本发明涉及神经退行性病症，并且具体地涉及用于治疗这种病状，例如阿尔茨海默病的新颖寡核苷酸。本发明尤其涉及新颖反义寡核苷酸，并且涉及包括这种寡核苷酸的组合物，并且涉及用于治疗神经退行性病症的疗法和方法。本发明扩展到基因组编辑技术的用途，其用于实现与使用新颖反义寡核苷酸类似的结果。mrna的替代性剪接是脑部复杂性的主要因素[1]。即使尚不完全了解替代性剪接的mrna转录物的精确功能和作用，但这些替代性剪接的mrna中的一些替代性剪接的mrna已经与神经退行性脑部病症的表现和/或进展联系起来[2]。最常见的神经退行性脑部病症是阿尔茨海默病(ad)，并且根据阿尔茨海默症协会(alzheimer'ssociety)，全世界有3600万人患有ad，并且此数字预计每20年翻一番。在ad中，神经元的功能特性逐渐衰退，其中神经元的突出、连接显著丧失，并且最终神经元变性。据信，衰老、遗传和环境因素的混合物有助于疾病的表现和进展[3]。ad脑的特性表型是由淀粉样β(aβ)肽的沉积构成的细胞外淀粉样斑块的存在。这些肽作为淀粉样前体蛋白(app)的蛋白质水解加工的副产物产生，并且被认为是疾病的显著因素[4]。人类的app由18个外显子[3]的单个基因编码，所述单个基因定位于染色体21q21.3[56]上并且在许多组织类型中表达[7]。app属于具有大的细胞外结构域和小的细胞质尾区的i型单通跨膜蛋白家族[8，9]。appmrna的差异剪接产生若干剪接变体，其中主要同种型产生695、751和770个氨基酸的蛋白。app695和app751同种型是分别由外显子7(app751)或外显子7和8(app695)剪接而产生的，而app770含有这两个外显子[10，11]。外显子7编码库尼茨(kunitz)型蛋白酶抑制剂结构域(kpi)，并且外显子8编码与胸腺源性淋巴细胞的ox-2抗原共享同源性的结构域[10，11]。尽管app被普遍表达，但不同的mrna变体在不同的细胞类型中以不同的量表达。非神经元细胞主要表达app751和770[12]，而神经元内的app695被发现大量存在[8]。然而，在衰老的脑部或ad患者的脑部中，并且响应于nmda(n-甲基-d-天冬氨酸)受体刺激，app695减少，并且更长的同种型增加[13-20]。进一步支持同种型表达的改变对ad的进展具有重要意义的假说来自示出以下的报道：在ad患者中，调节多聚嘧啶段结合蛋白ptbp1(负责从app的mrna中排除外显子7和8的异质性核内核糖核蛋白)的微rna(mir-124)的表达减少[21]。尽管app的剪接模式在ad中似乎有所变化，但三种不同同种型的精确功能仍不清楚。然而，有证据表明在病理学病状下不同同种型的表达水平发生了改变。例如，nmda谷氨酸受体的延长的活化会增加app751而不是app695的水平，从而还增加aβ的水平[22]。有趣的是，进一步表明app695的表达向app751同种型的改变先于aβ水平的增加，这表明aβ的累积与app751同种型的增加相关[13,23，24]。证据进一步示出app695的表达减少与ad的进展相连，还示出aβ以及app细胞内结构域(aicd)(即app的两种非常重要的蛋白质水解产物)都是由app695优先产生的[25]。这是令人惊讶的，因为ad患者中app695的减少还将表明aβ肽的累积减少。即使aβ的产生增加，app695的减少如何可以有助于ad进展的可能解释来自示出以下的报道：来自细胞内aicd片段的核定位和基因表达的随后调节与app695通过淀粉样蛋白途径的加工相连[25-28]。一旦处于细胞核中，aicd就会取代如脑啡肽酶(nep)等靶基因上的组蛋白去乙酰化酶，所述脑啡肽酶(nep)是负责aβ降解的锌依赖性金属蛋白酶。[25]。这些数据表明，通过app695的蛋白质水解加工产生的aicd片段调节可能潜在抵抗aβ毒性作用的基因的表达。在这种情况下，ad患者中app751的水平升高可能不会通过诱导app的淀粉样蛋白加工来触发aβ累积，而是通过调节基因转录来破坏aβ水平的稳态调节，从而增强其毒性。鉴于上述情况，因此需要提供用于治疗如阿尔茨海默病等神经退行性病症的经过改进的疗法。如实例中所描述的，发明人已经研究了互补的、经过修饰的反义寡核苷酸(aon)如何可以靶向appmrna的加工以通过外显子跳读来促进外显子7和8的排除。发明人设计了与外显子7和8内的各个位点互补且还位于外显子7和8的剪接接合点周围的磷酸二酰胺吗啉代寡聚体(pmo)，并在人神经母细胞瘤细胞系sh-sy5y中对其进行测试，以标识最佳的候选序列。值得注意的是，结果示出48小时后在mrna水平下，外显子7和8完全跳读，以及72小时后在蛋白质水平下，较短的同种型app695显著增加。这些结果表明，使用反义寡核苷酸改变appmrna的加工以为ad提供替代性治疗方法的可行性。因此，在本发明的第一方面，提供了一种反义寡核苷酸(aon)，所述aon能够减少或防止外显子7和/或外显子8包含到通过从淀粉样前体蛋白(app)转录物剪接而产生的appmrna中。有利地，并且优选地，实例描述了可以如何使用根据第一方面所述的aon来促进外显子跳读以增加app695mrna同种型的表达，并减少app751同种型和app770同种型的量。主要目标是设计靶向app的两个替代性剪接外显子(即外显子7和8)的aon。发明人设计了靶向外显子7的五种aon和靶向外显子8的四种aon。选择最有效pmo中的两个pmo，每个外显子各一个(pmo7.2和pmo8.2)，并且发明人示出，即使在相对低的aon浓度下也有可能令人惊讶地实现所靶向外显子的100％跳读。此外，发明人还示出，当组合使用aon时，在mrna水平下观察到的app695的丰度在蛋白质水平下也是明显的。这些数据清楚地表明，使用aon在体外恢复app695的水平是可行的，并且因此人们可能对将本文所描述的策略作为如阿尔茨海默病等神经退行性病症的治疗方法的实施方案持乐观态度。在第二方面，提供了根据第一方面所述的反义寡核苷酸(aon)，所述aon在疗法或诊断中使用。在第三方面，提供了根据第一方面所述的反义寡核苷酸(aon)，所述aon用于治疗、预防或改善神经退行性病症。在第四方面，提供了一种治疗、改善或预防受试者的神经退行性病症的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的根据第一方面所述的反义寡核苷酸(aon)。优选地，所述神经退行性病症是阿尔兹海默病。如本文所描述的，发明人已经开发出有效的策略，所述策略修饰app剪接变体的比率，而不是总体上减少表达量。如此，所述策略基于允许app的表达并增加app695同种型(缺少外显子7和8)的相对浓度，同时通过跳读在已知存在的任何app前mrna同种型中的外显子7和/或8来减少app751同种型(缺少外显子7但包含外显子8)和app770同种型(包含外显子7和8两者)的量。用于改变基因表达和具体蛋白质的产生的策略是使用根据本发明的经过修饰的反义寡核苷酸(aon)，所述aon优选地以标准的watson-crick方式与靶区域结合，以干扰rna转录、前mrna剪接或mrna转译。使携带病理突变的外显子跳读的aon当前正被用于治疗杜氏肌营养不良症(dmd)。此方法的先决条件是，侧接有待跳读的一个或多个外显子的外显子使用相同读框。换句话说，侧接外显子的接合不应中断全长蛋白质的读框，以避免掺入编码不同于野生型蛋白质的氨基酸的下游密码子或甚至终止密码子。优选地，在一个实施例中，本发明的反义寡核苷酸(aon)能够减少或防止外显子7包含到通过从淀粉样前体蛋白(app)转录物剪接而产生的appmrna中。优选地，因此，aon用于外显子7跳读以治疗、改善或预防神经退行性病症。人淀粉样前体蛋白(app)基因的外显子7的一个实施例的核苷酸序列(refseq：nm_000484.3)的长度为168个核苷酸，并且在本文中作为seqidno:1提供，如下所示：aggtgtgctctgaacaagccgagacggggccgtgccgagcaatgatctcccgctggtactttgatgtgactgaagggaagtgtgccccattcttttacggcggatgtggcggcaaccggaacaactttgacacagaagagtactgcatggccgtgtgtggcagcgcca[seqidno:1]由app蛋白的外显子7的一个实施例编码的肽序列的长度为57个氨基酸，并且在本文中作为seqidno:2提供，如下所示：evcseqaetgpcramisrwyfdvtegkcapffyggcggnrnnfdteeycmavcgsam[seqidno:2]优选地，在另一个实施例中，所述反义寡核苷酸(aon)能够减少或防止外显子8包含到通过从淀粉样前体蛋白(app)转录物剪接而产生的appmrna中。优选地，因此，aon用于外显子8跳读以治疗、改善或预防神经退行性病症。人app基因的外显子8的一个实施例的核苷酸序列的长度为57个核苷酸，并且在本文中作为seqidno:3提供，如下所示：tgtcccaaagtttactcaagactacccaggaacctcttgcccgagatcctgttaaac[seqidno:3]由app蛋白的外显子8的一个实施例编码的肽序列的长度为20个氨基酸，并且在本文中作为seqidno:4提供，如下所示：msqsllkttqeplardpvkl[seqidno:4]本发明的发明人试图利用外显子跳读性aon的潜力作为解决如阿尔茨海默病等神经退行性病症的优良策略。所述方法利用对app的外显子7和/或8进行的跳读(根据app的典型命名法编号)。在最优选的实施例中，使用至少两种aon，第一种aon减少或防止外显子7包含到通过从app转录物剪接而产生的appmrna中，并且第二种aon减少或防止外显子8包含到appmrna中。在这种情况下，通过跳读外显子7和8制成的蛋白质优选地包括以下特征：1)外显子6与外显子9接合，从而维持读框并产生具有695个氨基酸的蛋白质，所述蛋白质在本文中被称为“app695”；2)外显子7内的库尼茨型蛋白酶抑制剂结构域(kpi)被去除；和/或3)外显子8内的与胸腺源性淋巴细胞的ox-2抗原共享同源性的结构域被去除。在与细胞分化状态、年龄、营养状态以及其它化学因素或生物学因素相关的因素的影响下，已知本文所利用的方法在绝大多数基因中天然存在。前mrna剪接也可以随意操纵，例如通过内源性剪接机构调节剪接位点选择。剪接位点选择可以例如使用aon来调节，所述aon干扰剪接机构的组件与剪接位点、所谓的分支点、多聚嘧啶段和/或影响剪接位点选择的区域的结合。这种区域被称为剪接增强子和剪接沉默子，所述剪接增强子和剪接沉默子可以位于外显子或内含子中。因此，存在内含子和外显子剪接位点增强子(ise和ese)和内含子或外显子剪接位点沉默子(iss和ess)。也可能以(半)定量方式来调节剪接。发明人已经对许多与位于外显子7和8内部的靶区域、以及桥接内含子6-7和外显子7的序列、桥接外显子7和内含子7-8的序列、桥接内含子7-8和外显子8的序列以及桥接外显子8和内含子8-9的序列结合的aon进行测试。应理解的是，内含子是根据其分开的外显子来命名的，即内含子6-7是位于外显子6与外显子7之间的内含子，内含子7-8是位于外显子7与外显子8之间的内含子，并且内含子8-9是位于外显子8与外显子9之间的内含子。优选地，因此，第一方面的aon能够与以下内的靶区域结合和/或互补：-(i)app基因的内含子6-7的3'部分和/或外显子7的5'部分；(ii)所述app基因的外显子7；(iii)所述app基因的外显子7的3'部分和/或内含子7-8的5'部分；(i)app基因；(ii)所述app基因的内含子7-8的3'部分和/或外显子8的5'部分；(iii)所述app基因的外显子8；和/或(iv)所述app基因的外显子8'的3'部分和/或内含子8-9的5'部分。在一个优选实施例中，aon与其互补靶区域具有至多4个或更少错配，优选地3个或更少，更优选地2个或更少，甚至更优选地1个或没有错配。在另外的优选实施例中，所述aon与所述靶区域中的至少8个核苷酸互补，优选地与所述靶区域中的8到50个核苷酸、更优选地12到50个核苷酸互补。在一个实施例中，所述aon的长度为18到42个核苷酸，优选地长度为22到42个核苷酸，更优选地长度为27到39个核苷酸。在所述反义寡核苷酸(aon)能够减少或防止外显子7包含到通过从app转录物剪接而产生的appmrna中(即，引起外显子7跳读)的一个实施例中，用于所述aon的所述靶区域位于内含子6/外显子7接合点上游150个核苷酸(-150)与外显子7/内含子7接合点下游150个核苷酸(+150)之间。用于aon的靶区域的一个实施例的核苷酸序列在本文中作为seqidno:27提供，如下所示(其中大写字母的碱基表示外显子7，并且小写字母碱基表示任一侧的内含子)：taaattcctcagtaaatgtttggtagatgctgcctaataaaccagtccaggttgccactgggaggattaaaagaagtaaacgtgtatacatgaacagagagacagtgccttttcatgctaaatgtggttccccacatctcctctgattagaggtgtgctctgaacaagccgagacggggccgtgccgagcaatgatctcccgctggtactttgatgtgactgaagggaagtgtgccccattcttttacggcggatgtggcggcaaccggaacaactttgacacagaagagtactgcatggccgtgtgtggcagcgccagtaagtggacccttcttcgagcctggccacctttcgtctctctcgccactgactctgctttttgtaacagattgattttcctggttcttgggaatgggcctgttgctaccactaaccacatttctgtccacttctctaattgctcagagt[seqidno:27]因此，优选地用于aon的靶区域的核苷酸序列基本上包括seqidno:27或其片段或变体。在优选的实施例中，所述aon靶区域跨越人app基因的外显子7上游15个核苷酸和下游150个核苷酸(-15到+50)，并表示为seqidno:5(如图2中所呈现的)。在一个实施例中，aon的核苷酸序列(称为“pmo7.1”)的长度为30个核苷酸，并且在本文中作为seqidno:6提供，如下所示：acggccccgtctcggcttgttcagagcaca[seqidno:6]在一个实施例中，aon的核苷酸序列(称为“pmo7.2”)的长度为30个核苷酸，并且在本文中作为seqidno:7提供，如下所示：cacacttcccttcagtcacatcaaagtacc[seqidno:7]在一个实施例中，aon的核苷酸序列(称为“pmo7.3”)的长度为30个核苷酸，并且在本文中作为seqidno:8提供，如下所示：ttgttccggttgccgccacatccgccgtaa[seqidno:8]在一个实施例中，aon的核苷酸序列(称为“pmo7.4”)的长度为30个核苷酸，并且在本文中作为seqidno:9提供，如下所示：acggccatgcagtactcttctgtgtcaaag[seqidno:9]在一个实施例中，aon的核苷酸序列(称为“pmo7.5”)的长度为30个核苷酸，并且在本文中作为seqidno:10提供，如下所示(其中大写字母的碱基表示外显子7靶向碱基，并且小写字母的碱基表示内含子靶向碱基)：caggctcgaagaagggtccacttactggcg[seqidno:10]因此，在特别优选的实施例中，所述aon与外显子7内或邻近于所述外显子的靶区域互补，并且包括选自由seqidno:6、7、8、9和10组成的组的核苷酸序列。在最优选的实施例中，aon包括选自seqidno:6、7、8和9的核苷酸序列。赋予外显子7跳读的最有效的aon是pmo7.2，并且因此seqidno:7是最优选的。因此，在本发明的又另一方面，提供了一种aon，所述aon能够减少或防止外显子7包含到通过从app转录物剪接而产生的appmrna中，其中所述aon能够与seqidno:5内的靶区域结合和/或互补，任选地其中所述aon包括选自seqidno:6、7、8、9或10的核苷酸序列。在另一个优选的方面，根据本发明的aon包括与seqidno:5的序列内的至少8个核苷酸互补的核苷酸序列，并且其中所述寡核苷酸包括seqidno:6、7、8、9或10的序列。在所述反义寡核苷酸(aon)能够减少或防止外显子8包含到通过从app转录物剪接而产生的appmrna中(即，引起外显子8跳读)的一个实施例中，用于所述aon的所述靶区域位于内含子7/外显子8接合点上游150个核苷酸(-150)与外显子8/内含子8接合点下游150个核苷酸(+150)之间。用于aon的靶区域的一个实施例的所述核苷酸序列在本文中作为seqidno:28提供，如下所示(其中大写字母的碱基表示外显子8，并且小写字母碱基表示任一侧的内含子)：atgttcattttggttttgttggagggaccaaacctaagtgagtgattttgtttgttaggttgtttttttgtcagtggactcgtgcatttcagccatcattcccatgtttctctttttgtttttagttatgttctcttattttttccatagtgtcccaaagtttactcaagactacccaggaacctcttgcccgagatcctgttaaacgtacgttgtcattcacctgagggaagggaagaggggaggaggatgctgcttggttcacataactccagcatcatcaccttctttgcatggttttgtgtttcttgaacacctgtcttagtaaaatgtttcttcccattaccttgcttgtaa[seqidno:28]因此，优选地用于aon的靶区域的核苷酸序列基本上包括seqidno:28或其片段或变体。在优选的实施例中，所述aon靶区域跨越人app基因的外显子8上游核苷酸50个核苷酸和下游50个核苷酸(-50到+50)，并表示为seqidno:11(如图2中所呈现的)。在一个实施例中，aon的核苷酸序列(称为“pmo8.1”)的长度为25个核苷酸，并且在本文中作为seqidno:12提供，如下所示(其中大写字母的碱基表示外显子8靶向碱基，并且小写字母的碱基表示内含子靶向碱基)：aaactttgggacactatggaaaaaa[seqidno:12]在一个实施例中，aon的核苷酸序列(称为“pmo8.2”)的长度为25个核苷酸，并且在本文中作为seqidno:13提供，如下所示：aagaggttcctgggtagtcttgagt[seqidno:13]在一个实施例中，aon的核苷酸序列(称为“pmo8.3”)的长度为25个核苷酸，并且在本文中作为seqidno:14提供，如下所示(其中大写字母的碱基表示外显子8靶向碱基，并且小写字母的碱基表示内含子靶向碱基)：acgtacgtttaacaggatctcgggc[seqidno:14]在一个实施例中，aon的核苷酸序列(称为“pmo8.4”)的长度为25个核苷酸，并且在本文中作为seqidno:15提供，如下所示：cttcccttccctcaggtgaatgaca[seqidno:15]因此，在特别优选的实施例中，aon与外显子8内或邻近于所述外显子的靶区域互补，并且包括选自由seqidno:12、13、14和15组成的组的核苷酸序列。在最优选的实施例中，aon包括选自seqidno:12和13的核苷酸序列。赋予外显子8跳读的最有效的aon是pmo8.2，并且因此seqidno:13是最优选的。因此，在本发明的又另一方面，提供了一种aon，所述aon能够减少或防止外显子8包含到通过从app转录物剪接而产生的appmrna中，其中所述aon能够与seqidno:11内的靶区域结合和/或互补，任选地其中所述aon包括选自seqidno:12、13、14或15的核苷酸序列。在另一个优选的方面，根据本发明的aon包括与seqidno:11的序列内的至少8个核苷酸互补的核苷酸序列，并且其中所述寡核苷酸包括seqidno:12、13、14或15的序列。在第五方面，提供了一种反义寡核苷酸(aon)，所述aon包括选自由以下组成的组的核苷酸序列：seqidno:6、7、8、9、10、12、13、14和15。当在治疗神经退行性病症的疗法中使用时，优选的是，将用于引起外显子7跳读的一个或多个aon与用于引起外显子8跳读的一个或多个aon组合使用。例如，优选地，已经示出引起外显子7跳读的包括选自由seqidno:6、7、8、9和10组成的组的核苷酸序列的aon中的任何一个aon可以与已经示出引起外显子8跳读的包括选自由seqidno:12、13、14或15组成的组的核苷酸序列的aon中的任何一个aon组合使用。最优选的外显子7跳读性aon是seqidno:7，并且最优选的外显子8跳读性aon是seqidno:13，并且因此这些最优选地彼此组合使用。在第六方面，本发明还提供了一种用于在通过从rna转录物剪接而产生人appmrna时，防止或减少外显子7和/或外显子8包含到所述mrna中的方法，所述方法包括在有利于由细胞摄取一个或多个aon的条件下，使根据本发明的一个或多个aon与这种细胞、包括这种细胞的体外或离体的组织或活的人类受试者接触，并且允许剪接发生。在第七方面，本发明还涉及一种用于制备内部截短的人app蛋白的方法，所述人app蛋白缺少由人app基因中的外显子7和/或外显子8编码的区域，所述方法包括在有利于摄取一个或多个aon的条件下，使根据本发明的一个或多个aon与表达所述人app基因的细胞接触，以允许所述app基因被表达，由此由所述细胞的剪接机构剪接app前mrna，从而产生其中不包含外显子7和/或外显子8的mrna，并且允许所述mrna转译成所述内部截短的人app蛋白。在优选的实施例中，第七方面的方法在受试者脑部中进行。在优选的实施例中，所述内部截短的人app蛋白是人app695。本发明允许设计具有可接受的rna结合动力学和/或热力学性质的寡核苷酸。rna结合动力学和/或热力学性质至少部分由寡核苷酸的解链温度(tm；使用基本tm和最近邻模型，用单链rna的寡核苷酸性质计算器(www.unc.edu/～cail/biotool/oligo/index.html)计算)和/或aon靶外显子复合物的自由能(使用rna结构版本4.5)确定。如果tm太高，则预期寡核苷酸的特异性较低。可接受的tm和自由能取决于寡核苷酸的序列、主链的化学性质(磷酸二酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、肽-核酸等)、糖部分(核糖、脱氧核糖、经过取代的核糖、内部分子桥)的性质以及核碱基的化学修饰。因此，tm的范围可以广泛变化。优选地，aon使外显子跳读率为至少50％、60％、70％或80％。更优选地，aon使外显子跳读率为至少90％、95％、97％、98％、99％或100％。对于任何给定的引物集合，在给定数量的pcr循环后，可以通过测定所有扩增带的浓度除以缩短的(不含外显子7和/或外显子8)扩增带的浓度乘以100％来计算外显子跳读百分比或效率，条件是循环数量使得扩增仍处于指数阶段。可以使用安捷伦(agilent)2100生物分析仪结合dna1000试剂盒进行定量，尽管技术人员将理解可以使用的其它标准方法。优选地，本发明的包括与seqidno:5(外显子7)或11(外显子8)所示的核苷酸靶区域互补的序列的aon使得互补部分与靶序列至少约80％、更优选地至少约90％、仍更优选地至少约95％、甚至更优选地至少约98％、并且最优选地约100％互补。因此，并非绝对必需的是互补区域中的所有碱基都能够与相对链中的碱基配对。例如，当设计寡核苷酸时，人们可能想要掺入不与互补链上的碱基进行碱基配对的残基。如果在细胞中的情况下，核苷酸的延伸段足以能够与互补部分杂交，则可以在某种程度上允许错配。在此上下文中，“足以”可以意指根据本发明的aon能够诱导外显子7和/或外显子8的外显子跳读。跳读所靶向外显子可以方便地通过pcr/生物分析仪(任选地ddpcr)进行评估。互补区域被优选地设计成使得当组合时，所述互补区域对前mrna中的外显子具有特异性。这种特异性可以用各种长度的互补区域产生，因为这取决于系统中其它(前)mrna分子中的实际序列。寡核苷酸还将能够与一个或多个其它前mrna分子杂交的风险会随着寡核苷酸大小的增加而降低，同时长度不应太长，以免产生可制造性、纯化和/或分析方面的问题。清楚的是，可以在本发明中使用在互补区域中包括错配但保留与前mrna中的一个或多个所靶向区域杂交和/或结合的能力的寡核苷酸。然而，优选地，至少互补部分不包括这种错配，因为这些通常比在一个或多个互补区域中具有这种错配的寡核苷酸具有更高的效率和更高的特异性。认为较高的杂交强度(即增加与相对链的相互作用的数量)有利于增加干扰系统的剪接机构的方法的效率。优选地，互补性为90％到100％。通常，这允许在20个核苷酸的寡核苷酸中的1或2个错配，并且允许在50个核苷酸的aon中的5个或更少错配。根据本发明的aon可以比靶上的具有非碱基配对端或“突出”末端的互补区域更长。优选的是，这种可以在5'位点或3'位点或两者上的“突出”应保持最小，因为aon端的非互补碱基可以降低aon与靶结合的特异性和/或结合强度。优选地，寡核苷酸的互补部分的长度与寡核苷酸的长度相同，这意味着不存在不与靶na形成碱基对的寡核苷酸的5'或3'端。因此，用于本发明的寡核苷酸的优选长度是50个核苷酸或更少，例如12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个或48个核苷酸。已经用长度为20到35个核苷酸、更具体地长度为25或30个核苷酸的aon获得了特别好的结果。根据本发明的外显子跳读性aon可以含有一个或多个dna核苷酸(因此，rna“u”残基将为作为dna对应物的“t”残基)，但是理想地不仅仅由dna核苷酸组成(由于效果差或没有效果)。出于外显子跳读的目的，优选rna寡核苷酸(包含经过修饰的rna)。apprna的总敲除尚未在人类中进行测试，并且可能与严重的副作用相关。因此，根据本发明，强烈优选不引起显著，更不用说总的apprna敲低的外显子跳读性aon。根据本发明，针对破坏的sirna、调用rnaseh介导的分解的所谓“缺口体(gapmer)”或引起app的整体敲除的任何其它aon不是优选的。优选的是，本发明的外显子跳读性aon包括一个或多个核苷酸，所述一个或多个核苷酸被修饰以增加核酸酶抗性和/或增加aon对靶序列的亲和力。因此，在优选的实施例中，aon序列包括至少一种核苷酸类似物或等同物，其中核苷酸类似物或等同物被定义为具有经过修饰的碱基和/或经过修饰的主链和/或非天然核苷间键或这些修饰的组合的残基。优选的aon是寡核糖核苷酸，并且理想地，这些具有(优选地用硫代磷酸酯键)化学修饰的核苷间键。核糖的修饰也是有用的，例如用2'-o-烷基修饰(理想地是2'-o-甲基)。在优选的实施例中，核苷酸类似物或等同物包括经过修饰的主链。这种主链的实例是由吗啉代主链、氨基甲酸酯主链、硅氧烷主链、硫化物、亚砜和砜主链、甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)主链、亚甲基甲乙酰基主链、核糖乙酰基主链、含烯烃主链、氨基磺酸酯、磺酸酯和磺酰胺主链、亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链以及酰胺主链。磷酸二酰胺吗啉代寡聚体是先前已经作为反义剂研究的经过修饰的主链寡核苷酸。也设想了三环dna和肽缀合的主链。吗啉代寡核苷酸具有不带电荷的主链，其中dna的脱氧核糖被六元环替代，并且磷酸二酯键被磷酸二酰胺键替代。吗啉代寡核苷酸对酶促降解具有抗性，并且通过阻止转译或干扰前mrna剪接而不是通过活化rnaseh而表现出作为反义剂起作用。吗啉代寡核苷酸已经通过物理破坏细胞膜的方法成功地递送到组织培养细胞，并且一项对这些方法中的若干方法进行比较的研究发现划痕负载是最有效的递送方法。然而，因为吗啉代主链不带电荷，因此阳离子脂质不是细胞中吗啉代寡核苷酸摄取的有效介体。根据本发明的一个实施例，主链中残基之间的键不包含磷原子，如由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子核苷间键或杂环核苷间键形成的键。根据此实施例，优选的核苷酸类似物或等同物包括具有经过修饰的聚酰胺主链的肽核酸(pna)[29]。就碱基对识别而言，基于pna的分子是dna分子的真实模拟。pna的主链由通过肽键连接的n-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成，其中核碱基通过亚甲基羰基键与主链连接。替代性主链包括单碳延伸的吡咯烷pna单体[30]。由于pna分子的主链不含有带电荷的磷酸基团，因此pna-na杂交体通常分别比rna-rna或rna-dna杂交体更稳定[31]。根据本发明的另一个实施例，主链包括吗啉代核苷酸类似物或等同物，其中核糖或脱氧核糖被6-元吗啉代环替代。最优选的核苷酸类似物或等同物包括磷酸二酰胺吗啉代寡聚体(pmo)，其中核糖或脱氧核糖被6-元吗啉代环替代，并且邻近的吗啉代环之间的阴离子磷酸二酯键被非离子磷酸二酰胺键替代。在又进一步的实施例中，本发明的核苷酸类似物或等同物包括磷酸二酯键中的非桥接氧之一的取代。此修饰稍微使碱基配对不稳定，但会增加对核酸酶降解的显著抗性。优选的核苷酸类似物或等同物包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、h-膦酸酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包含3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、磷酰胺酯(包含3'-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯)、硫代羰基磷酰胺酯、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯或硼烷磷酸酯。本发明的进一步优选的核苷酸类似物或等同物包括一个或多个在2'、3'和/或5'位置处被单或二取代的糖部分，如-oh；-f；可以被一个或多个杂原子中断的经过取代或未经取代的、直链或支链低级(c1-c10)烷基、烯基、炔基、烷烃基、烯丙基或芳烷基；o-、s-、或n-烷基；o-、s-或n-烯基；o-、s-或n-炔基；o-、s-或n-烯丙基；o-烷基-o-烷基、-甲氧基、-氨基丙氧基；甲氧基乙氧基；-二甲基氨基氧基乙氧基；以及-二甲基氨基乙氧基乙氧基。糖部分可以是呋喃糖或其衍生物、或脱氧呋喃糖或其衍生物，优选地核糖或其衍生物、或脱氧核糖或其衍生物。优选的衍生糖部分包括锁核酸(lna)，其中2'-碳原子与糖环的3'或4'碳原子连接，从而形成二环糖部分。优选的lna包括2'-o,4'-c-乙烯桥接的核酸[32]。这些取代使核苷酸类似物或等同物rnaseh和核酸酶具有抗性，并增加了对靶rna的亲和力。本领域技术人员将理解，不必修饰aon中的所有核苷间键。例如，一些核苷间键可能未被修饰，而其它核苷间键则被修饰。包括由一种形式的(修饰的)核苷间键、多种形式的沿着aon的长度均匀或不均匀分布的(修饰的)核苷间键组成的主链的aon均被本发明涵盖。另外，主链修饰的任何形式(均匀、不均匀、单形式或多形式以及其所有排列)可以与以下提及的任何形式的糖或核苷修饰或类似物组合。根据本发明的aon的特别优选的主链是均匀的(全部)硫代磷酸酯(ps)主链。在另一个实施例中，本发明的核苷酸类似物或等同物包括一个或多个碱基修饰或取代。经过修饰的碱基包括合成碱基和天然碱基，如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤和其它的-氮杂、脱氮杂、-羟基、-卤代、-硫代、硫醇、-烷基、-烯基、-炔基、本领域已知或将已知的嘧啶硫代烷基衍生物和嘌呤碱基。本领域技术人员将理解，不必均匀地修饰aon中的所有位置。另外，可以在单个aon中或甚至在aon内的单个位置处渗入上述类似物或等同物中的多于一种类似物和等同物。在某些实施例中，本发明的aon具有至少两种不同类型的类似物或等同物。根据另一个实施例，根据本发明的aon包括2'-o(优选地低级)烷基硫代磷酸酯aon，如2'-o-甲基修饰的核糖(rna)、2'-o-甲氧基乙基修饰的核糖、2'-o-乙基修饰的核糖、2'-o-丙基修饰的核糖和/或这些修饰的取代衍生物，如卤化衍生物。根据本发明的有效且优选的aon形式包括具有硫代磷酸酯主链的2'-o-甲基修饰的核糖部分，优选地其中基本上所有核糖部分都是2'-o-甲基，并且基本上所有核苷间键是硫代磷酸酯键。本领域技术人员还将理解，可以组合不同的aon以有效地跳读app基因的外显子7和/或外显子8。可以在本发明的方法中使用两个aon的组合，如靶向外显子7和外显子8的相同或不同靶区域(参见图2)的两个aon、三个不同的aon、四个不同的aon或五个不同的aon，只要至少一个aon是根据本发明的一个aon。aon可以与增强aon在细胞(优选地脑部细胞)中的摄取的部分连接。这种部分的实例是胆固醇、碳水化合物、维生素、生物素、脂质、磷脂、细胞穿透性肽(包含但不限于触角足、tat、转运素和带正电荷的氨基酸(如寡聚精氨酸、聚精氨酸、寡聚赖氨酸或聚赖氨酸、抗原结合结构域(如由抗体提供的结构域、抗体的fab片段或单链抗原结合结构域(如骆驼科单结构域抗原结合结构域或scfv)。根据本发明的外显子跳读性aon可以是裸的(裸露的(gymnotic))aon、或呈缀合物、纳米颗粒的形式或由载体(载体化aon)表达。可以使用本领域已知的合适的方法施用外显子跳读性aon。当外显子跳读性aon是载体化aon时，所述外显子跳读可以例如以表达载体的形式提供给个体或所述个体的细胞、组织或器官，其中表达载体对包括所述aon的转录物进行编码。优选地通过如病毒载体等基因递送媒剂将表达载体引入到细胞、组织、器官或个体中。在优选的实施例中，提供了一种基于病毒的表达载体，所述基于病毒的表达载体包括表达盒或转录盒，所述表达盒或转录盒驱动如本文所标识的外显子跳读性aon的表达或转录。因此，本发明提供了一种病毒载体，当置于有利于表达外显子跳读性aon的条件下时，所述病毒载体表达根据本发明的外显子跳读性aon。可以向细胞提供外显子跳读性aon，所述外显子跳读性aon能够干扰外显子7和/或外显子8包含所必需的或至少有助于所述包含的序列，使得这种干扰防止或至少减少外显子7/8包含到appmrna中，例如通过质粒源性aon表达或由腺病毒或基于腺相关病毒的载体提供的病毒表达。表达可以由如ul、u6或u7rna启动子等聚合酶iii启动子驱动。优选的递送媒剂是病毒载体，如腺相关病毒载体(aav)或逆转录病毒载体，如慢病毒载体等。而且，质粒、人工染色体、可用于在细胞的哺乳动物(优选地人类)基因组中进行靶向同源重组和整合的质粒可以合适地适用于递送如本文所定义的aon。对于本发明而言优选的是，其中由pol-ill启动子驱动转录和/或其中转录物呈与ul转录物或u7转录物融合的形式的那些载体，所述载体产生递送小转录物的良好结果。设计合适的转录物在技术人员的技术范围内。优选的是pol-ill驱动的转录物。优选地，采用具有ul转录物或u7转录物的融合转录物的形式。这种融合可以如本领域中所描述的产生[33，34]。一种优选的aon表达系统是基于腺相关病毒(aav)的载体。已经开发了可以用于aon序列的延长的表达的基于单链和双链aav的载体，以高效地跳读app外显子17。优选的基于aav的载体例如包括由聚合酶ill-启动子(poliii)驱动的表达盒。优选的poliii启动子是例如ul启动子、u6启动子或u7rna启动子。因此，本发明还提供了一种基于病毒的载体，所述基于病毒的载体包括用于表达本发明的aon的polill启动子驱动的表达盒，以诱导app外显子7和/或外显子8的跳读。根据本发明的aav载体是重组aav载体，并且是指包括aav基因组的一部分的aav载体，所述avv基因组包括根据本发明的经过编码的外显子跳读性aon，所述外显子跳读性aon被衣壳化在源自aav血清型的衣壳蛋白的蛋白壳中，如本文在其它地方所描绘的。aav基因组的一部分可以含有源自腺相关病毒血清型(如aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav8、aav9等)的反向末端重复序列(itr)。包含衣壳蛋白的蛋白壳可以源自aav血清型，如aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav8、aav9等。蛋白壳也可以称为衣壳蛋白壳。aav载体可以具有一个或优选地所有缺失的野生型aav基因，但仍可以包括功能itr核酸序列。功能itr序列对于aav病毒体的复制、挽救和包装是必需的。itr序列可以是野生型序列，或者可以与野生型序列具有至少80％、85％、90％、95或100％的序列同一性，或者可以通过例如核苷酸的插入、突变、缺失或取代来改变，只要其保持起作用即可。在此上下文中，功能性是指将基因组直接包装到衣壳中并且然后允许在待感染的宿主细胞或靶细胞中表达的能力。在本发明的上下文中，衣壳蛋白壳可以具有与aav载体基因组itr不同的血清型。因此，根据本发明的aav载体可以由衣壳蛋白壳，即包括一种aav血清型(例如，aav血清型2)的衣壳蛋白(vp1、vp2、和/或vp3)的二十面体衣壳构成，而所述aav5载体中含有的itr序列可以是以上所描述的aav血清型中的任何aav血清型，包含aav2载体。因此，“aav2载体”包括aav血清型2的衣壳蛋白壳，而例如“aav5载体”包括aav血清型5的衣壳蛋白壳，由此任一个可以衣壳化根据本发明的任何aav载体基因组itr。优选地，根据本发明的重组aav载体包括aav血清型2、5、8或aav血清型9的衣壳蛋白壳，其中存在于所述aav载体中的aav基因组或itr源自aav血清型2、5、8或aav血清型9；这种aav载体分别被称为aav2/2载体、aav2/5载体、aav2/8载体、aav2/9载体、aav5/2载体、aav5/5载体、aav5/8载体、aav5/9载体、aav8/2载体、aav8/5载体、aav8/8载体、aav8/9载体、aav9/2载体、aav9/5载体、aav9/8载体或aav9/9载体。更优选地，根据本发明的重组aav载体对神经元细胞具有向性，并且包括aav血清型(包含血清型1、2、5、7和8)的衣壳蛋白壳。存在于所述载体中的aav基因组或it可以源自相同或不同的血清型，如aav血清型2；这种载体被称为例如aav2/8载体或aav2/9载体。最近，据报道aav9对灵长类动物脑部中的神经元细胞具有极好的向性[35]。因此，本发明提供了用于将aon表达性构建体递送到ad患者脑部中的神经元细胞的重组aav载体，所述重组aav载体包括血清型1、2、5、7、8和9，包含具有类似向性的嵌合raav载体。为了提高特异性并降低毒性，可以选择细胞类型特异性启动子，相对于神经胶质或少突胶质细胞表达，所述细胞类型特异性启动子更利于例如神经元表达。各种递送方法(包含心室内、鞘内、实质内、鼻内以及全身性，包含静脉内、皮下递送方法)都是本发明所设想的。已经在临床研究中获得了特别好的结果，其中通过鞘内注射向患者给药aon。鞘内注射后，aon行进到脑部，其在所述脑部中扩散到脑部的各个区域中，随后被各种细胞类型摄取。据报道，一种增强成年人神经元表达的方法是使用甘露醇来放松血脑屏障以允许载体进入到cns中[36]。根据本发明，由所选择的核酸序列表示的对外显子跳读性aon进行编码的核酸分子优选地插入如以上所标识的aav基因组或itr序列之间，例如包括可操作地连接到编码序列和3'末端序列的表达调节元件的表达构建体。“aav辅助功能”通常是指aav复制和反式供应到aav载体的包装所需的对应的aav功能。aav辅助功能补充了aav载体中丢失的aav功能，但其缺少aavitr(由aav载体基因组提供)。aav辅助功能包含aav的两个主要orf，即rep编码区域和cap编码区域或其功能基本上相同的序列。rep区域和cap区域是本领域中众所周知的[37]。可以在aav辅助构建体上供应aav辅助功能，所述aav辅助构建体可以是质粒。辅助构建体向宿主细胞的引入可以在引入如本文所标识的aav载体中存在的aav基因组之前或同时进行，例如通过转化、转染或转导。因此，可以选择本发明的aav辅助构建体，使得其一方面产生用于aav载体的衣壳蛋白壳的期望的血清型组合，并且另一方面产生用于所述aav载体复制和包装中存在的aav基因组的期望的血清型组合。“aav辅助病毒”提供aav复制和包装所需的另外的功能。合适的aav辅助病毒包含腺病毒、单纯疱疹病毒(如1型和2型hsv)和牛痘病毒。如us6,531,456(通过引用并入本文)中所描述的，由辅助病毒提供的另外的功能也可以通过载体引入到宿主细胞中。优选地，如存在于根据本发明的重组aav载体中的aav基因组不包括任何对病毒蛋白进行编码的核苷酸序列，如aav的rep(复制)基因或cap(衣壳)基因。aav基因组可以进一步包括标志基因或报告基因，如本领域已知的例如对抗生素抗性基因进行编码的基因、荧光蛋白(例如，gfp)或对化学、酶促或以其它方式可检测和/或可选择的产物进行编码的基因(例如，lacz、aph等)。水溶液中裸露的aon很容易被体内的大多数细胞吸收，并且通常将根据本发明的aon溶于等渗(盐)溶液中将足以到达靶细胞，如人类脑部中的神经元细胞。可替代地，可以使用药学上可接受的赋形剂、添加剂、稳定剂等来调配本发明的裸露的aon。裸露的aon也可以用以下提及的转染助剂中的任何转染助剂进行调配。外显子7而不是外显子8的跳读在体内发生。然而，参考图5a和5b，令人惊讶地产生了对应于包含外显子8但不包含外显子7的appmrna的新颖产物。因为迄今为止还没有在体内发现mrna，此mrna先前没有被描述过，并且很可能对应于非生理变体。人淀粉样前体蛋白(app)基因的包含外显子8但不包括外显子7的新颖appmrna的一个实施例的核苷酸序列的长度为2145个核苷酸，并且在本文中作为seqidno:21提供，如下所示：atgctgcccggtttggcactgctcctgctggccgcctggacggctcgggcgctggaggtacccactgatggtaatgctggcctgctggctgaaccccagattgccatgttctgtggcagactgaacatgcacatgaatgtccagaatgggaagtgggattcagatccatcagggaccaaaacctgcattgataccaaggaaggcatcctgcagtattgccaagaagtctaccctgaactgcagatcaccaatgtggtagaagccaaccaaccagtgaccatccagaactggtgcaagcggggccgcaagcagtgcaagacccatccccactttgtgattccctaccgctgcttagttggtgagtttgtaagtgatgcccttctcgttcctgacaagtgcaaattcttacaccaggagaggatggatgtttgcgaaactcatcttcactggcacaccgtcgccaaagagacatgcagtgagaagagtaccaacttgcatgactacggcatgttgctgccctgcggaattgacaagttccgaggggtagagtttgtgtgttgcccactggctgaagaaagtgacaatgtggattctgctgatgcggaggaggatgactcggatgtctggtggggcggagcagacacagactatgcagatgggagtgaagacaaagtagtagaagtagcagaggaggaagaagtggctgaggtggaagaagaagaagccgatgatgacgaggacgatgaggatggtgatgaggtagaggaagaggctgaggaaccctacgaagaagccacagagagaaccaccagcattgccaccaccaccaccaccaccacagagtctgtggaagaggtggttcgagtgtcccaaagtttactcaagactacccaggaacctcttgcccgagatcctgttaaacttcctacaacagcagccagtacccctgatgccgttgacaagtatctcgagacacctggggatgagaatgaacatgcccatttccagaaagccaaagagaggcttgaggccaagcaccgagagagaatgtcccaggtcatgagagaatgggaagaggcagaacgtcaagcaaagaacttgcctaaagctgataagaaggcagttatccagcatttccaggagaaagtggaatctttggaacaggaagcagccaacgagagacagcagctggtggagacacacatggccagagtggaagccatgctcaatgaccgccgccgcctggccctggagaactacatcaccgctctgcaggctgttcctcctcggcctcgtcacgtgttcaatatgctaaagaagtatgtccgcgcagaacagaaggacagacagcacaccctaaagcatttcgagcatgtgcgcatggtggatcccaagaaagccgctcagatccggtcccaggttatgacacacctccgtgtgatttatgagcgcatgaatcagtctctctccctgctctacaacgtgcctgcagtggccgaggagattcaggatgaagttgatgagctgcttcagaaagagcaaaactattcagatgacgtcttggccaacatgattagtgaaccaaggatcagttacggaaacgatgctctcatgccatctttgaccgaaacgaaaaccaccgtggagctccttcccgtgaatggagagttcagcctggacgatctccagccgtggcattcttttggggctgactctgtgccagccaacacagaaaacgaagttgagcctgttgatgcccgccctgctgccgaccgaggactgaccactcgaccaggttctgggttgacaaatatcaagacggaggagatctctgaagtgaagatggatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcgacagtgatcgtcatcaccttggtgatgctgaagaagaaacagtacacatccattcatcatggtgtggtggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgccacctgtccaagatgcagcagaacggctacgaaaatccaacctacaagttctttgagcagatgcagaactag[seqidno:21]由人淀粉样前体蛋白(app)基因的包含外显子8但不包括外显子7的新颖appmrna的一个实施例编码的肽序列的长度为714个氨基酸，并且在本文中作为seqidno:22提供，如下所示：mlpglallllaawtaralevptdgnagllaepqiamfcgrlnmhmnvqngkwdsdpsgtktcidtkegilqycqevypelqitnvveanqpvtiqnwckrgrkqckthphfvipyrclvgefvsdallvpdkckflhqermdvcethlhwhtvaketcsekstnlhdygmllpcgidkfrgvefvccplaeesdnvdsadaeeddsdvwwggadtdyadgsedkvvevaeeeevaeveeeeadddeddedgdeveeeaeepyeeaterttsiatttttttesveevvrvsqsllkttqeplardpvklpttaastpdavdkyletpgdenehahfqkakerleakhrermsqvmreweeaerqaknlpkadkkaviqhfqekvesleqeaanerqqlvethmarveamlndrrrlalenyitalqavpprprhvfnmlkkyvraeqkdrqhtlkhfehvrmvdpkkaaqirsqvmthlrviyermnqslsllynvpavaeeiqdevdellqkeqnysddvlanmiseprisygndalmpsltetkttvellpvngefslddlqpwhsfgadsvpantenevepvdarpaadrglttrpgsgltnikteeisevkmdaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvviatvivitlvmlkkkqytsihhgvvevdaavtpeerhlskmqqngyenptykffeqmqn[seqidno:22]因此，根据本发明的另一方面，提供了一种分离的人app多肽，所述分离的人app多肽包括基本上如seqidno:22中所示的氨基酸序列或其变体或片段。在另外的方面，提供了一种用于在疗法中使用的分离的人app多肽，所述分离的人app多肽包括基本上如seqidno:22中所示的氨基酸序列或其变体或片段。在又另一方面，提供了一种用于治疗、预防或改善神经退行性病症，优选地阿尔茨海默病的分离的人app多肽，所述分离的人app多肽包括基本上如seqidno:22中所示的氨基酸序列或其变体或片段。分离的人app多肽优选地由基本上如seqidno:21所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。应当理解，根据本发明的反义寡核苷酸(aon)可以用于可以在单一疗法(即，第一方面的aon的用途)中使用的药物中，以治疗、改善或预防如阿尔茨海默病等神经退行性病症。发明人认为靶向外显子7以进行跳读可能也足以跳读8。然而，如以上所讨论的，优选的是，至少一个用于诱导外显子7跳读的aon与至少一个用于诱导外显子8跳读的aon组合使用。可替代地，根据本发明的aon可以用作用于治疗、改善或预防神经退行性病症(例如，阿尔茨海默病)的已知疗法的辅助或与所述已知疗法组合使用，如其它乙酰胆碱酯酶抑制剂。根据本发明的aon可以组合在具有多种不同形式的组合物中，具体地取决于使用组合物的方式。因此，例如，组合物可以呈粉末、片剂、胶囊、液体、软膏、乳膏、凝胶、水凝胶、气溶胶、喷雾剂、胶束溶液、透皮贴剂、脂质体混悬液的形式或可以向需要治疗的人或动物施用的任何其它合适的形式。应当理解，根据本发明的药物的媒剂应该是被施用药物的受试者能够良好耐受的媒剂，并且优选地实现aon跨血脑屏障的递送。可以以多种方式使用包括根据本发明的aon的药物。例如，可能需要口服施用，在这种情况下，aon可以包含在可以例如以片剂、胶囊或液体的形式口服摄取的组合物内。施用aon的替代性选项将是使用鼻腔喷雾剂，因为通过鼻腔喷雾剂进行的施用比口服或静脉内施用方式更快且更有效地到达脑部(参见http://memoryzine.com/2010/07/26/nose-sprays-cross-blood-brain-barrier-faster-and-safer/)。因此，包括本发明的aon的组合物可以通过吸入(例如，鼻内)施用。也可以调配用于局部使用的组合物。例如，可以将乳膏或软膏涂覆于例如邻近于脑部的皮肤。也可以将根据本发明的aon掺入慢速或延迟释放装置内。这种装置可以例如插入皮肤上或皮肤下，并且药物可以在数周或甚至数月内释放。所述装置可以至少位于治疗位点附近，例如头部和脑部。当需要用根据本发明的至少一个反义寡核苷酸(aon)进行长期治疗并且通常需要频繁施用(例如，至少每日注射)时，这种装置可能是特别有利的。在另一个实施例中，鞘内施用aon是优选的。在优选的实施例中，根据本发明的药物可以通过注射到血流中或直接注射到需要治疗的位点而施用于受试者。例如，可以至少在脑部附近注射药物。注射可以是静脉内(推注或输注)或皮下(推注或输注)或皮内(推注或输注)。应当理解，所需aon的量由其生物活性和生物利用度、aon的生理化学性质以及其是用作单一疗法还是用于组合疗法决定，所述生物活性和生物利用度进而取决于施用模式。施用频率也将受到所治疗受试者内aon的半衰期的影响。如实例2中所描述的，发明人研究了可以用于引起外显子跳读的aon的有效量。如图6所示出的，发明人研究了外显子7跳读性aon之一(即pmo7.2)和外显子8跳读性aon之一(即pmo8.2)的有效剂量。优选地，施用至少50nm、更优选地至少100nm、甚至更优选地至少150nm、并且仍更优选地至少200nm、并且又更优选地至少250nm的引起外显子7跳读的aon。优选地，施用小于3000nm、更优选地小于2000nm、并且仍更优选地小于1000nm，并且甚至更优选地小于750nm的引起外显子7跳读的aon。优选地，引起外显子7跳读的aon是seqidno:7(pmo7.2)。优选地，施用至少100nm、更优选地至少200nm、甚至更优选地至少300nm、并且仍更优选地至少400nm、并且又更优选地至少500nm的引起外显子8跳读的aon。优选地，施用小于3000nm、更优选地小于2000nm、并且仍更优选地小于1000nm，并且甚至更优选地小于750nm的引起外显子8跳读的aon。优选地，引起外显子8跳读的aon是seqidno:13(pmo8.2)。优选地，施用至少500nm的每个aon。待施用的最佳剂量可以由本领域的技术人员确定，并且将随使用的特定aon、药物组合物的强度、施用模式和神经退行性疾病的进展而变化。取决于所治疗的特定受试者的另外的因素将导致需要对剂量进行调整，所述其它因素包含受试者年龄、体重、性别、饮食和施用时间。通常，根据本发明的aon的介于0.001μg/kg体重与10mg/kg体重之间的每日剂量可以用于治疗、改善或预防神经退行性疾病，这取决于所使用的反义寡核苷酸(aon)。更优选地，每日剂量介于0.01μg/kg体重与1mg/kg体重之间，并且更优选地介于大约0.1μg/kg与10μg/kg体重之间。可以在神经退行性疾病发作之前、期间或之后施用aon。每日剂量可以作为单次施用给药(例如，每日一次注射或鼻腔喷雾剂的吸入)。可替代地，可能需要在一天内施用两次或更多次aon。作为实例，至少一个反义寡核苷酸(aon)可以作为两个(或更多个，取决于所治疗神经退行性疾病的严重程度)介于0.07μg与700mg之间(即假设体重为70kg)的每日剂量施用。接受治疗的患者可以在醒来时服用第一剂量，并且然后在晚上服用第二剂量(如果在两剂量方案下)或之后以3或4小时的间隔服用。可替代地，可以使用缓释装置向患者提供根据本发明的最佳剂量的反义寡核苷酸(aon)，而无需施用重复剂量。可以使用如制药工业常规采用的程序等已知程序(例如，体内实验、临床试验等)来形成根据本发明的一个或多个aon的具体调配物和精确的治疗方案(如药剂的每日剂量和施用频率)。发明人认为，基于本发明的反义寡核苷酸(aon)的使用，他们是提出抗神经退行性疾病组合物的第一人。因此，在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的根据第一方面所述的反义寡核苷酸(aon)以及任选地药学上可接受的媒剂。药物组合物优选地是抗神经退行性疾病组合物，即用于治疗性改善、预防或治疗受试者的如阿尔茨海默病等神经退行性病症的药物调配物。在第九方面，本发明也提供了一种用于制备根据第八方面所述的药物组合物的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据第一方面所述的反义寡核苷酸(aon)与药学上可接受的媒剂组合。在特别优选的实施例中，所述aon与外显子7内或邻近于所述外显子的靶区域互补，并且选自由seqidno:6、7、8、9和10组成的组。因此，在特别优选的实施例中，aon与外显子8内或邻近于所述外显子的靶区域互补，并且选自由seqidno:12、13、14和15组成的组。优选地，所述组合物包括将用于引起外显子7跳读的一个或多个aon与用于引起外显子8跳读的一个或多个aon组合。例如，优选地，已经示出引起外显子7跳读的选自由seqidno:6、7、8、9和10组成的组的aon中的任何一个aon可以用于与已经示出引起外显子8跳读的选自由seqidno:12、13、14或15组成的组的aon中的任何一个aon组合使用。最优选的外显子7跳读性aon是seqidno:7，并且最优选的外显子8跳读性aon是seqidno:13，并且因此这些最优选地在第八方面所述的组合物中彼此组合使用。“受试者”可以是脊椎动物、哺乳动物或家畜。因此，根据本发明的药物可以用于治疗任何哺乳动物，例如家畜(例如，马)、宠物或可以用于其它兽医应用。然而，最优选地，受试者是人。aon的“治疗有效量”是任何量，当施用于受试者时，所述任何量是治疗神经退行性病症状况或产生所期望效果所需的活性剂的量。例如，所使用的aon的治疗有效量可以为约0.001mg到约800mg，并且优选地为约0.01mg到约500mg。优选的是，反义寡核苷酸(aon)的量为约0.1mg到约100mg。本文提及的“药学上可接受的媒剂”是本领域技术人员已知的任何已知化合物或已知化合物的组合，其可以用于调配药物组合物。在一个实施例中，药学上可接受的媒剂可以是固体，并且组合物可以呈粉末或片剂的形式。固体的药学上可接受的媒剂可以包含一种或多种物质，所述物质也可以充当调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、染料、填充剂、助流剂、压缩助剂、惰性粘合剂、甜味剂、防腐剂、涂料或片剂崩解剂。媒剂也可以是包封材料。在粉末中，媒剂是与根据本发明的细碎活性剂混合的细碎的固体。在片剂中，活性剂(即，至少一个反义寡核苷酸(aon))可以与具有必要压缩性质的媒剂以合适的比例混合，并以期望的形状和大小进行压实。粉末和片剂优选含有高达99％的活性剂。合适的固体媒剂包含例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡和离子交换树脂。在另一个实施例中，药物媒剂可以是凝胶，并且组合物可以呈乳膏等形式。然而，药物媒剂可以是液体，并且药物组合物呈溶液的形式。液体媒剂用于制备溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂和加压组合物。根据本发明的活性剂(aon)可以溶解或悬浮在药学上可接受的液体媒剂中，如水、有机溶剂、两者的混合物或药学上可接受的油或脂肪。液体媒剂可以含有其它合适的药物添加剂，如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透调节剂。用于口服和肠胃外施用的液体媒剂的合适实例包含水(部分含有如上所述的添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包含一元醇和多元醇，例如二醇)及其衍生物和油(例如，分馏椰子油和花生油)。对于肠胃外施用，媒剂也可以是油性酯，如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体媒剂在用于肠胃外施用的无菌液体形式组合物中是有用的。用于加压组合物的液体媒剂可以是卤代烃或其它药学上可接受的推进剂。可以通过例如肌肉内、鞘内、硬膜外、腹膜内、静脉内和特别是皮下注射来使用作为无菌溶液或悬浮液的液体药物组合物。可以将一个或多个aon制备成无菌固体组合物，其可以在施用时使用无菌水、盐水或其它合适的无菌可注射介质进行溶解或悬浮。可以以含有其它溶质或悬浮剂(例如，足够的盐水或葡萄糖以使溶液等渗)、胆汁盐、阿拉伯胶、明胶、脱水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨醇酯80(山梨糖醇的油酸酯及其与环氧乙烷共聚的酸酐)等的无菌溶液或悬浮液的形式口服施用本发明的至少一个反义寡核苷酸(aon)和组合物。也可以以液体或固体组合物的形式口服施用根据本发明所使用的至少一个反义寡核苷酸(aon)。适于口服施用的组合物包含固体形式(如丸剂、胶囊、颗粒、片剂和粉末)和液体形式(如溶液、糖浆、酏剂和悬浮液)。可用于肠胃外施用的形式包含无菌溶液、乳液和悬浮液。发明人设想使用如crispr等基因组编辑工具对本文所描述的靶序列进行修饰以及在剪接受体和剪接供体位点处引入插入/缺失，以模拟使用本文所描述的aon所表现出的结果。在另一方面，提供了一种用于制备内部截短的人app蛋白的方法，所述人app蛋白缺少由人app基因中的外显子7和/或外显子8编码的区域，所述方法包括：-(i)从内源性app编码序列中缺失外显子7和/或外显子8，(ii)用缺少外显子7和/或外显子8的外源性app编码序列替代内源性app编码序列，或(iii)修饰对应于所述内源性app编码序列中的外显子7和/或外显子8的剪接受体和/或剪接供体位点；以及允许所述app基因被表达，由此由所述细胞的剪接机构剪接app前mrna，从而产生其中不包含外显子7和/或外显子8的mrna，并且允许所述mrna转译成所述内部截短的人app蛋白。优选地，所述方法包括使用如crispr等基因组编辑技术或同源依赖性靶向整合(hiti)。在一个实施例中，crispr可以用于优选地从神经元细胞中缺失外显子7和/或8。在另一个实施例中，hiti可以用于用缺少外显子7和/或8的cdna替代内源性app基因。换句话说，优选地执行缺少外显子7和8的合成基因的“敲入”。可替代地，所述方法可以包括执行小基因到包括强剪接受体位点的内含子6-7中的敲入，随后是外显子9-18的cdna。这将绕过外显子7和8的转录，并且由此产生695cdna。所述方法可以体内、体外、或离体进行。应当理解，本发明扩展到任何核酸或肽或其变体、衍生物或类似物，其包括本文提及的任何序列的大体上氨基酸或核酸序列，包含其功能变体或功能片段。术语“基本上氨基酸/核苷酸/肽序列”、“功能变体”和“功能片段”可以是与本文提及的序列中的任何一个序列的氨基酸/核苷酸/肽序列具有至少40％序列同一性的序列，例如与本文所标识的序列具有40％同一性等。还设想了与所提及的序列中的任何一个具有大于65％、更优选地大于70％、甚至更优选地大于75％、还更优选地大于80％序列同一性的氨基酸/多核苷酸/多肽序列。优选地，氨基酸/多核苷酸/多肽序列与所提及的序列中的任何一个具有至少85％同一性，更优选地与本文提及的序列中的任何一个具有至少90％同一性、甚至更优选地至少92％同一性、甚至更优选地至少95％同一性、甚至更优选地具有至少97％同一性、甚至更优选地至少98％同一性以及最优选地至少99％同一性。技术人员将理解如何计算两个氨基酸序列/多核苷酸序列/多肽序列之间的百分比同一性。为了计算两个氨基酸序列/多核苷酸序列/多肽序列之间的百分比同一性，必须首先制备两个序列的比对，然后计算序列同一性值。用于两个序列的百分比同一性可以取不同的值，这取决于：-(i)用于比对序列的方法，例如clustalw、blast、fasta、smith-waterman(在不同程序中实施)或来自3d比较的结构比对；以及(ii)由比对方法所使用的参数，例如局部与全局比对、使用的配对分数矩阵(例如，blosum62、pam250、gonnet等)和空位罚分，例如功能形式和常数。在进行比对后，有许多不同的方法来计算两个序列之间的百分比同一性。例如，可以通过以下方式划分同一性的数量：(i)最短序列的长度；(ii)比对的长度；(iii)序列的平均长度；(iv)非空位位置的数量；或(v)不包括突出的等价位置的数量。此外，应当理解的是，百分比同一性也强烈依赖于长度。因此，一对序列越短，可能预期偶然发生的序列同一性越高。因此，应当理解，蛋白质或dna序列的精确比对是一个复杂的过程。流行的多重比对程序clustalw[38，39]是用于产生根据本发明的蛋白质或dna的多重比对的优选方式。clustalw的合适参数可以如下：对于dna比对：空位开放罚分＝15.0，空位延伸罚分＝6.66，并且矩阵＝同一性。对于蛋白质比对：空位开放罚分＝10.0，空位延伸罚分＝0.2，并且矩阵＝gonnet。对于dna和蛋白质比对：endgap＝-1，并且gapdist＝4。本领域的技术人员将意识到，可能需要改变这些和其它参数以进行最佳序列比对。优选地，然后可以根据如(n/t)*100等比对可以计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性，其中n是序列共享相同残基的位置数，并且t是比较的位置数，其包含空位但不包括突出。因此，用于计算两个序列之间的百分比同一性的最优选方法包括：(i)使用clustalw程序，使用合适的一组参数制备序列比对，例如，如上所阐述的；以及(ii)将n和t的值插入到下式中：-序列同一性＝(n/t)*100。用于识别相似序列的替代方法是本领域技术人员已知的。例如，基本类似的核苷酸序列将由在严格条件下与dna序列或其补体杂交的序列编码。在严格条件下，我们指的是核苷酸与过滤结合的dna或rna在约45℃下在3×氯化钠/柠檬酸钠(ssc)中杂交，然后在约20-65℃下在0.2×ssc/0.1％sds中至少洗涤一次。可替代地，基本上类似的多肽可以与本文所示出的序列相差至少1个，但少于5个、10个、20个、50个、或100个氨基酸。由于遗传密码的简并性，显然可以改变或更改本文所描述的任何核酸序列以提供其功能变体，而基本上不影响由其进行编码的蛋白质的序列。合适的核苷酸变体是具有通过取代对序列内相同氨基酸进行编码的不同密码子而改变的序列的核苷酸变体，从而产生沉默变化。其它合适的变体是具有同源核苷酸序列但包括序列的全部或部分的变体，所述序列通过取代对具有与其替代的氨基酸具有相似生物物理特性的侧链的氨基酸进行编码的不同密码子而改变，以产生保守的变化。例如，小的非极性疏水氨基酸包含甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。大的非极性疏水氨基酸包含苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包含丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括含赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包含天冬氨酸和谷氨酸。因此，应当理解，哪些氨基酸可以被具有相似生物物理特性的氨基酸取代，并且技术人员将知道对这些氨基酸进行编码的核苷酸序列。本文(包含任何随附权利要求、摘要以及附图)描述的所有特征和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以以任何组合形式与上述方面中的任一个组合，这种特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合除外。为了更好地理解本发明并示出如何实现本发明的实施例，现在将通过实例的方式参考附图，其中：-图1示出了使用人剪接查找器2.4对外显子7(图1a)和外显子8(图1b)的潜在外显子剪接增强子(ese)和外显子剪接沉默子/抑制子(ess)的预测；图2示出了淀粉样前体蛋白(app)基因的基因组组织的说明以及反义寡核苷酸(aon)相对于所靶向外显子7(seqidno:5)和8(seqidno:11)的定位。外显子序列用大写字母表示，并且内含子序列用小写字母呈现。选择五个序列(pmo7.1、7.2、7.3、7.4和7.5)以靶向外显子7，并且选择四个序列(pmo8.1、8.2、8.3和8.4)以靶向外显子8。彩色框中示出了产生的磷酸二酰胺吗啉代反义寡核苷酸(即pmo)序列；图3示出了使用mfold分析选择用于由内含子序列的50个核苷酸侧接的app外显子7的最热力学上有利的结构，并展示了图2中所示的已设计的pmo的靶位点(彩色线表示与其对应的靶位点比对的pmo)；图4示出了通过mfold选择用于由内含子序列的50个核苷酸侧接的app外显子8最热力学上有利的结构，并展示了图2中所示的已设计的pmo的靶位点(彩色线表示与其对应的靶位点比对的pmo)；图5(a)示出了琼脂糖凝胶，所述琼脂糖凝胶展示了从未经转染的细胞(空白)、用对照pmo转染的细胞(e2)和用500nm的pmo7.2、8.2转染的细胞以及pmo7.2和8.2的组合(各自500nm)中分离的mrna的rt-pcr产物。图5(b)-(c)示出了作为每种pcr产物的强度与所有组合的pcr产物的强度的比率计算的每种转录物的相对量。(b)500nm的pmo7.1、7.2、7.3和7.4的转染增加app695的相对表达并促进外显子7的排除，而pmo7.5未显示出显著的活性。(c)500nm的pmo8.1、8.2和8.3的转染促进主要从app770并且较少地从app751排除外显子7和8，从而增加app695的相对量，而pmo8.4促进仅从app751排除外显子8。对于所有条件，n＝3个独立实验。对于所有条件，***p≤0.0001，**p≤0.0014，*p＝0.0248，n＝3；图6示出了通过rt-pcr从用增加量的pmo7.2、8.2和两者的组合转染的sh-sy5y定量不同的app同种型的相对量。(a)250nm的pmo7.2的转染足以诱导从app770跳读外显子7，并且500nm诱导从app770和app695两者跳读。(b)500nm的pmo8.2的转染足以诱导从app770跳读外显子7和8并增加app695的相对量。(c)7.2和8.2的转染在相对低的浓度(各自500nm)下有效减少app770和751的水平；图7(a)示出了蛋白质印迹的代表性图像，所述蛋白质印迹展示了来自未经转染细胞的匀浆(空白)、用对照pmo(e2)转染的细胞以及用500nm的pmo7.2、8.2转染的细胞以及7.2和8.2的组合(各自500nm)的app的蛋白质水平。(b)作为app695的强度与所有app产物的强度的比率计算的app695的相对量示出在用所设计的pmo转染的细胞中app695显著增加。对于所有条件，***p＝0.0001，n＝3；并且图8示出了来自通过qpcr用pmo7.2、8.2和两者的组合转染的sh-sy5y神经母细胞瘤细胞的nep的基因表达水平。与未经转染的细胞或用对照pmo转染的细胞相比，pmo的转染增强了nep的表达水平。实例ad的表现和进展的显著因素是由app的蛋白质水解加工产生的淀粉样β的累积。在脑部中，已经标识出由外显子7(app751)或外显子7和8(app695)的替代性剪接产生的app的三个主要转录物。即使在生理条件下，脑部中的主要转录物是app695，较长转录物(app751以及含有外显子7和8两者的全长app770)水平的显著增加也已经与ad的进展相连。如以下所描述的，发明人设计了磷酸二酰胺吗啉代反义寡核苷酸(pmo)以诱导外显子7和8的跳读并恢复app的非疾病相关的剪接模式。在表达所有三种同种型的sh-sy5y人神经母细胞瘤细胞中，在体外测试了若干pmo诱导外显子7和8外显子跳读的能力。发明人已经标识了有效地减少包含来自成熟mrna的外显子7和8的反义寡核苷酸，所述成熟的mrna引起app695蛋白的表达增加，其中app751和app770相关减少。此研究证明了此外显子跳读方法改变ad的app剪接的可行性。材料和方法反义寡核苷酸(aon)设计如根据人剪接查找器2.4.1[40]通过mfold[41]对外显子/内含子序列和次级结构的分析以及如通过sfold[42]所预测的对aon靶结合能的计算所预测的，使用与前mrna剪接相关的推测sr蛋白结合基序的知识，将aon设计为人app基因的外显子7和8。为了进行分析，使用对应的外显子连同外显子的50个核苷酸3'和5'。通过基因工具有限责任公司(genetools,llc)，将所有aon合成为pmo。细胞培养和转染使人神经母细胞瘤sh-sy5y细胞在补充有10％fbs(吉博科公司(gibco))、1×链霉素(吉博科公司)、1×非必需氨基酸(西格玛公司(sigma))以及1×谷氨酰胺(吉博科公司)的dmem完全培养基-dmem高葡萄糖(西格玛公司)中生长并在37℃下在5％co2下温育。将细胞接种到dmem高葡萄糖完全培养基中的12孔板中以进行转染。根据制造商的说明，用endoporter/dmso(基因工具公司)以每1ml培养基6μlendoporter的比率转染未分化的细胞。pmo浓度范围为50nm到1μm。rna萃取和rt-pcr按照制造商的说明，在通过rneasy试剂盒(凯杰公司(qiagen))萃取rna之前，通常在转染后将细胞温育24小时。根据制造商的说明，在nanodrop上定量rna，并将500ng用于与genescriptrt-pcr试剂盒(创惟公司(genesys))进行rt-pcr反应。使用的引物序列为：frt–gtgatgaggtagaggaagagg(seqidno:16)，rrt–gttgtagagcagggagagag(seqidno:17)。rtpcr条件是：在45℃下逆转录30分钟，然后：在92℃下初始变性持续2分钟，在92℃下进行10个变性循环持续30秒，在62℃下退火持续30秒，在68℃下延伸持续45秒，在92℃下进行25个变性循环持续30秒，在62℃下退火持续30秒，在68℃下延伸持续45秒+5秒/循环，然后在68℃下最终延伸持续10分钟，在4℃下无限保持。将1μl等份试样的rt-pcr产物用作模板以使用2×pcr主混合物(quantig有限公司(quantigltd.))进行30个循环的第二轮嵌套pcr反应。使用的嵌套引物序列为：fnes–cacagagagaaccaccagca(seqidno:18)，rnes–cttgacgttctgcctcttcc(seqidno:19)。嵌套pcr条件为：在92℃下初始变性持续5分钟，在92℃下进行30个变性循环持续30秒，在60℃下退火持续30秒，在68℃下延伸持续45秒，然后在68℃下最终延伸持续10分钟，在4℃下无限保持。在含1％(w/v)琼脂糖凝胶的tae缓冲液上分析pcr产物，并用sybrsafe可视化产物。通过用斐济图像(fijiimage)j[43]进行密度测定分析以对pcr凝胶进行分析来测定外显子跳读水平。蛋白质印迹转染后72小时，通过用具有蛋白酶抑制剂混合液(罗氏公司(roche))的ripa缓冲液(150mmnacl，10mmedta，50mmhepes，1％(v/v)np-40、0.5％(w/v)脱氧胆酸钠，0.1％(w/v)sds)裂解sh-sy5y细胞来制备蛋白质样品。在75℃下变性持续8分钟之前，在1×lds样品缓冲液和1×还原剂(英杰公司(invitrogen))中制备蛋白质样品。将样品溶解在10％(w/v)tris-甘氨酸凝胶上，并转移到amershamprotran0.45μm硝酸纤维素膜(通用电气生命科学公司(gelifesciences))。将膜在含有0.05％(v/v)吐温-20和2.5％(w/v)干奶粉的tbs中封闭持续1小时。然后，在用tbs洗涤之前，以1:1000的稀释度将膜与抗appn末端抗体mab348(西格玛奥德里奇公司(sigmaaldrich))在封闭缓冲液中在4℃下温育过夜，并且然后与抗小鼠iggdylight680次级抗体(细胞传导信号公司(cellsignalling))在含有2.5％干奶粉(w/v)的tbs中以1:5000温育。使用来自li-cor生物科学公司(li-corbiosciences)的odyssey红外成像系统执行检测，并且使用斐济图像j[43]进行密度测定分析。修饰脑啡肽酶和app的表达1)cdna合成对于每个cdna合成反应，将0.5μg随机引物(英杰公司)、0.5μg寡核苷酸(dt)(普洛麦格公司(promega))和600ng的rna加入到单个试管中，用hypure分子级水(生命科学公司(lifesciences))将体积补足到10μl。在置于冰上之前，将反应混合物在70℃下温育持续5分钟。将含有goscript5×缓冲液(普洛麦格公司)、goscript酶(普洛麦格公司)、2.5mmmgcl2(普洛麦格公司)，0.5mmdntp(普洛麦格公司)和接近15μl的hypure分子级水(生命科学公司)的主混合物加入到每个反应中并在cdna合成反应中运行。cdna合成条件为：在25℃下退火持续5分钟，在42℃下延伸持续1小时，使逆转录酶在70℃下失活持续15分钟，在4℃下无限保持。来自用于每种条件(7，8，7+8，e2，空白)的3个生物复制的rna用于执行此cdna合成。2)qpcr将cdna稀释到所需浓度，并加入到384孔板的孔中，然后加入所需的主混合物。主混合物由2×光循环器480sybergreeni(罗氏公司)和0.5μm适当的引物(西格玛公司)组成。引物序列在以下进行描述：nep：f-cctggagattcataatggatcttgt(seqidno:23)r-aaagggccttgcggaaag(seqidno:24)app：f-gatccatcagggaccaaaac(seqidno:25)r-agcggtagggaatcacaaag(seqidno:26)对于每种条件，使用三个生物重复，并且对于这些生物复制中的每个生物复制，执行三个技术复制。在每个实验中研究了至少一个所关注的基因和一个管家基因的表达，并使用范围为1/20到1/2500的标准以允许对结果进行分析。在光循环器480qpcr机器(罗氏公司)中运行qpcr。pcr条件为：在95℃下预温育持续5分钟，在95℃下进行40个扩增循环持续15秒，在60℃下持续秒，在72℃下持续15秒。使用光循环器480软件(罗氏公司)分析qpcr。实例1-反义寡核苷酸(aon)的设计由于app695和app751同种型是分别由于从外显子7(app751)或外显子7和8(app695)剪接而产生的，因此设计了一系列独特的aon来靶向这两个外显子。首先参考图1，使用人剪接查找器2.4.1分析每个外显子序列中是否存在外显子剪接增强子(ese)和外显子剪接抑制子或沉默子(ess)。参考图2，为了诱导外显子跳读，aon被设计为特异性地靶向ese，并在可能的情况下避免ess。使用来自人剪接查找器2.4.1的输出，设计了靶向两个外显子的若干25体aon或30体aon。先前已经确立，更有效的aon将在开环结构中具有其末端，因为这允许更容易的链入侵，并且将更容易与开放构象序列结合[44]。分别参考图3和4，因此使用mfold评估了用于外显子7和外显子8的前mrna的预测次级结构，并绘制了已设计的aon的结合位点。进一步地，对于靶序列的开放构象，更强地与其靶结合的aon也被预测为更有效的[44]。使用sfold对已设计的aon与其靶的结合进行热力学分析，并且结果总结在表1中。表1-所选aon的序列和性质的总结pmo7.1＝seqidno:6pmo7.2＝seqidno:7pmo7.3＝seqidno:8pmo7.4＝seqidno:9pmo7.5＝seqidno:10pmo8.1＝seqidno:12pmo8.2＝seqidno:13pmo8.3＝seqidno:14pmo8.4＝seqidno:15总体分析示出，所有已设计的富含外显子剪接增强子(ese)基序的aon靶序列的靶中具有高比例的开环构象，其中除一个以外的所有靶均在预测的开环结构中具有至少一个末端，并且所述末端都与其靶强结合(参见图3、4和表1)。由于在此工作中使用了pmo化学，因此还将已设计的每个aon的gc含量％(理想地40-60％)、任何连续的g延伸段的长度(小于4)以及自身互补的程度(很少或根本没有)考虑在内，因为据信这些因素对合成产率、溶解度和功效具有显著影响。实例2-pmo促进appmrna中外显子7和8被排除的效率发明人接下来通过对分离自sh-sy5y人神经母细胞瘤细胞的mrna执行逆转录pcr(rt-pcr)来测试五个靶向外显子7的pmo和四个靶向外显子8的pmo的活性，所述人神经母细胞瘤细胞各自用pmo在500nm下处理持续48小时。sh-sy5y被用于此工作，由于其与原代人神经元细胞相似，并且因为其表达所有三种神经元app基因变体[45]。首先，发明人检查了靶向外显子7的pmo的活性。参考图5a，用500nm的pmo转染sh-sy5y细胞，然后进行被设计成在一个反应中检测app的三种变体的嵌套rt-pcr。为了定量pmo的活性，使用光密度测定法测量用于每种mrna变体的特性带的强度，并且随后计算为占所有pcr产物强度的百分比。出于一致性目的，在25-30次传代后更新培养物，并且此处呈现的每个图是在同一批细胞中执行的三个独立实验的平均值。三种同种型的相对量对于对照(未经转染)细胞来说为：app770:34.1±3.3％、app751:44.6±0.9％和app695:21.2±2.6％，并且对于用对照pmo(e2，靶向人肌营养不良蛋白基因)转染的细胞来说为：app770:31.8±2％、app751:45.4±1.2％以及app695:23.2±1.6％。此对照pmo的序列为ccagcccatcttctcctggtcctgg(seqidno:20)。参考图5b，结果示出，当在500nm下使用时，pmo7.1、7.2、7.3和7.4显著减少外显子7包含在转录物中，与对照相比，app695的量分别增加到71.5±3.2％、75.9±4.1％、64.1±2.4％和74.7±0.1％(p≤0.0001，n＝3)。pmo7.5对app的mrna的剪接模式的影响不如其它，并且app695的量与对照条件类似(28.6±4.6％，p＝0.656，n＝3)。另外，参考图5a和5b，令人惊讶地产生了对应于包含外显子8但不包含外显子7的appmrna的新颖产物。此mrna先前没有被描述过，并且很可能对应于非生理变体。接下来，发明人检查了在用500nm的每种寡核苷酸转染的sh-sy5y细胞中靶向外显子8的四个pmo的活性。参考图5a和5c，结果示出，pmo8.1、8.2和8.3有效地诱导外显子8的排除，并且可能未检测到对应于app770的可检测带。对pcr产物的定量示出，app751相对量对于pmo8.1和8.2来说降低，而对pmo8.3来说的相对量降低较少(与c，分别为44.6±0.9％，p＝0.0014，0.025和p>0.05，n＝3相比，分别为31.9±0.3％，35.8±0.2％和39.8±1.02％)。令人惊讶的是，较短app695转录物的相对水平的增加对于pmo8.1、8.2和8.3来说更突出(与c，21.2±2.6％，p≤0.0001，n＝3相比，分别为64.1±0.3％，68±0.2％和60±1.02％)，这表明外显子7与外显子8的剪接之间的可能联系。与其它pmo类似，pmo8.4增加了app695的水平(与c，21.2±2.6％，p≤0.0001，n＝3相比，54.7±0.01％)，并减少了app751的相对量(与c，44.6±0.9％，p≤0.0001，n＝3相比，app751：10.5±0.6％)。然而，令人惊讶的是，app770的相对表达没有受到影响(与对照34.1±3.37相比，34.7±0.6％)，这表明此pmo可以仅靶向app751。已经示出，本文所描述的pmo可以有效地诱导所靶向外显子7和8的跳读，发明人选择了pmo7.2和8.2并更详细地研究了其在促进其靶外显子排除方面的效率。为此，用增加浓度的pmo转染sh-sy5y细胞，并对从经过转染的细胞中采集的mrna执行rt-pcr，以评估外显子跳读的程度，如图6a和6b所示出的)。首先，参考图6a，发明人计算了用50nm、250nm、500nm、750nm和1000nm的pmo7.2转染的sh-sy5y细胞中全长变体(包含外显子7的app770)的相对量。结果示出，在用50nm的pmo寡核苷酸转染的细胞与对照(分别为38.1±2.5％和41.3±1.4％)之间，app770的表达相似，而用250nm的pmo7.2或更高进行的转染足以从app751完全消除包含外显子7。有趣的是，外显子7从app751的外显子跳读需要更高浓度的pmo(500nm)。最后，发明人还应注意，如图6a所示出的，在较高浓度的寡核苷酸(1μm)下，外显子8也被排除，这再次表明外显子7和8的剪接之间的联系。接下来，参考图6b，发明人评估了通过pmo8.2排除外显子8的效率。结果示出，通过对500nm的寡核苷酸进行转染，实现外显子8从app770的完全跳读。与先前的观察一致，发明人再次注意到app695(而不是预期的app751同种型)的相对量逐渐增加(对于app695来说，50nm、250nm、500nm、750nm和1000nm分别为32.6±2％、39.8±1.2％、44.1±1.2％、47.2±0.9％和50.38±0.5％；并且对于app751来说，50nm、500nm、750nm和1000nm分别为43.12±11.2％、42.3±10.4％、51.8±12.5％、52.8±5.9％和49.6±4.2％)。这些结果表明，已经设计的寡核苷酸有效地诱导其靶的外显子跳读，从而消除包含外显子7和8。然后，发明人继续检查两种最佳反义寡核苷酸(即pmo7.2和8.2)的组合在诱导排除两个外显子方面是否将有效。为此，用各种浓度的等摩尔浓度的pmo7.2和8.2的组合转染sh-sy5y细胞，并通过rt-pcr比较app变体的相对水平。参考图6c，结果示出，两种pmo的组合诱导app770(在50nm下从14.8±2.7％降低到11.7±2.2％，在100nm下为3.9±3.4％并且在更高浓度下为0)和app751(在50nm下从37.8±2.3％降低到37.5±1.1％，在100nm下为22.9±1.7％，在500nm下为3.5±4.9％，并且在更高浓度下为0)的浓度依赖性降低以及app695的相关增加(在50nm下从47.3±5％增加到50.7±3.1％，在100nm下为73±2.8％，在500nm下为96.4±4.9％并且在更高浓度下为100％)。实例3-检查外显子跳读产生的蛋白质浓度已经示出，已经设计的pmo可以在mrna水平下有效地诱导其靶外显子的跳读，然后发明人检查了由三种mrna变体产生的蛋白质水平，以确保在mrna水平下的外显子跳读事件也可以在蛋白质水平下观察到。为此，在裂解前，用1μm的pmo7.2、pmo8.2及其组合转染sh-sy5y细胞持续72小时，并且用检测所有app变体的抗体探测其蛋白质提取物。如图7所示出的，app770和app751的大小非常类似，并且无法在蛋白质印迹中将其分离(图7a)。因此，他们测量了app695相对于总app的相对量。他们的结果示出，从rt-pcr检测到的app695的改变也反映在蛋白质水平上。与对照和e2转染的细胞(分别为57.7±2.5％和55±3％)相比，用pmo7.2转染的细胞中的app695的相对量显著增加(77.49±3.7％，p＝0.0001，n＝3)。类似地，在用pmo8.2转染的细胞中，app695的相对量也增加了(72.1±4％，p＝0.001，n＝3)，从而证实先前观察结果：在mrna水平下，外显子8的跳读引起app695而不是app751增加。最后，在用两种pmo转染的细胞中，app695占总app的相对量为86.6±2.8％(p＝0.0001，n＝3)。实例4-修饰脑啡肽酶和app的表达参考图8，发明人继续研究用已设计的pmo对神经母细胞瘤细胞进行处理，并且证明两种候选标志基因(即脑啡肽酶(nep)和app)本身的表达增加。脑啡肽酶是灭活(即裂解)包含淀粉样β(aβ)的若干肽的锌依赖性金属蛋白酶。已经提出，其表达取决于app695，其是发明人试图富集的app的小同种型。其与降解淀粉样β的连接示出富集app695如何可以使ad患者受益。app表达的增加也与app695相关，并且图8所示出的结果证实，当比率改变时，app695的另一个转录靶也适当地应答。这些结果表明，预测的下游作用表现出受到本文所描述的pmo的影响。实例5-crispr发明人设想使用基因组编辑工具crispr对靶序列进行修饰以及在剪接受体和供体位点处引入插入/缺失，以模拟使用本文所描述的pmo所表现出的结果。此外，crispr也可以用于(i)尝试并从神经元细胞中缺失两个外显子，或(ii)使用同源依赖性靶向整合(hiti)，用不具有外显子7和8的cdna替代内源性基因。换句话说，可以执行缺少外显子7和8的合成基因的“敲入”。可替代地，将小基因敲入到内含子6-7中是可能的，所述内含子将具有强剪接受体位点，然后是外显子9-18的cdna。这将绕过外显子7和8的转录，并产生695cdna。讨论结果示出，经过修饰的互补寡核苷酸(即本文所描述的pmo)可以有效地用于增加神经母细胞瘤细胞中的app695mrna变体的表达。主要目标是设计将靶向app的两个替代性剪接外显子(即外显子7和8)的pmo。发明人设计了靶向外显子7的五个pmo和靶向外显子8的四个pmo。已设计的pmo中的两个pmo在诱导其靶的外显子跳读方面不如其它pmo活跃。选择最有效的pmo中的两个pmo，每个外显子各一个(pmo7.2和pmo8.2)，并且发明人示出，即使在相对低的浓度下也有可能实现所靶向外显子的100％跳读。此外，发明人也示出，当组合使用最佳pmo时，在mrna水平下观察到的app695的丰度在蛋白质水平下也是明显的。这些数据清楚地表明，使用pmo在体外恢复app695的水平是可行的，因此人们可能对将本文所描述的策略作为如ad的治疗方法的实施方案持乐观态度。为了能够使用靶向脑部的pmo，必须在脑部中递送显著量的pmo。尽管pmo不能容易地穿过血脑屏障，但是已经描述了若干种将aon递送到脑部以克服血脑屏障的策略，这尚待在人类受试者中进行测试。[46-48]。参考文献1.vuong,c.k.、d.l.black和s.zheng,“替代性剪接的神经遗传学(theneurogeneticsofalternativesplicing)”,《自然综述：神经病学(natrevneurosci)》,2016.17(5):第265-81页。2.mills,j.d.和m.janitz,“神经退行性疾病分子病理学中的mrna的替代性剪接(alternativesplicingofmrnainthemolecularpathologyofneurodegenerativediseases)”,《衰老神经生物学(neurobiologyofaging)》,2012.33(5):第1012.e11-1012.e24页。3.huang,y.和l.mucke,“阿尔茨海默病机制和治疗策略(alzheimermechanismsandtherapeuticstrategies)”,《细胞学(cell)》,2012.148(6):第1204-22页。4.muller,u.c.、t.deller和m.korte,“不仅淀粉样：淀粉样前体蛋白家族的生理功能(notjustamyloid:physiologicalfunctionsoftheamyloidprecursorproteinfamily)”,《自然综述：神经病学(natrevneurosci)》,2017.18(5):第281-298页。5.goldgaber,d.等人,“对阿尔茨海默病的脑部淀粉样进行编码的cdna的表征和染色体定位(characterizationandchromosomallocalizationofacdnaencodingbrainamyloidofalzheimer'sdisease)”,《科学(science)》,1987.235(4791):第877-80页。6.tanzi,r.e.等人,“淀粉样β蛋白基因：阿尔茨海默病基因座附近的cdna、mrna分布和遗传连锁(amyloidbetaproteingene:cdna,mrnadistribution,andgeneticlinkagenearthealzheimerlocus)”,《科学》,1987.235(4791):第880-4页。7.yoshikai,s.等人,“人淀粉样β蛋白前体基因的基因组组织(genomicorganizationofthehumanamyloidbeta-proteinprecursorgene)”,《基因(gene)》,1990.87(2):第257-63页。8.kang,j.等人,“阿尔茨海默病淀粉样a4蛋白的前体类似于细胞表面受体(theprecursorofalzheimer'sdiseaseamyloida4proteinresemblesacell-surfacereceptor)”,《自然(nature)》,1987.325(6106):第733-6页。9.shariati,s.a.和b.destrooper,“淀粉样前体蛋白家族中的冗余和分歧(redundancyanddivergenceintheamyloidprecursorproteinfamily)”,《febs快报(febslett)》,2013.587(13):第2036-45页。10.tanaka,s.等人,“人脑中三种类型的淀粉样蛋白前体mrna：其在阿尔茨海默病中的差异表达(threetypesofamyloidproteinprecursormrnainhumanbrain:theirdifferentialexpressioninalzheimer'sdisease)”,《生物化学与生物物理研究通讯(biochembiophysrescommun)》,1988.157(2):第472-9页。11.sandbrink,r.、c.l.masters和k.beyreuther,“app基因家族(appgenefamily)”,“替代性剪接产生功能上相关的同种型(alternativesplicinggeneratesfunctionallyrelatedisoforms)”,《纽约科学院年报(annnyacadsci)》,1996.777:第281-7页。12.weidemann,a.等人,“阿尔茨海默病a4淀粉样蛋白前体的标识、生物发生和定位(identification,biogenesis,andlocalizationofprecursorsofalzheimer'sdiseasea4amyloidprotein)”,《细胞学》,1989.57(1):第115-26页。13.moir,r.d.等人,“含有库尼茨蛋白酶抑制结构域的可溶形式的脑部aβ淀粉样蛋白前体的阿尔茨海默病相对增加(relativeincreaseinalzheimer'sdiseaseofsolubleformsofcerebralabetaamyloidproteinprecursorcontainingthekunitzproteaseinhibitorydomain)”,《生物化学期刊(jbiolchem)》,1998.273(9):第5013-9页。14.spillantini,m.g.等人,“淀粉样β蛋白前体转录物在正常人脑和阿尔茨海默病中的表达和细胞定位(expressionandcellularlocalizationofamyloidbeta-proteinprecursortranscriptsinnormalhumanbrainandinalzheimer'sdisease)”,《大脑研究与分子大脑研究(brainresmolbrainres)》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