缓冲液及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及缓冲液及其应用，更具体地，涉及一种缓冲液、一种试剂盒、该缓冲液在构建核酸文库中用于接头连接缓冲液，以及一种构建核酸文库的方法。

背景技术：

构建二代测序文库的一般流程包括：(1)对目的dna片段化；(2)对游离dna进行末端平齐化处理；(3)在平齐化后的dna的3’末端突出腺苷酸化；(2)将突出腺苷酸化的dna片段与突出胸腺嘧啶化的双链y型接头进行连接。文库构建的目的即为在双链dna片段两段加上接头。而文库转化率为测得产量与理论最高产量质检的比值，即有多少起始样本被最终转化为两段接有接头的片段。

转化率很大程度上受连接效率的影响，连接反应效率与酶反应效率、dna链末端开放性、供体和受体的碰撞效率等多个因素相关，同时在连接反应体系中的接头还会产生自连消耗反应中的有效接头数量，是文库构建过程中的一个效率瓶颈。目前市场上通用的快速连接缓冲液其连接反应平台期高度有限，存在增大酶投入量以克服缓冲体系不匹配等情况，提高了实际应用的成本；另外在现有的连接缓冲液下连接时间无法向前推动酶反应平衡；且在预混过程中会产生大量错配降低了文库产量，限制了高通量工作流程的搭建。

由此，现有的连接缓冲液有待改进。

技术实现要素：

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种缓冲液，该缓冲液有利于提高连接反应效率，降低错配率，并且兼容性好，对连接酶的抑制作用小，显著降低体系用酶量，从而降低了实验的成本。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种缓冲液。根据本发明的实施例，该缓冲液包括：33-66mmtris缓冲液，2-15mm二价阳离子、25-75mm一价阳离子、0.5-10mm二硫苏糖醇(dtt)、5-15％peg4000-8000和0.5-2mmatp，ph值为7-9。

本发明实施例的缓冲液能提高连接反应效率，增加底物的转化率，降低连接反应的错配率，并且兼容性好，对连接酶的抑制作用小，同时，显著降低体系用酶量，从而降低了实验的成本。

另外，根据本发明上述实施例的缓冲液还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述tris缓冲液为tris-盐酸缓冲液和/或tris-醋酸缓冲液，优选地，为tris-醋酸缓冲液。

根据本发明的实施例，所述tris-醋酸缓冲液的浓度为33-40mm。

根据本发明的实施例，所述二价阳离子为mg²⁺或mn²⁺，优选地，为mg²⁺。

根据本发明的实施例，所述二硫苏糖醇的浓度为0.5-5mm。

根据本发明的实施例，所述peg4000-8000的浓度为7-12％，优选地，为9-11％，更优选地，为10％。

根据本发明的实施例，所述peg4000-8000为peg4000和/或peg6000。

根据本发明的实施例，所述ph值为8。

根据本发明的实施例，所述缓冲液包括：33-66mmtris-醋酸缓冲液，5-10mmmg²⁺、45-55mm一价阳离子、0.5-10mm二硫苏糖醇(dtt)、5-15％peg6000和0.5-2mmatp，ph值为7-9。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的缓冲液。

本发明实施例的试剂盒的连接反应效率和底物的转化率高，连接反应的错配率低，并且兼容性好，试剂盒内的缓冲液对连接酶的抑制作用小，体系用酶量小，试剂盒的成本低。其中，需要说明的是，该缓冲液具备前述缓冲液全部技术特征，在此不再一一赘述。

根据本发明的第三方面，本发明提供了前述的缓冲液在构建核酸文库中用于接头连接缓冲液。

本发明实施例的前述缓冲液在构建核酸文库中用于接头连接缓冲液，用于试剂盒的连接反应效率和底物的转化率高，连接反应的错配率低，并且兼容性好，试剂盒内的缓冲液对连接酶的抑制作用小，体系用酶量小，试剂盒的成本低。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种构建核酸文库的方法。根据本发明的实施例，将预处理后的核酸与反应体系混合进行接头连接反应，其中，所述反应体系含有前述的缓冲液，且所述连接反应的时间为不低于10分钟，温度为16-37摄氏度。

本发明实施例的构建核酸文库的方法，连接反应效率和底物的转化率高，连接反应的错配率低，并且兼容性好，该方法采用的缓冲液对连接酶的抑制作用小，体系用酶量小，试剂盒的成本低。其中，需要说明的是，该缓冲液具备前述缓冲液全部技术特征，在此不再一一赘述。

根据本发明的实施例，所述连接反应的时间为10分钟至16小时，温度为20-30摄氏度。

根据本发明的实施例，所述接头连接反应的连接酶为t4dna连接酶。

根据本发明的实施例，所述t4dna连接酶的浓度为4-6u。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的t4dna连接酶介导的连接反应示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的不同浓度的一价阳离子的文库产量示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的不同成分缓冲液的文库产量示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的不同反应条件下的文库产量示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例的不同反应条件下的连接效率示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

缓冲液

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种缓冲液。根据本发明的实施例，该缓冲液包括：33-66mmtris缓冲液，2-15mm二价阳离子、25-75mm一价阳离子、0.5-10mm二硫苏糖醇(dtt)、5-15％peg4000-8000和0.5-2mmatp，ph值为7-9。

本发明实施例的缓冲液能提高连接反应效率，增加底物的转化率，降低连接反应的错配率；并且兼容性好，在一些实施例中，与通用缓冲体系配合使用，可以兼容打断、末端修复和加腺嘌呤(a)的过程，显著缩短了文库构建所需的时间，在一些具体的实施例中，仅需2小时就可以完成建库过程；并且，该缓冲液对连接酶的抑制作用小，显著降低体系用酶量，从而降低了实验的成本。

根据本发明的一些实施例，在peg4000-8000的存在下，单价阳离子会促进连接反应，并且单价阳离子的存在能够提高t4dna连接酶的保真性，二价阳离子，尤其是mg²⁺或mn²⁺，能够抑制错配连接，其中，以mg²⁺的抑制错配连接的效率更高，在一些实施例中，mg²⁺的抑制效率可达mn²⁺的四倍。发明人通过实验研究，在peg存在的情况下优化缓冲液的成分，提高文库产量。

根据本发明的实施例，该tris缓冲液为tris-盐酸缓冲液和/或tris-醋酸缓冲液，优选地，为tris-醋酸缓冲液。由此，这两种缓冲液有利于促进酶和dna的相互作用，并且缓冲液在ph值7-9的范围内，缓冲能力强，维持体系ph值稳定。进一步地，根据本发明的实施例，该tris-醋酸缓冲液的浓度为33-40mm。由此，体系的ph更适宜保持酶的活性。

发明人研究发现，t4dna连接酶介导的连接反应依赖于二价阳离子的存在，尤其是mg²⁺或ca²⁺，其中，以mg²⁺的效果更佳，同时，二价阳离子的浓度能够调节酶与底物的结合强度，从而调节连接反应的保真度。根据本发明的实施例，当缓冲液体系中，mg²⁺或ca²⁺的总浓度为1.6-10mm，尤其是5-10mm时，不影响连接酶的酶活的前提下，有效抑制接头自连和错配，有效降低接头连接的错配率。

根据本发明的实施例，二硫苏糖醇的浓度为0.5-5mm，在该浓度下，二硫苏糖醇对酶的保护作用好，使酶的活性保持稳定。

进一步地，t4dna连接酶介导的连接反应如图1所示分3步进行，其中第二步为单链末端反应，依赖单链末端的开放性。而peg作为一种分子拥挤剂，能促进末端的物理分离，从而促进连接效率，同时也能促进接头间的连接。另外，na⁺等一价阳离子会抑制t4dna连接酶的活性，而在建库过程的连接反应上游步骤中必不可免的需要na+的存在且该体系中的na⁺会进入连接反应一步，这与释放酶活，解除酶活抑制相矛盾。发明人研究发现，当连接反应中的peg4000-8000，尤其是peg6000，当浓度到达某个点时，在高浓度一价盐离子(150-200mmnacl，200-250mmkcl)存在的情况下仍然能有效进行连接反应。发明人近一些对peg4000-8000的浓度进行了摸索，根据本发明的实施例，peg4000-8000的浓度为7-12％，优选地，为9-11％，更优选地，为10％时，在解除na⁺等一价阳离子对酶活的抑制作用的同时，促进接头连接，提高连接效率。并且，根据本发明的实施例，peg4000-8000为peg4000和/或peg6000时，尤其是peg6000，对酶活抑制的解除作用更佳，接头连接效率显著提高。

根据本发明的实施例，所述ph值为7.5-8.5。由此，酶的活性高。

根据本发明的实施例，所述缓冲液包括：33-66mmtris-醋酸缓冲液，5-10mmmg²⁺、45-55mm一价阳离子、0.5-10mm二硫苏糖醇(dtt)、5-15％peg6000和0.5-2mmatp，ph值为7-9。由此，该缓冲液连接反应效率提升可达75％以上，尤其适于关注底物转化效率的实验中，并且，能显著有效地抑制错配，错配率更低。同时，与现有类似连接反应体系，如kapa、neb和enzymatics等，该体系对t4dna连接酶无明显的抑制作用，并且，酶量不到现有体系酶量的1/5，使缓冲液的成本显著降低。此外，该缓冲液还能与部分通用缓冲体系配和使用，兼容打断、末修加a体系，使得整个文库构建过程所需时间更短，使得文库构建更加流畅，高效，并且测序数据质量满足基因组组装、捕获测序、转录组分析等需求。

缓冲液的应用

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的缓冲液。

本发明实施例的试剂盒的连接反应效率和底物的转化率高，连接反应的错配率低，并且兼容性好，试剂盒内的缓冲液对连接酶的抑制作用小，体系用酶量小，试剂盒的成本低。其中，需要说明的是，该缓冲液具备前述缓冲液全部技术特征，在此不再一一赘述。

根据本发明的第三方面，本发明提供了前述的缓冲液在构建核酸文库中用于接头连接缓冲液。

本发明实施例的前述缓冲液在构建核酸文库中用于接头连接缓冲液，用于试剂盒的连接反应效率和底物的转化率高，连接反应的错配率低，并且兼容性好，试剂盒内的缓冲液对连接酶的抑制作用小，体系用酶量小，试剂盒的成本低。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种构建核酸文库的方法。根据本发明的实施例，将预处理后的核酸与反应体系混合进行接头连接反应，其中，所述反应体系含有前述的缓冲液，且所述连接反应的时间为不低于10分钟，温度为16-37摄氏度。

本发明实施例的构建核酸文库的方法，连接反应效率和底物的转化率高，连接反应的错配率低，并且兼容性好，该方法采用的缓冲液对连接酶的抑制作用小，体系用酶量小，试剂盒的成本低。其中，需要说明的是，该缓冲液具备前述缓冲液全部技术特征，在此不再一一赘述。

其中，需要说明的是，本文中“预处理后的核酸”是指将dna片段经过末端修复和加接头a(腺嘌呤核苷酸)处理后的核酸序列。

根据本发明的实施例，该连接反应的时间为10分钟至16小时，温度为20-30摄氏度。由此，连接效率和文库产量高。

根据本发明的实施例，该接头连接反应的连接酶为t4dna连接酶。根据本发明的实施例，t4dna连接酶的浓度为4-6u。由此，t4dna连接酶的浓度适宜，有利于连接反应充分进行。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自illumina公司。

本发明实施例的构建核酸文库的一般方法：

(1)末端修复和加碱基a

运行条件：20℃，5min；75℃，10min。

(2)连接处理

33-66mmtris缓冲液，1.6-5mm二价阳离子、25-75mm一价阳离子、0.5-10mm二硫苏糖醇(dtt)、5-15％peg4000-8000和0.5-2mmatp，ph值为7-9。

连接缓冲液的成分为45mmtris缓冲液，3mm二价阳离子、50mm一价阳离子、5mm二硫苏糖醇(dtt)、10％peg4000-8000和1.5mmatp，ph值为8。

运行条件：20℃，30min

(3)磁珠纯化

1.2×(100ul)ann磁珠纯化，75％乙醇清洗两次，20uleb洗脱。

(4)pcr

运行条件：94℃2min；(94℃15s，62℃30s，72℃30s，)5/6cycles；72℃10min；4℃永远

(5)磁珠纯化

1×ann磁珠纯化，75％乙醇清洗两次，适量eb洗脱。

实施例1

本实施例中，研究在peg存在的情况下不同浓度的一价阳离子对文库产量的影响，按照上述一般步骤进行，其中，连接缓冲液的成分为45mmtris-ac缓冲液，3mmmg²⁺、na⁺、5mm二硫苏糖醇(dtt)、10％peg4000-8000和1.5mmatp，ph值为8。其中，连接缓冲液中na+浓度如表1所示，具体如下：

表1不同na+浓度下的接头自连数量统计

如表1所示，在7.5％(w/v)peg存在的情况下，结果符合假设，随na+浓度的升高，接头自连的数量明显下降，其中37.5mmna+的存在下接头自连的数量约是50mmna+的4倍，37.5mmna+的存在下接头自连的数量约是62.5mmna+的6.5倍。

备注：纵坐标为evagreen染料法实时定量pcr测得的ct值，其与起始dna分子数量成反比(ct＝-klgx0+b，其中k＝-1/log(1+e))。

文库产量如图2所示，在7.5％(w/v)peg存在的情况下，50mm一价阳离子相比于25mm一价阳离子对文库产量的增加有正面作用，但是75mm一价阳离子对文库产量的促进作用不明显，且波动范围较宽。

实施例2

由于tris-ac与tris-hcl的负离子的电负性不同，因此对酶和dna相互作用产生的影响不同，并且，这两种缓冲的能力也有所区别，进而，在本实施例比较t4dna连接酶介导的连接反应中，tris-ac与tris-hcl缓冲液的效果，按照上述一般步骤进行，连接缓冲液的成分为tris-ac缓冲液，3mmmg²⁺、50mmna⁺、5mm二硫苏糖醇(dtt)、10％peg4000-8000和1.5mmatp，ph值为8。仅对连接缓冲液中tris缓冲液的分别为tris-ac和tris-hcl，缓冲液的缓冲效果如图3所示，在7.5％(w/v)peg存在的情况下，tris-ac的波动范围较宽，但是对文库产量的增加有正面作用。

实施例3

本实施例中，按照构建核酸文库的一般方法，改变连接缓冲液中peg的浓度，比较7.5％和10％peg对文库构建的影响，其中，连接缓冲液的成分为45mmtris-ac缓冲液，3mmmg²⁺、50mmna⁺、5mm二硫苏糖醇(dtt)、peg4000-8000和1.5mmatp，ph值为8，具体如下：

表2不同peg浓度下的文库产量统计

如表2所示，peg6000的浓度为10％，连接时间为15min时，其文库产量为7.5％浓度的1.62倍。在配制预混液并放置1h时，10％的peg6000条件下文库产量仍然高于7.5％的peg6000浓度条件。

其中，需要说明的是，15min指连接时间为15min，15min*指连接反应试剂混合液(除底物dna)在4度放置1h后连接15min。

实施例4

由于t4dna连接酶介导的连接反应依赖于镁离子的存在，同时镁离子的浓度能够调节酶与底物的结合强度，从而调节连接反应的保真度，进而，本实施例摸索在不影响连接酶酶活前提下有效抑制接头错配连接的镁离子浓度，其中，连接缓冲液的成分为45mmtris--ac缓冲液，mg²⁺、50mmna⁺、5mm二硫苏糖醇(dtt)、10％peg4000-8000和1.5mmatp，ph值为8，其中，mg²⁺的浓度如表3所示。

表3不同mg2+浓度下的接头自连数量统计

如上表所示，镁离子浓度下降至5mm后接头自连数量降至15mm浓度的1/7，同时，为了兼顾文库产量我们5-8mm的镁离子浓度建库效果更佳。

实施例5

本实施例中，将本实施例的快速缓冲液与三种现有的商业连接酶进行比较，测试本实施例的缓冲液与连接酶的配合程度，并且，通过酶的选择，进一步抑制此套体系的错配和尽可能解除缓冲体系对酶活的抑制，其中，本实施例的缓冲液的配方如下：33-66mmtris-醋酸缓冲液，6mmmg²⁺、50mna⁺，5mm二硫苏糖醇(dtt)、8％peg6000和1mmatp，ph值为8，按照前述构建核酸文库的一般方法进行操作，结果如下：

表4quicknew体系下不同酶种类的文库产量统计

其中，t4dna连接酶-1、t4dna连接酶-2和t4dna连接酶-3均为市售商品

如表4所示，供应商2的平台高度约为供应商1的4倍，为供应商3的1.15倍。备注：本实施例采用的均为weiss酶活单位(weiss,b.,et.al.,(1968)j.biol.chem.,243,4556)，可根据weissu：ceu＝1:200的关系换算成ceu。上述表中的数据仍然成立。

实施例6

本实施例中，采用实施例4的缓冲液体系，研究反应条件的变化对建库结果的产量的影响，结果如下：

表5quicknew体系不同连接时间的连接效率统计

如表5和图4和5所示，本发明实施例的连接体系在6摄氏度过夜连接时连接效率达到77.29％，到达了平台期。在固定连接时间十分钟时，优先连接温度为20摄氏度。并且该缓冲液体系表现为随时间延长，连接效率升高。该连接反应温度为16-37摄氏度，优先为16摄氏度至30摄氏度，更优选为20摄氏度。该连接反应时间为10min-过夜连接，连接效率随时间的延长而升高，综合考虑反应的效率问题，连接时间为10分钟至16小时，更优先地，连接时间为10min、30min或1h。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。