本发明属于生物医药技术领域，具体地涉及一种发酵法制备去甲基四环素的方法。
背景技术：
去甲基四环素是盐酸米诺环素合成第一步的中间体，传统合成方法是发酵并提纯去甲基金霉素，再通过脱氯反应合成去甲基四环素，总收率80％；该反应需要通入氢气，反应压力高达4mpa，温度接近60℃，同时还要使用价格昂贵的钯碳催化剂，因此该过程具有极高的安全风险，稍有不慎即会造成爆炸，对设备和操作精度要求较高，生产难度大，生产成本高。
技术实现要素：
为解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种以工程菌为起始，通过发酵培养，依靠微生物次级代谢产生去甲基四环素的方法。
本发明采用的技术方案为：一种发酵法制备去甲基四环素的方法，包括以下步骤：步骤a：使用工程菌按照标准配方培养种液；
步骤b：将上述种液接入灭菌种子罐进行培养；
步骤c：种罐培养完毕后将所得的培养种子接入发酵罐；移种量20％，培养周期5～15天，得到发酵液；
步骤d：放罐后先将上述发酵液加热，冷却至室温后过滤，滤液排掉，滤渣留用；
步骤e：将上述滤渣加入纯化水中搅拌均匀，制成混悬液，使用液碱调至碱性，加入净化剂和絮凝剂pam，静置后再次过滤，得到净化液；
步骤f：上述净化液使用纳滤膜浓缩，浓缩液加入酸化剂调节ph结晶，干燥后得到粗品；
步骤g：上述粗品加入到酸性有机溶剂中溶解，加入活性炭搅拌脱色，过滤，得到脱色液；
步骤h：上述脱色液中加入碱化剂，降温结晶，干燥后得到成品。
进一步地，所述步骤b中的种子罐培养和步骤c中的发酵罐培养的条件均为：培养温度为28℃，罐压0.02～0.04mpa，通气量1vvm，联动控制溶氧≥30％，转速300～800rpm。
进一步地，所述步骤d中加热温度为60～70℃，保温时间30～60分钟。
进一步地，所述步骤e中混悬液浓度为与步骤c中的发酵液浓度相同，碱性调至ph10～11，净化剂为水杨酸盐、磷酸盐、苦味酸盐中的一种或两种，添加量为500～1000ppm。
进一步地，所述步骤f中浓缩浓度为10000～15000u/ml，结晶ph4～6。
进一步地，所述步骤g中有机溶剂为c1～c3的醇类或酮类，含量为50～90％，酸性ph1～2。
进一步地，所述步骤h中结晶ph4～6，结晶温度5～15℃。
本发明获得的有益效果为：本发明确定发酵法制备去甲四环素的工艺，提取全程在常低温和常压条件下进行，不需要氢气和钯碳催化剂，使用通用溶剂，降低了安全风险，通过发酵提纯直接获得去甲基四环素，收率提高至90％以上，减少设备投资，降低了生产成本，工艺绿色环保，具有积极的意义。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：使用工程菌按照标准配方培养种液，将种液接入灭菌种子罐进行培养，培养温度为28℃，罐压0.03mpa，通气量1vvm，联动控制溶氧≥30％，转速800rpm；种罐培养完毕后接入发酵罐，培养温度28℃，罐压0.03mpa，通气量1vvm，联动控制溶氧≥30％，转速800rpm；移种量20％、培养周期9天放罐，放罐效价9300u/ml，体积60l。
放罐后先将发酵液加热至70℃，保温60分钟，冷却至室温后用板框过滤，滤液排掉，滤渣留用；将滤渣加入与滤液等量的纯化水中搅拌均匀，制成混悬液，使用液碱调至ph值10.5，加入500ppm的磷酸钙和50ppm的絮凝剂pam，静置30min后再次过滤，得到净化液。净化液使用纳滤膜浓缩至12000u/ml，浓缩液加入盐酸调节ph值5.2，结晶干燥后得到粗品。
粗品加入到ph值1.5的80％丙酮中溶解，加入粗品质量0.04倍的活性炭搅拌脱色30min，过滤；脱色液中加入氨水，调节ph值4.5，降温8℃结晶，干燥后得到成品520g，总收率93％。
实施例2：使用工程菌按照标准配方培养种液，将种液接入灭菌种子罐进行培养，培养温度28℃，罐压0.04mpa，通气量1vvm，联动控制溶氧≥30％，转速600rpm；种罐培养完毕后接入发酵罐，培养温度28℃，罐压0.04mpa，通气量1vvm，联动控制溶氧≥30％，转速600rpm，移种量20％，培养周期9天放罐，放罐效价10200u/ml，体积57l。
放罐后先将发酵液加热至65℃，保温40分钟，冷却至室温后用板框过滤，滤液排掉，滤渣留用；将滤渣加入与滤液等量的纯化水中搅拌均匀，制成混悬液，使用液碱调至ph值10.8，加入1000ppm的磺基水杨酸和50ppm的絮凝剂pam，静置30min后再次过滤，得到净化液。净化液使用纳滤膜浓缩至10000u/ml，浓缩液加入盐酸调节ph值4.6，结晶干燥后得到粗品。
粗品加入到ph值1.0的70％乙醇中溶解，加入粗品质量0.04倍的活性炭搅拌脱色30min，过滤。脱色液中加入氨水，调节ph值5.0，降温10℃结晶，干燥后得到成品535g，总收率92％。
以上得到的去甲基四环素均符合米诺环素中间体质量标准。
1.一种发酵法制备去甲基四环素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a：使用工程菌按照标准配方培养种液；
步骤b：将上述种液接入灭菌种子罐进行培养；
步骤c：种罐培养完毕后将所得的培养种子接入发酵罐；移种量20％，培养周期5～15天，得到发酵液；
步骤d：放罐后先将上述发酵液加热，冷却至室温后过滤，滤液排掉，滤渣留用；
步骤e：将上述滤渣加入纯化水中搅拌均匀，制成混悬液，使用液碱调至碱性，加入净化剂和絮凝剂pam，静置后再次过滤，得到净化液；
步骤f：上述净化液使用纳滤膜浓缩，浓缩液加入酸化剂调节ph结晶，干燥后得到粗品；
步骤g：上述粗品加入到酸性有机溶剂中溶解，加入活性炭搅拌脱色，过滤，得到脱色液；
步骤h：上述脱色液中加入碱化剂，降温结晶，干燥后得到成品。
2.根据权利要求1所述一种发酵法制备去甲基四环素的方法，其特征在于：所述步骤b中的种子罐培养和步骤c中的发酵罐培养的条件均为：培养温度为28℃，罐压0.02～0.04mpa，通气量1vvm，联动控制溶氧≥30％，转速300～800rpm。
3.根据权利要求1所述一种发酵法制备去甲基四环素的方法，其特征在于：所述步骤d中加热温度为60～70℃，保温时间30～60分钟。
4.根据权利要求1所述一种发酵法制备去甲基四环素的方法，其特征在于：所述步骤e中混悬液浓度为与步骤c中的发酵液浓度相同，碱性调至ph10～11，净化剂为水杨酸盐、磷酸盐、苦味酸盐中的一种或两种，添加量为500～1000ppm。
5.根据权利要求1所述一种发酵法制备去甲基四环素的方法，其特征在于：所述步骤f中浓缩浓度为10000～15000u/ml，结晶ph4～6。
6.根据权利要求1所述一种发酵法制备去甲基四环素的方法，其特征在于：所述步骤g中有机溶剂为c1～c3的醇类或酮类，含量为50～90％，酸性ph1～2。
7.根据权利要求1所述一种发酵法制备去甲基四环素的方法，其特征在于：所述步骤h中结晶ph4～6，结晶温度5～15℃。