一株嗜麦芽窄食单胞菌DIF3、微生物菌剂、生产方法及应用与流程

本发明属于环境生物技术领域，特别涉及一株铁还原菌及应用。

背景技术：

微生物胞外电子传递能够实现生物能到电能的直接转化，同时还有脱氮、脱硫、有机污染物降解、重金属污染治理以及垃圾渗滤液处理等环保价值。产电微生物以及微生物胞外电子传递机制(extracellularelectrontransfer，eet)的研究成为这个领域的核心问题。

目前，高效的产电菌，如地杆菌(geobacter)和希瓦氏菌(shewanella)均为异化fe(ⅲ)还原菌。异化铁还原菌是指能够以fe(iii)作为唯一电子受体、fe(iii)被还原、同时氧化有机碳源，并从中获取能量供自身生长的一类微生物的统称。异化铁还原菌在细菌呼吸和生长过程中能够还原多种金属离子，去除有机物和重金属,通过胞外电子转移机制将胞内有机物代谢的电子传递到胞外的电子受体。铁还原是一种重要的微生物代谢途径，也是地球化学循环过程中的重要环节。研究铁还原，筛选新的异化fe(ⅲ)还原菌株，以及铁还原过程中的电子转移过程，能帮助利用微生物胞外电子传递机制。同时，有研究表明，铁呼吸期间产生的fe(ii)会催化cr(vi)的还原，这为cr(vi)污染的治理提供了可能。异化铁还原菌在重金属污染治理、降解有机物、生物修复等方面都能够提供帮助。同时，大多数异化铁还原菌都是组建微生物燃料电池的高效产电菌。

重金属铬是重要的工业原料，是公认的129种重点污染物之一。水溶性六价铬是对人体有危害的最大的八种化学物质之一，也是重要致癌金属之一。而cr(ⅲ)是一种低毒性物质。微生物能够将cr(ⅵ)还原为cr(ⅲ)，起到降低铬污染的作用。目前，生物修复成为去除重金属污染的研究热点，而微生物修复以无二次污染，速度快，成本低，高效率等优点成为主要的重金属去除手段。

技术实现要素：

发明目的：本发明目的在于提供一株嗜麦芽窄食单胞菌dif3。本发明还提供了嗜麦芽窄食单胞菌dif3在还原fe(iii)以及cr(vi)中的应用。

技术方案：第一方面，本发明提供了一株嗜麦芽窄食单胞菌dif3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年5月15日，保藏号为cctccno：m2018276。

本发明所述的嗜麦芽窄食单胞菌dif3为革兰氏阴性菌，细菌呈杆状。

第二方面，本发明提供了嗜麦芽窄食单胞菌dif3在异化还原fe(iii)方面的应用。

第三方面，本发明提供了嗜麦芽窄食单胞菌dif3在六价铬cr(vi)还原中的应用。

第四方面，本发明提供了嗜麦芽窄食单胞菌dif3生产的微生物菌剂，所述微生物菌剂由嗜麦芽窄食单胞菌dif3发酵产生。

上述发酵用的发酵培养基为lb液体培养基，所述lb液体培养基包括nacl8-12g/l，优选为10g/l，酵母提取物4-6g/l，优选为5g/l，蛋白胨8-12g/l，优选为10g/l，ph为6.8-7.2，优选ph为7.2。

第五方面，本发明提供了嗜麦芽窄食单胞菌dif3的培养方法，所述方法包括将嗜麦芽窄食单胞菌dif3接种于lb液体培养基中振荡培养。

所述振荡培养的温度为28-32℃，优选为30℃，转速为100-300rmp，优选为120rpm。

第六方面，本发明所述的微生物菌剂的生产方法为将嗜麦芽窄食单胞菌dif3接种于lb液体培养基中振荡培养。

第七方面，本发明提供了嗜麦芽窄食单胞菌dif3或嗜麦芽窄食单胞菌dif3制备的微生物菌剂在微生物燃料电池中的应用。

第八方面，本发明提供了嗜麦芽窄食单胞菌dif3的筛选方法，包括以下步骤：

(1)构建双室微生物燃料电池；

(2)在双室微生物燃料电池阴极室倒入铁氰化钾溶液，阳极室装填细密铁矿土以及dm培养液；

(3)将双室微生物燃料电池放入恒温培养箱中，电池外接电阻，电池稳定运行；

(4)从成功启动的电池中取出电极，用挑菌棒从细菌密集处挑取细菌，在配置好的固体lb培养基上涂布划线，挑选在培养基上生长的菌落。

有益效果：(1)本发明从梅山铁矿地下铁矿土中分离得到嗜麦芽窄食单胞菌dif3，该菌具有较强的异化还原fe(iii)的还原功能，可以高效的还原柠檬酸铁和氧化铁中的fe(iii)；(2)本发明的嗜麦芽窄食单胞菌dif3能够有效还原cr(vi)离子；(3)本发明的嗜麦芽窄食单胞菌dif3能够应用在微生物燃料电池中作为产电菌；(4)本发明拓宽了人们对嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)在其功能方面的应用研究思路，为异化铁还原菌在环境污染物的治理方面提供了新的材料，具有较强的实际应用价值。

附图说明

图1为嗜麦芽窄食单胞菌dif3的菌落图；

图2为嗜麦芽窄食单胞菌dif3的电镜图片；

图3为嗜麦芽窄食单胞菌dif3的16srdna的电泳图；

图4为基于16srdna序列的嗜麦芽窄食单胞菌dif3的系统发育树；

图5为嗜麦芽窄食单胞菌dif3在还原柠檬酸铁的实验中铁还原率曲线图；

图6为嗜麦芽窄食单胞菌dif3在还原氧化铁的实验中铁还原率曲线图；

图7为嗜麦芽窄食单胞菌dif3在还原cr(vi)的曲线图；

图8为嗜麦芽窄食单胞菌dif3在微生物燃料电池中的时间功率曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作出进一步说明。

实施例1：菌株的分离、筛选和鉴定

1.1实验用品

实验样品取自梅山铁矿地下铁矿土，位置31.53n，118.43e。

dm培养基：nahco32.5g/l、cacl20.08g/l、nh4cl1.0g/l、mgcl2·6h2o0.2g/l、nacl10g/l、hepes7.2g/l、酵母提取物(yeast)0.5g/l、乳酸0.9g/l、wolfe's维生素溶液(wolfe'svitaminsolution)1ml/l、wolfe's矿物质溶液(wolfe'smineralsolution)10ml/l，ph7.2，wolfe's维生素溶液和wolfe's矿物质溶液均通过灭菌滤膜加入高温灭菌后的dm溶液。

lb液体培养基：nacl10g/l、酵母提取物(yeast)5g/l、蛋白胨10g/l，ph7.2。

lb固体培养基：nacl10g/l、酵母提取物(yeast)5g/l、蛋白胨10g/l、琼脂15g/l，ph7.2。

电池阴极室电解液(铁氰化钾溶液)：铁氰化钾50mmol/l、磷酸二氢钾40mmol/l、磷酸氢二钾60mmol/l。

1.2双室微生物燃料电池(mfc)组装和启动

本发明中双极室微生物燃料电池按以下步骤组建：

(1)将配置完毕的dm培养基、处理好的碳片电极和质子交换膜、报纸紧密包好的定制双极室玻璃瓶和橡胶塞放入高压灭菌锅灭菌，121℃灭菌30min；

(2)灭菌完毕的实验材料放入超净工作台紫外杀菌20min；

(3)用硅橡胶和质子交换膜将两个电极室连接起来，铁夹夹住防止脱落；

(4)阴极室倒入50mmol/l铁氰化钾溶液100ml，阳极室装填20g细密铁矿土并倒入100ml的dm培养液；

(5)阳极室装入电极，用橡胶塞和封口膜将阳极室密封，阴极室留一个小孔以便氧气的通入，电池用锡纸包裹；

(6)组装完毕的双极室mfc放入恒温培养箱中，温度设为25℃，电池外接5kω电阻，采用北京瑞博华公司的30通道usb数据采集卡采集电池的输出电压。定期更换dm培养基和铁氰化钾溶液(更换周期为一周)，使电池稳定运行。

1.3菌株的分离筛选

在无菌操作台上，从成功启动的电池中(运行30天)取出电极，用挑菌棒从细菌密集处挑取细菌，在配置好的固体lb培养基上涂布划线，放入30℃恒温培养箱，过夜培养。选取lb固体培养基表面单独生长的菌落，在新的培养基上划线，过夜培养。如此重复多次，直至细菌生长形态稳定。将稳定的培养皿置于4℃冰箱保存备用，同时，用lb液体培养基摇菌(30℃，120rpm)得到的菌液与60％灭菌甘油1:1混合，放入负80℃冰箱冻存。

1.4菌株特性及鉴定

(1)菌株的菌落形态为：在lb琼脂培养基中生长，菌呈荧光色，生长连续，不易形成单独的菌落(见图1)，细菌呈杆状(见图2)，为革兰氏阴性菌。其最适生长温度为30℃，最适生长ph值为7。

(2)对菌株进行16srrna分子的鉴定：以细菌的核dna为模板，以16srrna基因pcr扩增的通用引物为引物，进行pcr扩增，得到长度为1413bp的扩增带(用1％琼脂糖凝胶电泳检测)，电泳结果如图3所示。pcr产物经纯化后，测定其全序列。结果显示，16srrna基因序列长度为1413bp(seqidno：1)，采用blast分析法将16srrna序列与genbank数据库进行比对分析，发现该菌株与嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)的亲缘关系最接近，同源性高达99％以上，命名为嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)dif3，基于16srrna基因序列的嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)dif3的系统发育进化树，见图4。

本发明从梅山铁矿中分离得到嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)dif3，于2018年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏号为cctccno：m2018276。并发现其较强的fe(iii)还原功能。这拓宽了人们对嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)dif3在其功能方面的应用研究思路，并为铁还原菌在环境污染物的治理方面提供了新的材料，具有较强的实际应用价值。

实施例2：嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)dif3在还原fe(iii)方面的应用

嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)dif3还原柠檬酸铁实验：(1)配置dm溶液，溶液中加入2mmol/l柠檬酸铁。高温灭菌后加入无菌的100ml血清瓶中，放入菌液密封，对照实验不加入菌液，置于30℃恒温培养箱中暗培养。每隔12h，在无菌操作台中提取一次样品，按照测铁还原标准曲线的方法，利用紫外分光光度计分别检测样品的fe²⁺浓度变化及细菌生长曲线(od600)(见图5)，结果表明嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)dif3在96h铁还原能力约为0.42mmol/l。

嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)dif3还原氧化铁实验：配置dm溶液，溶液中加入100mg/100ml氧化铁。高温灭菌后加入无菌的100ml血清瓶中，放入菌液密封，对照实验不加入菌液，置于30℃恒温培养箱中暗光培养。每隔20h，在无菌操作台中提取一次样品，利用紫外分光光度计分别检测样品的fe²⁺浓度变化及细菌生长曲线(od600)(见图6)，结果表嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)dif3在120h铁还原能力约为0.58mmol/l，而对照实验仅有微量fe²⁺产生。说明嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)dif3具有异化铁还原能力。

实施例3：嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)dif3在六价铬还原方面的应用

嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)dif3对cr(vi)还原能力验证实验：配置dm溶液，溶液中加入2mmol/l无水铬酸钠。高温灭菌后加入无菌的100ml血清瓶中，放入菌液密封，对照实验不放入菌液，置于30℃恒温培养箱中暗培养。每隔12h，在无菌操作台中提取一次样品，按照测铬还原标准曲线的方法，利用紫外分光光度计分别检测样品的cr⁶⁺浓度变化及细菌生长曲线(od600)，结果显示，0-24h之间，cr⁶⁺浓度降低迅速，嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)dif3在96h铬还原能力约为1.28mmol/l(见图7)。说明嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)dif3具有较好的铬还原能力。

实施例4：嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)dif3在微生物燃料电池中的应用

将嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)dif3置于双室微生物燃料电池阳极，测定功率密度曲线，微生物燃料电池的输出功率密度是该装置输出功率与采用的电极面积之比，是衡量微生物燃料电池产电效率的重要指标。本实验采用北京瑞博华公司的30通道usb数据采集卡采集各mfc装置的闭路电压，每隔1h记录一次每个电池装置的闭路电压。由欧姆定律及相关电学公式得出输出功率密度的计算公式：

其中p闭合表示输出功率密度，e表示电池装置的输出电压，r外接表示电池装置的外接电阻，s电极表示碳片电极的面积。已知外接电阻为5kω，电极面积为4cm²。所得功率密度曲线如图8所示，说明嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)dif3具有较好的产电能力，可以用于微生物燃料电池。

上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。

序列表

<110>东南大学

<120>一株嗜麦芽窄食单胞菌dif3、微生物菌剂、生产方法及应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1413

<212>dna

<213>16srdna基因序列表(dif316srdna)

<400>1

cagtcgaacggcagcacaggaagaagcttgcttctctgggtggcgaagtggcggacgggt60

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