’):acgtagctacgtagccaagtttttacgtagctacgtagccaagt;
内参包被探针(5’-3’):gtcatccgatgtacaagcttttgtcatccgatgtacaagc;
c线包被探针(5’-3’):agctcgctatgctgtagtgagttttagctcgctatgctgtagtgag。
2.权利要求1所述的试剂盒在制备金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因meca检测试剂中的应用。