T7RNA聚合酶变体的制作方法

相关申请本申请要求2018年4月10日提交的美国临时申请号62/655,747的35u.s.c.§119(e)下的权益，其内容通过引用完整并入本文。发明背景在基因表达过程中脱氧核糖核酸(dna)转录为核糖核酸(rna)是一种基本的细胞过程，其当rna聚合酶附着于dna模板以开始rna聚合时发生。基本的细胞过程如转录通常在37℃下发生，并且包括rna聚合酶在内的许多酶通常在37℃以上的温度下均无活性。因此，在升高的温度下生成rna需要在高温下具有增加的热稳定性的rna聚合酶变体。发明概述本公开内容提供了具有增强的热稳定性的t7rna聚合酶(rnap)变体。这些变体在rna合成反应中的使用导致rna产率和产物概况的改善(相对于野生型t7rnap，即使在高于37℃的温度下)。通过鉴定预测为改善蛋白质稳定性并对亲和力的影响最小化的个别突变，合理设计了这些变体。然后测试被工程化改造以包括那些突变的特定组合的变体，以鉴定具有改善的性质，例如在升高的温度下改善的rna生成的t7rnap变体。因此，本公开内容的一些实施方案提供了t7rnap变体，其在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中包含至少一个氨基酸取代，其中至少一个氨基酸取代在选自下组的位置处：i320、i396、f546、s684和g788。在一些实施方案中，本公开内容提供了t7rnap变体，其在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中包含至少两个氨基酸取代，其中至少两个氨基酸取代在选自下组的位置处：i320、i396、f546、s684和g788。在一些实施方案中，t7rnap变体在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列的位置处：i320、i396、f546、s684和g788(m1)处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，t7rnap变体在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列的位置处：i320，i396和g788(m2)处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，t7rnap变体在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列的位置处：i396、s684和g788(m3)处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，t7rnap变体在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列的位置处：i320、s684和g788(m4)处包含氨基酸取代。seqidno:1的氨基酸序列是t7rnap的野生型序列。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含本文所述的t7rnap变体的组合物、试剂盒、系统和方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了生成核糖核酸(rna)的方法。在一些实施方案中，这些方法包括将如本文提供的t7rna聚合酶变体与核苷三磷酸和编码目标rna的脱氧核糖核酸(dna)模板组合，并生成目标rna。附图简述图1是显示在25μl反应(n＝3)中在反应温度下温育2小时后由t7rna聚合酶变体生成的双链rna(dsrna)产物滴度(ng/μl)的图。图2是显示基于温度由t7rna聚合酶变体生成的％rna的比较的图。发明详述噬菌体t7rna聚合酶(t7rnap)是一种dna依赖性rna聚合酶，属于dna聚合酶i家族。野生型t7rnap包含883个氨基酸，对应于seqidno:1。野生型t7rnap在37℃，ph7.5时具有聚合酶活性，并且在较高温度下无活性。因此，本公开内容的一些方面提供了与野生型t7rna聚合酶相比在高温下具有增加的热稳定性和改善的rna生成的t7rna聚合酶变体。本文公开的t7rna聚合酶变体可以在37℃或更高的温度下进行的多种方法中使用。t7rna聚合酶变体本公开内容的一些方面提供了噬菌体t7rna聚合酶(t7rnap)变体，其与由seqidno:1鉴定的天然存在的t7rnap的氨基酸序列不同。在一些实施方案中，本文提供了t7rnap变体，其在seqidno:1的氨基酸序列中包含至少一个氨基酸取代，其中至少一个取代在选自下组的一个或多个位置处：i320、i396、f546、s684和g788。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i320处。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i396处。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代在seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置f546处。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代在鉴定的氨基酸序列中的s684位置处。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置g788处。在一些实施方案中，本文中提供了在seqidno:1的氨基酸序列中包含至少两个、至少三个或至少四个氨基酸取代的t7rnap变体，其中至少两个、至少三个、至少四个氨基酸或所有五个取代在选自下组的位置处：i320、i396、f546、s684和g788。在一些实施方案中，t7rnap变体在seqidno:1的氨基酸序列中包含至少两个氨基酸取代，其中至少两个氨基酸取代在选自下组的位置处：i320、i396、f546、s684和g788。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i320和i396。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在氨基酸序列中的氨基酸位置i320和f546。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i320和s684处。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i320和g788处。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i396和f546处。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i396和s684处。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i396和g788处。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置f546和s684处。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置f546和g788处。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置s684和g788处。在一些实施方案中，t7rnap变体在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中包含至少三个氨基酸取代，其中至少三个氨基酸取代在选自下组的位置处：i320、i396、f546、s684和g788。在一些实施方案中，至少三个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i320、i396和f546处。在一些实施方案中，至少三个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i320、i396和s684处。在一些实施方案中，至少三个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i320、i396和g788处。在一些实施方案中，至少三个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i320、f546和g788处。在一些实施方案中，至少三个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i320、s684和g788处。在一些实施方案中，至少三个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i396、f546和s684处。在一些实施方案中，至少三个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i396、s684和g788处。在一些实施方案中，至少三个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i396、f546和g788处。在一些实施方案中，至少三个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置f546、s684和g788处。在一些实施方案中，t7rnap变体在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中包含至少四个氨基酸取代，其中至少两个氨基酸取代在选自下组的位置处：i320、i396、f546、s684和g788。在一些实施方案中，至少四个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i320、i396、f546和s684处。在一些实施方案中，至少四个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i320、i396、f546和g788处。在一些实施方案中，至少四个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i320、f546、s684和g788处。在一些实施方案中，至少四个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i320、i396、s684和g788处。在一些实施方案中，至少四个氨基酸取代在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i396、f546、s684和g788处。在一些实施方案中，t7rnap变体在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中包含五个氨基酸取代，其中五个氨基酸取代在位置i320、i396、f546、s684和g788处。某些氨基酸可以在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的位置i320、i396、f546、s684和g788处被另一个氨基酸取代。例如，氨基酸取代包括但不限于由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中的i320l、i320v、i396l、i396v、f546w、f546y、s684a、s684v、g788a和g788v。因此，在一些实施方案中，t7rnap变体在seqidno:1中的选自下组的位置处具有至少一个氨基酸取代：i320、i396、f546、s684和g788，其中位置i320处的氨基酸取代是i320l或i320v，其中位置i396处的氨基酸取代是i396l或i396v，其中位置f546处的氨基酸取代是f546w或f546y，其中位置s684处的氨基酸取代是s684a或s684v，和/或其中位置g788处的氨基酸取代是g788a或g788v。在一些实施方案中，t7rnap变体在seqidno:1中的选自下组的位置处具有至少两个氨基酸取代：i320、i396、f546、s684和g788，其中位置i320处的氨基酸取代为i320l或i320v，其中位置i396处的氨基酸取代是i396l或i396v，其中位置f546处的氨基酸取代是f546w或f546y，其中位置s684处的氨基酸取代是s684a或s684v，和/或其中位置g788处的氨基酸取代是g788a或g788v。在一些实施方案中，t7rnap变体在seqidno:1中的选自下组的位置处具有至少三个氨基酸取代：i320、i396、f546、s684和g788，其中在位置i320的氨基酸取代为i320l或i320v，其中位置i396处的氨基酸取代是i396l或i396v，其中位置f546处的氨基酸取代是f546w或f546y，其中位置s684处的氨基酸取代是s684a或s684v，和/或其中g788位置处的氨基酸取代是g788a或g788v。在一些实施方案中，t7rnap变体在seqidno:1中的选自下组的位置处具有至少四个氨基酸取代：i320、i396、f546、s684和g788，其中位置i320处的氨基酸取代为i320l或i320v，其中位置i396处的氨基酸取代是i396l或i396v，其中位置f546处的氨基酸取代是f546w或f546y，其中位置s684处的氨基酸取代是s684a或s684v，和/或其中位置g788处的氨基酸取代是g788a或g788v。在一些实施方案中，t7rnap变体在seqidno:1中的选自下组的位置处具有至少五个氨基酸取代：i320、i396、f546、s684和g788，其中位置i320处的氨基酸取代为i320l或i320v，其中位置i320处的氨基酸取代为i320l或i320v，其中位置i396处的氨基酸取代是i396l或i396v，其中位置f546处的氨基酸取代是f546w或f546y，其中位置s684处的氨基酸取代是s684a或s684v，和/或其中位置g788处的氨基酸取代是g788a或g788v。在一些实施方案中，t7rnap变体在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中包含至少两个氨基酸取代，其中至少两个氨基酸取代选自i320l、i320v、i396l、i396v、f546w、f546y、s684a、s684v、g788a和g788v。在一些实施方案中，t7rnap变体在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中包含至少三个氨基酸取代，其中至少三个氨基酸取代选自i320l、i320v、i396l、i396v、f546w、f546y、s684a、s684v、g788a和g788v。在一些实施方案中，t7rnap变体在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中包含至少四个氨基酸取代，其中所述至少四个氨基酸取代选自i320l、i320v、i396l、i396v、f546w、f546y、s684a、s684v、g788a和g788v。在一些实施方案中，t7rnap变体在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中包含至少五个氨基酸取代，其中所述至少五个氨基酸取代选自i320l、i320v、i396l、i396v、f546w、f546y、s684a、s684v、g788a和g788v。在一些实施方案中，t7rnap变体在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中包含至少两个氨基酸取代，其中至少两个氨基酸取代选自i320l、i396l、f546w、s684a和g788a。在一些实施方案中，t7rnap变体在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中包含至少三个氨基酸取代，其中所述至少三个氨基酸取代在选自i320l、i396l、f546w、s684a和g788a。在一些实施方案中，t7rnap变体在由seqidno:1鉴定的氨基酸序列中包含至少四个氨基酸取代，其中所述至少四个氨基酸取代选自i320l、i396l、f546w、s684a和g788a。在一些实施方案中，包含i320l、i396l和g788a氨基酸取代的t7rnap变体包含由seqidno:3鉴定的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含i396l、s684a和g788a氨基酸取代的t7rnap变体包含由seqidno:4鉴定的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含i320l、s684a和g788a氨基酸取代的t7rnap变体包含由seqidno:5鉴定的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含i320l、i396l、f546w、s684a和g788a氨基酸取代的t7rnap变体包含由seqidno:2鉴定的氨基酸序列。在一些实施方案中，t7rnap变体包含由seqidno:3鉴定的氨基酸序列。在一些实施方案中，t7rnap变体包含由seqidno:4鉴定的氨基酸序列。在一些实施方案中，t7rnap变体包含由seqidno:5鉴定的氨基酸序列。在一些实施方案中，t7rnap变体包含由seqidno:2鉴定的氨基酸序列。本公开内容包括t7rnap变体，其还包含不在seqidno:1的位置i320、i396、f546、s684或g788处的氨基酸的至少一个取代。在一些实施方案中，不在保守氨基酸处或驻留于保守基序内的氨基酸(其中此类残基对于蛋白质活性是必不可少的)处产生额外的氨基酸残基。然而，在一些实施方案中，可以将额外的氨基酸取代掺入t7rnap变体的非保守区域中，使得t7rnap变体保留其活性。在一些实施方案中，本公开内容的t7rna变体进一步包含至少一个本文未描述的氨基酸取代，条件是额外的氨基酸取代不抑制聚合酶活性。因此，在一些实施方案中，t7rna变体包含位置i320处的氨基酸取代和至少一个额外的氨基酸取代。在一些实施方案中，t7rna变体包含位置i396处的氨基酸取代和至少一个额外的氨基酸取代。在一些实施方案中，t7rna变体包含位置f546处的氨基酸取代和至少一个额外的氨基酸取代。在一些实施方案中，t7rna变体包含位置s684处的氨基酸取代和至少一个额外的氨基酸取代。在一些实施方案中，t7rna变体包含位置g788处的氨基酸取代和至少一个额外的氨基酸取代。在一些实施方案中，将位置i320、i396、f546、s684和/或g788处的氨基酸取代掺入与seqidno:1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列中。因此，在一些实施方案中，t7rnap变体在与seqidno:1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列中的选自下组的位置处包含两个、三个、四个或五个氨基酸取代：i320、i396、f546、s684和g788。术语“同一性”是指两个或更多个多肽的序列之间的关系，如通过比较(比对)序列所确定的。同一性是指通过特定数学模型或计算机程序(例如“算法”)解决的在具有缺口比对(如果有的话)的情况下两个或更多个序列的较小者之间的相同匹配百分比。相关分子的同一性可以通过已知方法容易地计算。“百分比(％)同一性”当其应用于氨基酸序列时定义为在将序列进行比对并在必要时引入缺口以实现最大百分比同一性后，候选氨基酸序列中与第二序列的氨基酸序列中的残基相同的氨基酸残基的百分比。同一性取决于同一性百分比的计算，但由于计算中引入的缺口和罚分，在数值上可以有所不同。序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。确定同一性的技术已编入公共可用的计算机程序中。用于确定两个序列之间的同源性的示例性计算机软件包括但不限于gcg程序包(devereux,j.etal.,nucleicacidsresearch,12(1):387,1984)、blast套(altschul,s.f.etal.,nucleicacidsres.25:3389,1997)和fasta(altschul,s.f.etal.,j.molec.biol.215:403,1990)。其它技术包括：smith-waterman算法(smith,t.f.etal.,j.mol.biol.147:195,1981；needleman–wunsch算法(needleman,s.b.etal.,j.mol.biol.48:443,1970；和快速最佳全局序列比对(fastoptimalglobalsequencealignmentalgorithm)(fogsaa)(chakraborty,a.etal.,scirep.3:1746,2013)。应当理解，位置i320、i396、f546、s684和g788处的氨基酸取代可以转移至其他rna聚合酶，对rna聚合酶的活性和热稳定性具有相似的影响。rna聚合酶的实例包括但不限于来自噬菌体t3的rna聚合酶(ncbi参考序列：np_523301.1，seqidno:11)、来自噬菌体sp6的rna聚合酶(uniprot：p06221，seqidno:12)、来自欧文氏菌(erwinia)噬菌体fe44的rna聚合酶(ncbi参考序列：yp_008766719.1，seqidno:13)、来自克鲁维酵母(kluyvera)噬菌体kvp1的rna聚合酶(genbank：acj14548.1，seqidno:14)和来自耶尔森氏菌(yersinia)噬菌体phiyeo3-12的rna聚合酶(uniprot：q9t145，seqidno:15)。在本公开内容的一些方面，本文提供了编码t7rnap变体的核酸。在一些实施方案中，核酸编码seqidno:2的t7rnap变体。在一些实施方案中，核酸编码seqidno:3的t7rnap变体。在一些实施方案中，核酸编码seqidno:4的t7rnap变体。在一些实施方案中，核酸编码seqidno:5的t7rnap变体。rna聚合酶活性和热稳定性本公开内容的一些方面提供了与天然存在的t7rna聚合酶相比具有增加的rna聚合酶活性的t7rnap变体。rna聚合酶活性是指t7rnap变体合成rna聚合物的特性。例如，基于保真度和聚合动力学(例如，聚合速率)评估t7rnap变体的活性。例如，1个单位的t7rnap变体可以在30分钟内在37℃的温度下将10nmol的ntp掺入酸不溶性物质(例如rna产物)中。在一些实施方案中，t7rnap变体可以保持活性(能够在37℃或更高的温度下催化聚合反应)。在一些实施方案中，t7rnap变体可以在42℃或更高的温度下保持活性。在一些实施方案中，t7rnap变体可以在42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃的温度下保持活性。在一些实施方案中，t7rnap变体可以在大于37℃的温度下保持活性15分钟至48小时或更长。例如，t7rnap变体可以在大于37℃的温度下保持活性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、36、42或48小时。本文所述的t7rnap变体可以在使对照rna聚合酶变性的升高的温度下保持活性。因此，在一些实施方案中，t7rnap变体在升高的温度(例如高于37℃)下保留大于10％的其活性，所述升高的温度在其它情况下将使对照rna聚合酶失活(即，小于20％、小于10％、小于5％、小于2％、小于1％或0％其原始rna活性)。在一些实施方案中，t7rnap变体可以在升高的温度(例如，高于37℃)保留15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的活性，所述升高的温度在其它情况下将使对照rna聚合酶失活。在一些实施方案中，t7rnap变体可以在升高的温度(例如高于37℃)下保留10-100％、25-100％或50-100％的活性，所述升高的温度在其它情况下将使对照rna聚合酶失活。在一些实施方案中，t7rnap变体可以在升高的温度(例如高于37℃)保留10-90％、10-85％、10-80％、10-75％、10-70％、10-65％、10-60％、10-55％、25-90％、25-85％、25-80％、25-75％、25-70％、25-65％、25-60％、25-55％、50-90％、50-85％、50-80％、50-75％、50-70％、50-65％、50-60％或50-55％活性，所述升高的温度在其它情况下将使对照rna聚合酶失活。因此，在一些实施方案中，在37℃或更高的温度下，t7rnap变体可比对照rna聚合酶生成多至少10％的rna产物。在一些实施方案中，t7rnap变体在大于37℃的温度下可比对照rna聚合酶生成多至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％的rna产物。与作为天然存在的t7rna聚合酶的对照t7rna聚合酶相比，本公开内容的一些方面提供了具有改善的热稳定性的t7rnap变体。热稳定性是指t7rnap变体在升高的温度下抵抗变性的特性。例如，对照t7rna聚合酶可以在42℃的温度下部分或完全变性(失活)，t7rnap变体被认为是“热稳定的”并且在42℃下不变性。在一些实施方案中，t7rnap变体与对照rna聚合酶相比在大于37℃、大于38℃、大于39℃、大于40℃、大于41℃、大于42℃、大于43℃、大于44℃、大于45℃、大于46℃、大于47℃、大于48℃、大于49℃、大于50℃、大于51℃、大于52℃、大于53℃、大于54℃、大于55℃、大于56℃、大于57℃、大于58℃、大于59℃、大于60℃、大于61℃、大于62℃、大于63℃、大于64℃、大于65℃、大于66℃、大于67℃、大于68℃、大于69℃、大于70℃、大于71℃、大于72℃、大于73℃、大于74℃、大于75℃、大于76℃、大于77℃、大于78℃、大于79℃或大于80℃的温度下具有增加的热稳定性(例如，增加的对变性的抗性)。使用方法本公开内容涵盖t7rnap变体在多种方法中的用途，所述方法包括但不限于生成rna的方法(例如，体外转录，体内转录)、生成标记的rna探针(例如，放射性标记的rna探针)的方法、制备rna疫苗的方法、聚合核苷酸的方法、扩增rna的方法和生成蛋白质的方法。与对照rna聚合酶相比，本文所述的t7rnap变体具有增加的热稳定性，因此，本文所述的t7rnap变体的使用方法可以在大于37℃的温度下进行。在一些实施方案中，使用t7rnap变体的方法在大于37℃、大于38℃、大于39℃、大于40℃、大于41℃、大于42℃、大于43℃、大于44℃、大于45℃、大于46℃、大于47℃、大于48℃、大于49℃、大于50℃、大于51℃、大于52℃、大于53℃、大于54℃、大于55℃、大于56℃、大于57℃、大于58℃、大于59℃、大于60℃、大于61℃、大于62℃、大于63℃、大于64℃、大于65℃、大于66℃、大于67℃、大于68℃、大于69℃、大于70℃、大于71℃、大于72℃、大于73℃、大于74℃、大于75℃、大于76℃、大于77℃、大于78℃、大于79℃、或大于80℃的温度下进行。本文公开的t7rnap变体提供了优于t7rna聚合酶的某些优势，例如，用于在37℃或更高的温度下生成目标rna。在一些实施方案中，在37℃或更高的温度下，t7rnap变体比对照rna聚合酶生成更大量的目标rna。在一些实施方案中，在37℃或更高的温度下，由t7rnap变体生成的目标rna的量比使用对照rna聚合酶生成的目标rna的量大至少1.2倍。在一些实施方案中，由t7rnap变体生成的目标rna的量在37℃或更高的温度下比使用对照rna聚合酶生成的目标rna的量大至少1.3倍、大至少1.4倍、大至少1.5倍、大至少1.6倍、大至少1.7倍、大至少1.8倍、大至少1.9倍、大至少2倍、大至少2.5倍、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍、至少大6倍、大至少7倍、大至少8倍、大至少9倍、大至少10倍、大至少11倍、大至少12倍、至少大13倍、大至少14倍、大至少15倍、大至少20倍、至少25倍。适合于生成rna(例如，rna产物、标记的rna、rna疫苗或扩增的rna)的条件在本领域中是已知的，或者可以由本领域的普通技术人员在考虑例如t7rna聚合酶活性的最佳条件的情况下确定，包括ph(例如ph8)、温度(例如15℃至70℃)、时间长度(例如5分钟至72小时)、盐浓度(例如浓度为5mm至1m的氯化钠、氯化钾、乙酸钠和/或乙酸钾)、和反应混合物中磷酸根和二价离子(例如mg2+)以及任何外源性辅因子的存在。在一些实施方案中，将缓冲剂添加至反应混合物，例如以实现特定的ph值和/或盐浓度。缓冲剂的实例包括但不限于磷酸盐缓冲剂、tris缓冲剂、mops缓冲剂、hepes缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、苹果酸缓冲剂、mes缓冲剂、组氨酸缓冲剂、pipes缓冲剂、bis-tris缓冲剂和乙醇胺缓冲剂。在一些实施方案中，将稳定性改善剂添加至反应混合物，例如以改善各种蛋白质的活性和/或稳定性。稳定性改善剂的非限制性实例包括多胺(例如亚精胺、腐胺、尸胺等)、载体蛋白(例如bsa等)、焦磷酸酶、甘油、二醇(例如1,2-丙二醇等)、dmso、盐(例如nacl、mgcl2、mncl2)、还原剂(例如二硫苏糖醇(dtt)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep)、β-巯基乙醇)。在一些实施方案中，在rna聚合反应期间的反应混合物在37℃、大于37℃、大于38℃、大于39℃、大于40℃、大于41℃、大于42℃、大于43℃、大于44℃、大于45℃、大于46℃、大于47℃、大于48℃、大于49℃、大于50℃、大于51℃、大于52℃、大于53℃、大于54℃、大于55℃、大于56℃、大于57℃、大于58℃、大于59℃、大于60℃、大于61℃、大于62℃、大于63℃、大于64℃、大于65℃、大于66℃、大于67℃、大于68℃、大于69℃、大于70℃、大于71℃、大于72℃、大于73℃、大于74℃、大于75℃、大于76℃、大于77℃、大于78℃、大于79℃或大于80℃的温度下温育0.5-24小时。通过本文提供的方法生成的rna可以是任何形式的rna，包括单链rna(ssrna)和双链rna(dsrna)。单链rna的非限制性实例包括信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna)、piwi-相互作用rna(pirna)和反义rna。本文中的双链rna包括不含单链区域(例如，环或突出端)的全双链分子，以及包含双链区域和单链区域(例如，环或突出端)的部分双链分子。因此，可以通过本公开内容的方法生成短发夹rna(shrna)。在一些实施方案中，rna产物与靶核酸结合，并且可以用作例如治疗剂、预防剂或诊断剂。在一些实施方案中，目标rna是dsrna、ssrna、sirna、mirna、pirna、mrna、shrna或指导rna(grna)。通过本文提供的方法生成的rna可以如本文所述进行修饰。在一些实施方案中，根据本文所述的方法生成rna，然后对其进行修饰。在一些实施方案中，根据本文所述的方法，使用经修饰的起始材料生成rna。在一些实施方案中，经修饰的起始材料是经修饰的核碱基。在一些实施方案中，经修饰的起始材料是经修饰的核苷。在一些实施方案中，经修饰的起始材料是经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的rna包含主链修饰。在某些情况下，主链修饰由于核酸酶介导的降解减少而导致更长的rna半衰期。这继而导致更长的半衰期。合适的主链修饰的实例包括但不限于硫代磷酸酯修饰、二硫代磷酸酯修饰、对乙氧基修饰、膦酸甲酯修饰、硫代磷酸甲酯修饰、磷酸烷基酯和磷酸芳基酯(其中带电荷的膦酸酯氧被烷基或芳基取代)、烷基磷酸三酯(其中带电荷的氧部分被烷基化)、肽核酸(pna)主链修饰、锁定核酸(lna)主链修饰等。这些修饰可以彼此结合和/或与磷酸二酯主链连接结合使用。或者/另外，rna可以包含其他修饰，包括在碱基或糖部分处的修饰。实例包括具有共价附着于3’位处的羟基以外的和5’位处的磷酸基以外的低分子量有机基团的糖(例如2’-o-烷基化核糖)的rna，含有替换核糖的糖诸如阿拉伯糖的rna。rna还包括取代的嘌呤和嘧啶，例如c-5丙炔修饰的碱基(wagneretal.,naturebiotechnology14:840-844,1996)。其他嘌呤和嘧啶包括但不限于5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和次黄嘌呤。经修饰的rna生成的其他形式可包括在反应混合物中使用经修饰的核苷酸，例如5’-甲基-ctp、假尿苷、2’-o-甲基-utp、2-氟修饰的嘧啶。其他此类修改是本领域技术人员众所周知的。编码目标rna的任何合适的dna模板可用于本文所述的方法。dna模板包括与编码期望rna产物的核苷酸序列和任选地转录终止子可操作连接的启动子，任选地是诱导型启动子。尽管可使用其他模板形式(例如，通过聚合酶链式反应(pcr)、化学合成或本领域已知的其他方式生成的线性dna模板)，但通常在载体例如质粒上提供dna模板。在一些实施方案中，在反应混合物中使用超过一种dna模板。在一些实施方案中，在反应混合物中使用2、3、4、5或更多不同的dna模板。启动子或终止子可以是天然序列或工程化序列。在一些实施方案中，修饰工程化序列以增强转录活性。在一些实施方案中，启动子是天然存在的序列。在其他实施方案中，启动子是工程化序列。在一些实施方案中，终止子是天然存在的序列。在其他实施方案中，终止子是工程化序列。任何合适形式的t7rnap变体可以用于本文所述的方法。在一些实施方案中，t7rnap变体作为来自表达t7rnap变体的细胞的细胞裂解物提供。在一些实施方案中，t7rnap变体作为来自表达t7rnap变体的细胞的酶制剂提供。酶制剂可以是纯化的，部分纯化的或未纯化的。在一些实施方案中，酶制剂包含t7rnap变体和用于表达t7rnap变体的细胞或细胞组分。在一些实施方案中，酶制剂包含从细胞或细胞组分中纯化(例如，基本上不含细胞或细胞组分)的t7rnap变体。在一些实施方案中，t7rnap变体由编码t7rnap变体的核酸提供。试剂盒可以在试剂盒中提供本文所述的任何t7rnap变体。在一些实施方案中，试剂盒包含本文提供的t7rnap变体。在一些实施方案中，试剂盒包含用于表达如本文所述的t7rnap变体的核酸载体。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含至少一种用于进行本文所述方法的试剂，所述方法包括但不限于生成rna的方法、标记的rna探针的方法、制备rna疫苗的方法、聚合核苷酸的方法和用于扩增rna的方法。在一些实施方案中，至少一种试剂包括但不限于核糖核苷三磷酸、反应缓冲剂和dna模板。本文所述的试剂盒可包括一个或多个容器，该容器容纳用于进行本文所述方法的组分和任选地使用指令。本文所述的任何试剂盒可进一步包含进行测定方法所需的组分。试剂盒中的每种组分(若适用的话)可以以液体形式(例如在溶液中)或以固体形式(例如干粉末)提供。在某些情况下，某些组分可以是可重构的或以其它方式可加工的(例如，变为活性形式)，例如，通过添加合适的溶剂或其他物质(例如水或缓冲剂)，它们可以被提供给试剂盒或可以不被提供给试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可任选地包括使用所提供的组分的指令和/或宣传。如本文中所使用的，“指令”可以定义指令和/或宣传的组分，并且通常涉及在本公开的包装上或与本公开的包装相关的书面指令。指令还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明书，以使用户清楚地认识到该说指令将与试剂盒相关联，例如，视听(例如，录像带，dvd等)、互联网和/或基于网络的通信等。书面指令可以为管理药品或生物产品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式，其也可以反映该机构对用于动物施用的制造、使用或销售的批准。如本文所用，“宣传”包括所有经商方式，包括教育、医院和其他临床指导、科学探究、药物发现或开发、学术研究、制药行业活动(包括药品销售)以及任何广告或其他促销活动的方法，包括与本公开相关的任何形式的书面、口头和电子通讯。另外，取决于本文的具体应用，试剂盒可包括其他组分，如本文中所述。试剂盒可在一个或多个容器中含有本文所述的任何一种或多种组分。可以无菌制备组分，包装在注射器中并冷藏运输。或者，可以将其容纳在小瓶或其他容器中以进行存储。第二容器可具有无菌制备的其他组分。或者，试剂盒可包括预先混合并在小瓶、管或其他容器中运输的活性剂。试剂盒可以具有多种形式，例如泡罩小袋、收缩包装的小袋、真空密封的小袋、可密封的热成型托盘或类似的小袋或托盘形式，其中小袋、一个或多个管、容器、盒或袋内松散包装附件。在添加附件之后，可以对试剂盒进行消毒，从而允许以其它方式打开容器中的各个附件。可以使用任何适当的灭菌技术对试剂盒进行灭菌，例如辐射灭菌、热灭菌或本领域已知的其他灭菌方法。取决于特定应用，试剂盒还可以包括其他组分，例如，容器、细胞培养基，盐，缓冲剂，试剂，注射器，针，诸如纱布的织物，用于施加或去除消毒剂，一次性手套，施用前药剂的支持物，等等。实施例为了可以更充分地理解本文所述的发明，阐述了以下实施例。提供本申请中描述的实施例以阐述本文提供的方法和组合物，并且不以任何方式解释为限制其范围。实施例1：t7rna聚合酶变体本公开内容提供了t7rna聚合酶变体，例如来自一种或多种生物体的rna聚合酶蛋白，其包含如本文所述的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，rna聚合酶蛋白的下文由点鉴定的至少一个氨基酸残基可以被突变。在一些实施方案中，seqidno:1提供的氨基酸序列的i320、i396、f546、s684和g788残基，或seqidno:11-15提供的任何氨基酸序列中的相应突变被突变。比对来自各种物种的许多rna聚合酶序列，以证明可以在其他rna聚合酶蛋白中鉴定seqidno:1的i320、i396、f546、s684和g788的相应同源氨基酸残基，从而允许生成具有相应的同源氨基酸残基突变的rna聚合酶变体。使用基于ncbi约束的多重比对工具(cobalt(可于st-va.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt访问)，使用以下参数进行比对，比对参数：缺口罚分-11，-1；结束缺口罚分-5，-1。cdd参数：使用rpsblast开启；blaste值0.003；查找保守列并重新计算开启；查询聚类参数：使用查询聚类开启；字大小4；最大聚类距离0.8；常规字母。下面提供了四个rna聚合酶序列的示例性比对。比对中的rna聚合酶序列为：(t7)：来自噬菌体t7的野生型t7rna聚合酶，genbank：fj881694.1，seqidno:1；和(t3)：来自噬菌体t3的rna聚合酶，ncbi参考序列：np_523301.1，seqidno:11；(sp6)来自噬菌体sp6的rna聚合酶，uniprot：p06221，seqidno:12；和(fe44)来自欧文氏菌噬菌体fe44的rna聚合酶，ncbi参考序列：yp_008766719.1，seqidno:13。野生型t7rna聚合酶中的氨基酸残基i320、i396、f546、s684和g788和比对的序列中的同源氨基酸在氨基酸残基上方用点鉴定。比对证明了通过使用本领域已知的比对程序和算法鉴定与t7rna聚合酶氨基酸序列或t7rna聚合酶残基比对的氨基酸序列或残基，可以跨rna聚合酶序列(包括但不限于来自不同物种的rna聚合酶序列)鉴定与t7rna聚合酶氨基酸序列或氨基酸残基同源的氨基酸序列和氨基酸残基。本公开内容提供了rna聚合酶变体，其中seqidno:11-13中的由点鉴定的一个或多个氨基酸残基(例如分别为t3、sp6和fe44)被突变，如本文所述。对应于seqidno:11-13中由点鉴定的残基的seqidno:1的t7rna聚合酶中的残基i320、i396、f546、s684和g788在本文中被称为“同源”或“相应”残基。可以通过例如如上所述的序列比对，以及通过鉴定与t7rna聚合酶序列或残基比对的序列或残基来鉴定此类同源残基。类似地，对应于本文seqidno:1中鉴定的突变，例如seqidno:1中残基i320、i396、f546、s684和g788的突变的t7rna聚合酶序列中的突变在本文中称为“同源的”或“相应”突变。例如，对应于上述比对序列的seqidno:1中的位置i320处的氨基酸取代的氨基酸取代是t3的v321，sp6的i293和fe44的v320。来自不同物种的rna聚合酶序列是本领域已知的。可以如本文中针对本领域已知的rna聚合酶序列所描述的，鉴定与seqidno:1的t7rna聚合酶中的残基i320、i396、f546、s684和g788对应的氨基酸残基。根据本公开内容，可以使用任何鉴定的rna聚合酶序列。实施例2：使用野生型t7rna聚合酶或热稳定的t7rna聚合酶变体进行的无细胞rna合成材料和方法变体聚合酶的克隆使用引物通过定点诱变创建突变。表1中显示了本文所述的t7rna聚合酶变体中的突变。使用特异性引物和天然t7rna聚合酶(uniprotp00573)作为模板，通过重叠pcr反应生成聚合酶的变体形式。此外，在通过定制引物的pcr步骤期间将六个组氨酸残基在n端引入这些变体聚合酶中以便于纯化蛋白质。使用nhei和hindiii限制酶将获得的pcr产物克隆到载体pbad24中。对于每个个体突变都进行此类过程。使用预先存在的变体作为pcr模板重复此过程，以生成超过一个突变。对每种变体聚合酶进行测序，以确保纯化后在dna水平以及蛋白质水平上的准确性。还对野生型t7rna聚合酶添加his标签，并且类似地在pbad24中克隆，以充当天然活性的对照。表1：突变体t7rna聚合酶变体。突变体#突变m1ile320leu,ile396leu,phe546trp,ser684ala,gly788alam2ile320leu,ile396leu,gly788alam3ile396leu,ser684ala,gly788alam4ile320leu,ser684ala,gly788ala蛋白质表达和细胞生长将携带不同的带有his标签的变体聚合酶序列的质粒转化到缺乏染色体t7rnap的大肠杆菌bl21菌株中，以生成用于蛋白质表达的宿主菌株。使用对luriabroth(含羧苄青霉素抗生素)的1％接种物将转化的大肠杆菌菌株在250rpm的恒定搅拌下于37℃培养。当od600达到0.6时，用0.2％阿拉伯糖诱导培养物4小时。诱导4小时结束时，通过离心收集培养物，并将收集的生物质保持在-80℃冷冻以备将来测试。在诱导之前和研究结束时收集样品，用于sds-page分析(以验证蛋白质表达)和od600测定。培养基、化学品和缓冲剂使用luriabroth(sigmaaldrich)进行细胞培养(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物和5g/lnacl)。为了进行蛋白质纯化，将1x洗涤缓冲剂(20mm磷酸钠、500mmnacl、40mm咪唑，ph7.4)用于重悬生物质、柱平衡和清洗柱。所用洗脱缓冲剂的组成如下：20mm磷酸钠，500mmnacl，750mm咪唑，ph7.4。所用2x透析缓冲剂的组成如下：2xpbs，5mmdtt，0.01％tritonx100。为了进行热稳定性/活性测试，使用了以下市售的化学品/试剂：核糖核苷酸溶液(atp/gtp/ctp/utp)；亚精胺；mgso4，高稳定性无机焦磷酸酶(tipp)。10x反应缓冲剂(10xrb)的组成如下：300mmmgso4、20mm亚精胺。淬灭缓冲剂的组成如下：20mmtris-hclph8.0，10mmedtaph8。淬灭反应后，使用dna酶i除去背景dna模板。在进行琼脂糖凝胶电泳时使用rna加载染料(2x)。使用的dna模板是带有编码序列(524bp)的线性质粒。粗裂解物的生成和蛋白质纯化为了纯化目标蛋白，首先将生物质裂解，然后澄清生成的粗裂解物，并用于纯化目标靶蛋白。为了生成粗裂解物，首先将生物质重悬于1x洗涤缓冲剂中，然后使用高压均质化裂解。裂解后，将粗裂解物在4℃下于15,000g离心60分钟。离心后，将上清液(澄清的裂解物)弃去并用于纯化。使用澄清的裂解物进行使用fplc(aktaprimeplus)，采用离子交换/梯度洗脱方案的基于ni离子亲和层析的纯化。从gehealthcare购买1mlhis柱。上面列出了所有使用的缓冲剂。纯化后，将蛋白质透析过夜达16小时，结束时使用50％甘油(终浓度)将蛋白质储存在-20℃。活性和热稳定性测试使用ivt反应混合物(本文所述)通过体外转录(ivt)反应进行突变体聚合酶的活性测试。候选突变体聚合酶的活性测试在37℃–54℃之间进行。反应在pcr板上以25μl量级建立，并使用热循环仪在测试温度下孵育2小时。此后，将反应淬灭并加工以进行下游分析。表2中描述了ivt反应混合物。表2：ivt反应混合物的组成(25μl)。ivt反应混合物终浓度无核酸酶的水n/antp混合物(mm)4反应缓冲剂(mgso4/亚精胺)(mm)(30/2)dna模板(ng/μl)100t7rnap候选物(mg/ml)0.012焦磷酸盐(tipp)(2000u/ml储液)40为了在2小时后淬灭反应，将2.5μldna酶i添加到反应，并在37℃下孵育30分钟以除去背景模板。接下来，向混合物中加入22.5μl水。该混合物充当淬灭的反应混合物，并用于下游分析，用于通过琼脂糖凝胶电泳或通过hplc进行rna产物验证/定量。对于琼脂糖凝胶电泳，从淬灭的反应混合物中取出5μl，然后添加到10μl的淬灭缓冲剂，并在pcr板中充分混合。接下来，加入15μl2xrna染料，并将该混合物在热循环仪中于70℃加热10分钟。然后将约10μl的该混合物在sybrsafe染色的2％琼脂糖凝胶上以140v运行60分钟，然后成像。通过改编的rnaswift提取方案纯化反应中合成的rna，并使用反相离子对层析进行定量(nwokeji,a.o.,kilby,p.m.,portwood,d.e.,&dickman,m.j.(2016).rnaswift:arapid,versatilernaextractionmethodfreefromphenolandchloroform.analyticalbiochemistry,512,36-46)。纯化产物的hplc分析为了定量dsrna，进行固相提取方案以除去不需要的蛋白质。主要的分离机理是反相离子对层析。使用二极管阵列检测器在260nm处测量信号。通过相对于内部标准品响应将面积标准化，可以针对可以已经在提取过程中发生的任何损失校正结果，并根据从外部校准曲线生成的斜率计算浓度。结果为了测试突变体t7rna聚合酶的活性，如本文所述将ivt反应建立2小时，并通过hplc定量生成的rna的量。野生型t7rna聚合酶充当天然t7rna聚合酶活性的参考对照。还包括阴性对照，其中用水代替t7rna聚合酶。从阴性对照反应中未检测到dsrna产物(图1)。如图1所示，m3在37℃–42.3℃生成最多dsrna；随后是m4，直至40.1℃；随后是m2，直至38.5℃。在37℃–46.5℃的范围的温度，m2、m3和m4t7rna聚合酶相对于野生型生成更多的dsrna。而m1t7rna聚合酶在42.3℃–46.5℃的范围的温度相对于野生型生成更多的dsrna。表3指示相对于野生型聚合酶，dsrna滴度的增加倍数。表4指示突变体和野生型t7rna聚合酶的平均dsrna滴度(ng/μl)。表3：由m1、m2、m3和m4t7rna聚合酶得到的相对于wt的dsrna滴度的倍数增加。表4：在25μl系统(n＝3)中在反应温度下孵育2小时后来自突变体和野生型t7rna聚合酶的平均dsrna滴度(ng/μl)。确定的是，wt直至40.1℃仍保留90％的其活性，并且在42.3℃时相对于其最大值仅具有12％的活性。wt聚合酶在44.5℃和更高温度下失去活性。相对于野生型对照，dsrna滴度的增加倍数示于表3。看出的是在42.3℃，m1相对于野生型具有增加5.3倍的滴度。相对于野生型聚合酶，m2、m3和m4在所有测试温度均生成更大量的rna。在42.3℃，m2、m3、m4比野生型蛋白质生成大8.9、13.3和9.5倍的rna量。如图2所示，m1-m4相对于wt具有改善的热稳定性。推测候选t7rna聚合酶的热稳定性如下：m3>m2>m1>m4>wt。可以看出，野生型聚合酶在42.3℃时相对于其最大值生成约12％的rna(212.42ng/μl)，并且在44.5℃或更高温度相对于其在38.5℃时的最大值(1808.9ng/μl)不生成任何rna。序列来自噬菌体t7的野生型t7rna聚合酶(genbank:fj881694.1/uniprotp00573)mntiniakndfsdielaaipfntladhygerlareqlalehesyemgearfrkmferqlkagevadnaaakplittllpkmiarindwfeevkakrgkrptafqflqeikpeavayitikttlacltsadnttvqavasaigraiedearfgrirdleakhfkknveeqlnkrvghvykkafmqvveadmlskgllggeawsswhkedsihvgvrciemliestgmvslhrqnagvvgqdsetielapeyaeaiatragalagispmfqpcvvppkpwtgitgggywangrrplalvrthskkalmryedvympevykainiaqntawkinkkvlavanvitkwkhcpvedipaiereelpmkpedidmnpealtawkraaaavyrkdkarksrrislefmleqankfanhkaiwfpynmdwrgrvyavsmfnpqgndmtkglltlakgkpigkegyywlkihgancagvdkvpfperikfieenhenimacaksplentwwaeqdspfcflafcfeyagvqhhglsyncslplafdgscsgiqhfsamlrdevggravnllpsetvqdiygivakkvneilqadaingtdnevvtvtdentgeisekvklgtkalagqwlaygvtrsvtkrsvmtlaygskefgfrqqvledtiqpaidsgkglmftqpnqaagymakliwesvsvtvvaaveamnwlksaakllaaevkdkktgeilrkrcavhwvtpdgfpvwqeykkpiqtrlnlmflgqfrlqptintnkdseidahkqesgiapnfvhsqdgshlrktvvwahekygiesfalihdsfgtipadaanlfkavretmvdtyescdvladfydqfadqlhesqldkmpalpakgnlnlrdilesdfafa(seqidno:1)工程化t7rna聚合酶(i320li396lf546ws684ag788a)(变体1)mntiniakndfsdielaaipfntladhygerlareqlalehesyemgearfrkmferqlkagevadnaaakplittllpkmiarindwfeevkakrgkrptafqflqeikpeavayitikttlacltsadnttvqavasaigraiedearfgrirdleakhfkknveeqlnkrvghvykkafmqvveadmlskgllggeawsswhkedsihvgvrciemliestgmvslhrqnagvvgqdsetielapeyaeaiatragalagispmfqpcvvppkpwtgitgggywangrrplalvrthskkalmryedvympevykalniaqntawkinkkvlavanvitkwkhcpvedipaiereelpmkpedidmnpealtawkraaaavyrkdkarksrrlslefmleqankfanhkaiwfpynmdwrgrvyavsmfnpqgndmtkglltlakgkpigkegyywlkihgancagvdkvpfperikfieenhenimacaksplentwwaeqdspfcflafcfeyagvqhhglsyncslplafdgscsgiqhwsamlrdevggravnllpsetvqdiygivakkvneilqadaingtdnevvtvtdentgeisekvklgtkalagqwlaygvtrsvtkrsvmtlaygskefgfrqqvledtiqpaidsgkglmftqpnqaagymakliweavsvtvvaaveamnwlksaakllaaevkdkktgeilrkrcavhwvtpdgfpvwqeykkpiqtrlnlmflgqfrlqptintnkdseidahkqesgiapnfvhsqdashlrktvvwahekygiesfalihdsfgtipadaanlfkavretmvdtyescdvladfydqfadqlhesqldkmpalpakgnlnlrdilesdfafa(seqidno:2)工程化t7rna聚合酶(i320li396lg788a)(变体2)mntiniakndfsdielaaipfntladhygerlareqlalehesyemgearfrkmferqlkagevadnaaakplittllpkmiarindwfeevkakrgkrptafqflqeikpeavayitikttlacltsadnttvqavasaigraiedearfgrirdleakhfkknveeqlnkrvghvykkafmqvveadmlskgllggeawsswhkedsihvgvrciemliestgmvslhrqnagvvgqdsetielapeyaeaiatragalagispmfqpcvvppkpwtgitgggywangrrplalvrthskkalmryedvympevykalniaqntawkinkkvlavanvitkwkhcpvedipaiereelpmkpedidmnpealtawkraaaavyrkdkarksrrlslefmleqankfanhkaiwfpynmdwrgrvyavsmfnpqgndmtkglltlakgkpigkegyywlkihgancagvdkvpfperikfieenhenimacaksplentwwaeqdspfcflafcfeyagvqhhglsyncslplafdgscsgiqhfsamlrdevggravnllpsetvqdiygivakkvneilqadaingtdnevvtvtdentgeisekvklgtkalagqwlaygvtrsvtkrsvmtlaygskefgfrqqvledtiqpaidsgkglmftqpnqaagymakliwesvsvtvvaaveamnwlksaakllaaevkdkktgeilrkrcavhwvtpdgfpvwqeykkpiqtrlnlmflgqfrlqptintnkdseidahkqesgiapnfvhsqdashlrktvvwahekygiesfalihdsfgtipadaanlfkavretmvdtyescdvladfydqfadqlhesqldkmpalpakgnlnlrdilesdfafa(seqidno:3)工程化t7rna聚合酶(i396ls684ag788a)(变体3)mntiniakndfsdielaaipfntladhygerlareqlalehesyemgearfrkmferqlkagevadnaaakplittllpkmiarindwfeevkakrgkrptafqflqeikpeavayitikttlacltsadnttvqavasaigraiedearfgrirdleakhfkknveeqlnkrvghvykkafmqvveadmlskgllggeawsswhkedsihvgvrciemliestgmvslhrqnagvvgqdsetielapeyaeaiatragalagispmfqpcvvppkpwtgitgggywangrrplalvrthskkalmryedvympevykainiaqntawkinkkvlavanvitkwkhcpvedipaiereelpmkpedidmnpealtawkraaaavyrkdkarksrrlslefmleqankfanhkaiwfpynmdwrgrvyavsmfnpqgndmtkglltlakgkpigkegyywlkihgancagvdkvpfperikfieenhenimacaksplentwwaeqdspfcflafcfeyagvqhhglsyncslplafdgscsgiqhfsamlrdevggravnllpsetvqdiygivakkvneilqadaingtdnevvtvtdentgeisekvklgtkalagqwlaygvtrsvtkrsvmtlaygskefgfrqqvledtiqpaidsgkglmftqpnqaagymakliweavsvtvvaaveamnwlksaakllaaevkdkktgeilrkrcavhwvtpdgfpvwqeykkpiqtrlnlmflgqfrlqptintnkdseidahkqesgiapnfvhsqdashlrktvvwahekygiesfalihdsfgtipadaanlfkavretmvdtyescdvladfydqfadqlhesqldkmpalpakgnlnlrdilesdfafa(seqidno:4)工程化t7rna聚合酶(i320ls684ag788a)(变体4)mntiniakndfsdielaaipfntladhygerlareqlalehesyemgearfrkmferqlkagevadnaaakplittllpkmiarindwfeevkakrgkrptafqflqeikpeavayitikttlacltsadnttvqavasaigraiedearfgrirdleakhfkknveeqlnkrvghvykkafmqvveadmlskgllggeawsswhkedsihvgvrciemliestgmvslhrqnagvvgqdsetielapeyaeaiatragalagispmfqpcvvppkpwtgitgggywangrrplalvrthskkalmryedvympevykalniaqntawkinkkvlavanvitkwkhcpvedipaiereelpmkpedidmnpealtawkraaaavyrkdkarksrrislefmleqankfanhkaiwfpynmdwrgrvyavsmfnpqgndmtkglltlakgkpigkegyywlkihgancagvdkvpfperikfieenhenimacaksplentwwaeqdspfcflafcfeyagvqhhglsyncslplafdgscsgiqhfsamlrdevggravnllpsetvqdiygivakkvneilqadaingtdnevvtvtdentgeisekvklgtkalagqwlaygvtrsvtkrsvmtlaygskefgfrqqvledtiqpaidsgkglmftqpnqaagymakliweavsvtvvaaveamnwlksaakllaaevkdkktgeilrkrcavhwvtpdgfpvwqeykkpiqtrlnlmflgqfrlqptintnkdseidahkqesgiapnfvhsqdashlrktvvwahekygiesfalihdsfgtipadaanlfkavretmvdtyescdvladfydqfadqlhesqldkmpalpakgnlnlrdilesdfafa(seqidno:5)工程化t7rna聚合酶(i320l)mntiniakndfsdielaaipfntladhygerlareqlalehesyemgearfrkmferqlkagevadnaaakplittllpkmiarindwfeevkakrgkrptafqflqeikpeavayitikttlacltsadnttvqavasaigraiedearfgrirdleakhfkknveeqlnkrvghvykkafmqvveadmlskgllggeawsswhkedsihvgvrciemliestgmvslhrqnagvvgqdsetielapeyaeaiatragalagispmfqpcvvppkpwtgitgggywangrrplalvrthskkalmryedvympevykalniaqntawkinkkvlavanvitkwkhcpvedipaiereelpmkpedidmnpealtawkraaaavyrkdkarksrrislefmleqankfanhkaiwfpynmdwrgrvyavsmfnpqgndmtkglltlakgkpigkegyywlkihgancagvdkvpfperikfieenhenimacaksplentwwaeqdspfcflafcfeyagvqhhglsyncslplafdgscsgiqhfsamlrdevggravnllpsetvqdiygivakkvneilqadaingtdnevvtvtdentgeisekvklgtkalagqwlaygvtrsvtkrsvmtlaygskefgfrqqvledtiqpaidsgkglmftqpnqaagymakliwesvsvtvvaaveamnwlksaakllaaevkdkktgeilrkrcavhwvtpdgfpvwqeykkpiqtrlnlmflgqfrlqptintnkdseidahkqesgiapnfvhsqdgshlrktvvwahekygiesfalihdsfgtipadaanlfkavretmvdtyescdvladfydqfadqlhesqldkmpalpakgnlnlrdilesdfafa(seqidno:6)工程化t7rna聚合酶(i396l)mntiniakndfsdielaaipfntladhygerlareqlalehesyemgearfrkmferqlkagevadnaaakplittllpkmiarindwfeevkakrgkrptafqflqeikpeavayitikttlacltsadnttvqavasaigraiedearfgrirdleakhfkknveeqlnkrvghvykkafmqvveadmlskgllggeawsswhkedsihvgvrciemliestgmvslhrqnagvvgqdsetielapeyaeaiatragalagispmfqpcvvppkpwtgitgggywangrrplalvrthskkalmryedvympevykainiaqntawkinkkvlavanvitkwkhcpvedipaiereelpmkpedidmnpealtawkraaaavyrkdkarksrrlslefmleqankfanhkaiwfpynmdwrgrvyavsmfnpqgndmtkglltlakgkpigkegyywlkihgancagvdkvpfperikfieenhenimacaksplentwwaeqdspfcflafcfeyagvqhhglsyncslplafdgscsgiqhfsamlrdevggravnllpsetvqdiygivakkvneilqadaingtdnevvtvtdentgeisekvklgtkalagqwlaygvtrsvtkrsvmtlaygskefgfrqqvledtiqpaidsgkglmftqpnqaagymakliwesvsvtvvaaveamnwlksaakllaaevkdkktgeilrkrcavhwvtpdgfpvwqeykkpiqtrlnlmflgqfrlqptintnkdseidahkqesgiapnfvhsqdgshlrktvvwahekygiesfalihdsfgtipadaanlfkavretmvdtyescdvladfydqfadqlhesqldkmpalpakgnlnlrdilesdfafa(seqidno:7)工程化t7rna聚合酶(f546w)mntiniakndfsdielaaipfntladhygerlareqlalehesyemgearfrkmferqlkagevadnaaakplittllpkmiarindwfeevkakrgkrptafqflqeikpeavayitikttlacltsadnttvqavasaigraiedearfgrirdleakhfkknveeqlnkrvghvykkafmqvveadmlskgllggeawsswhkedsihvgvrciemliestgmvslhrqnagvvgqdsetielapeyaeaiatragalagispmfqpcvvppkpwtgitgggywangrrplalvrthskkalmryedvympevykainiaqntawkinkkvlavanvitkwkhcpvedipaiereelpmkpedidmnpealtawkraaaavyrkdkarksrrislefmleqankfanhkaiwfpynmdwrgrvyavsmfnpqgndmtkglltlakgkpigkegyywlkihgancagvdkvpfperikfieenhenimacaksplentwwaeqdspfcflafcfeyagvqhhglsyncslplafdgscsgiqhwsamlrdevggravnllpsetvqdiygivakkvneilqadaingtdnevvtvtdentgeisekvklgtkalagqwlaygvtrsvtkrsvmtlaygskefgfrqqvledtiqpaidsgkglmftqpnqaagymakliwesvsvtvvaaveamnwlksaakllaaevkdkktgeilrkrcavhwvtpdgfpvwqeykkpiqtrlnlmflgqfrlqptintnkdseidahkqesgiapnfvhsqdgshlrktvvwahekygiesfalihdsfgtipadaanlfkavretmvdtyescdvladfydqfadqlhesqldkmpalpakgnlnlrdilesdfafa(seqidno:8)工程化t7rna聚合酶(s684a)mntiniakndfsdielaaipfntladhygerlareqlalehesyemgearfrkmferqlkagevadnaaakplittllpkmiarindwfeevkakrgkrptafqflqeikpeavayitikttlacltsadnttvqavasaigraiedearfgrirdleakhfkknveeqlnkrvghvykkafmqvveadmlskgllggeawsswhkedsihvgvrciemliestgmvslhrqnagvvgqdsetielapeyaeaiatragalagispmfqpcvvppkpwtgitgggywangrrplalvrthskkalmryedvympevykainiaqntawkinkkvlavanvitkwkhcpvedipaiereelpmkpedidmnpealtawkraaaavyrkdkarksrrislefmleqankfanhkaiwfpynmdwrgrvyavsmfnpqgndmtkglltlakgkpigkegyywlkihgancagvdkvpfperikfieenhenimacaksplentwwaeqdspfcflafcfeyagvqhhglsyncslplafdgscsgiqhfsamlrdevggravnllpsetvqdiygivakkvneilqadaingtdnevvtvtdentgeisekvklgtkalagqwlaygvtrsvtkrsvmtlaygskefgfrqqvledtiqpaidsgkglmftqpnqaagymakliweavsvtvvaaveamnwlksaakllaaevkdkktgeilrkrcavhwvtpdgfpvwqeykkpiqtrlnlmflgqfrlqptintnkdseidahkqesgiapnfvhsqdgshlrktvvwahekygiesfalihdsfgtipadaanlfkavretmvdtyescdvladfydqfadqlhesqldkmpalpakgnlnlrdilesdfafa(seqidno:9)工程化t7rna聚合酶(g788a)mntiniakndfsdielaaipfntladhygerlareqlalehesyemgearfrkmferqlkagevadnaaakplittllpkmiarindwfeevkakrgkrptafqflqeikpeavayitikttlacltsadnttvqavasaigraiedearfgrirdleakhfkknveeqlnkrvghvykkafmqvveadmlskgllggeawsswhkedsihvgvrciemliestgmvslhrqnagvvgqdsetielapeyaeaiatragalagispmfqpcvvppkpwtgitgggywangrrplalvrthskkalmryedvympevykainiaqntawkinkkvlavanvitkwkhcpvedipaiereelpmkpedidmnpealtawkraaaavyrkdkarksrrislefmleqankfanhkaiwfpynmdwrgrvyavsmfnpqgndmtkglltlakgkpigkegyywlkihgancagvdkvpfperikfieenhenimacaksplentwwaeqdspfcflafcfeyagvqhhglsyncslplafdgscsgiqhfsamlrdevggravnllpsetvqdiygivakkvneilqadaingtdnevvtvtdentgeisekvklgtkalagqwlaygvtrsvtkrsvmtlaygskefgfrqqvledtiqpaidsgkglmftqpnqaagymakliwesvsvtvvaaveamnwlksaakllaaevkdkktgeilrkrcavhwvtpdgfpvwqeykkpiqtrlnlmflgqfrlqptintnkdseidahkqesgiapnfvhsqdashlrktvvwahekygiesfalihdsfgtipadaanlfkavretmvdtyescdvladfydqfadqlhesqldkmpalpakgnlnlrdilesdfafa(seqidno:10)来自噬菌体t3的rna聚合酶(ncbi参考序列：np_523301.1)mniieniekndfseielaaipfntladhygsalakeqlalehesyelgerrflkmlerqakageiadnaaakpllatllpklttrivewleeyaskkgrkpsayaplqllkpeasafitlkvilasltstnmttiqaaagmlgkaiedearfgrirdleakhfkkhveeqlnkrhgqvykkafmqvveadmigrgllggeawsswdkettmhvgirliemliestglvelqrhnagnagsdhealqlaqeyvdvlakragalagispmfqpcvvppkpwvaitgggywangrrplalvrthskkglmryedvympevykavnlaqntawkinkkvlavvneivnwkncpvadipslerqelppkpddidtneaalkewkkaaagiyrldkarvsrrislefmleqankfaskkaiwfpynmdwrgrvyavpmfnpqgndmtkglltlakgkpigeegfywlkihgancagvdkvpfperiafiekhvddilacakdpinntwwaeqdspfcflafcfeyagvthhglsyncslplafdgscsgiqhfsamlrdevggravnllpsetvqdiygivaqkvneilkqdaingtpnemitvtdkdtgeiseklklgtstlaqqwlaygvtrsvtkrsvmtlaygskefgfrqqvlddtiqpaidsgkglmftqpnqaagymakliwdavsvtvvaaveamnwlksaakllaaevkdkktkeilrhrcavhwttpdgfpvwqeyrkplqkrldmiflgqfrlqptintlkdsgidahkqesgiapnfvhsqdgshlrmtvvyahekygiesfalihdsfgtipadagklfkavretmvityenndvladfysqfadqlhetqldkmpplpkkgnlnlqdilksdfafa(seqidno:11)来自噬菌体sp6的rna聚合酶(uniprot:p06221)mqdlhaiqlqleeemfnggirrfeadqqrqiaagsesdtawnrrllseliapmaegiqaykeeyegkkgrapralaflqcvenevaayitmkvvmdmlntdatlqaiamsvaeriedqvrfskleghaakyfekvkkslkasrtksyrhahnvavvaeksvaekdadfdrweawpketqlqigttlleilegsvfyngepvfmramrtyggktiyylqtsesvgqwisafkehvaqlspayapcvipprpwrtpfnggfhtekvasrirlvkgnrehvrkltqkqmpkvykainalqntqwqinkdvlavieevirldlgygvpsfkplidkenkpanpvpvefqhlrgrelkemlspeqwqqfinwkgecarlytaetkrgsksaavvrmvgqarkysafesiyfvyamdsrsrvyvqsstlspqsndlgkallrftegrpvngvealkwfcinganlwgwdkktfdvrvsnvldeefqdmcrdiaadpltftqwakadapyeflawcfeyaqyldlvdegradefrthlpvhqdgscsgiqhysamlrdevgakavnlkpsdapqdiygavaqvvikknalymdaddattftsgsvtlsgtelramasawdsigitrsltkkpvmtlpygstrltcresvidyivdleekeaqkavaegrtankvhpfeddrqdyltpgaaynymtaliwpsisevvkapivamkmirqlarfaakrneglmytlptgfileqkimatemlrvrtclmgdikmslqvetdivdeaammgaaapnfvhghdashliltvcelvdkgvtsiavihdsfgthadntltlrvalkgqmvamyidgnalqklleehevrwmvdtgievpeqgefdlneimdseyvfa(seqidno:12)来自欧文氏菌噬菌体fe44的野生型rna聚合酶(ncbi参考序列：yp_008766719.1)mtnvinapkndfsdianaiqpyniladhygahlaatqleleheahtegekrflkamerqikagefgdnavakpllsslapkfieawntwfteveskrgkrpvaynlvqkvapeaaafitlkvtlacltkeeytnlqsvatkigrsiedelrfgrirdeeakhfknhvqealnkrvgivykkafmqavegkmldagqlqtkwttwtpeesihvgvrmlelligstglvelhrpfagnvekdgeyiqlteqyvdllskragalaaiapmyqpcvvppkpwtspvgggywaagrkplslvrtgskkgleryndvympevykavniaqntpwkinkkvlavvneivnwkhcpvddvpalergelpvkpedidtnevalkawkkaasaiyrkekarvsrrmsmefmlgqankfaqfkaiwfpmnmdwrgrvyavpmfnpqgndmtkglltlakgkpigvdgyywlkihgantagvdkvdfaerikfiednhenimsvaadpiantwwaeqdspfcflafcfeyagvqhhgmnyncslplafdgscsgiqhfsamlrdeiggravnllpskevqdiyrivaervneilkqdvingtdnevetvtnkdtgeiteklklgtkelagqwlaygvtrkvtkrsvmtlaygskeygfrdqvledtiqpaiddgkglmftqpnqaagymakliwnavtvtvvaaveamnwlksaakllaaevkdkktkevlrkrcavhwvtpdgfpvwqeyrkpvqtrlnlmflgqirlqptvntnkdsgidarkqesgiapnfvhsmdgshlrmtvvrsnevygvesfalihdsfgtipadagnlfkavretmvntyeendvladfydqfadqlhesqldkmpempakgsldlqeilksdfafa(seqidno:13)来自克鲁维酵母噬菌体kvp1的rna聚合酶(genbank:acj14548.1)mnvinapkndfsdianaiqpyniladhygaqlaatqleleheahtegekrflkamerqikagefgdnavakpllsslapkfieawntwfteveakrgkrpvaynlvqkvapeaaafitlkvtlacltkeeftnlqsvatkigrsiedelrfgrirdeeakhfknhvqealnkrvgivykkafmqavegkmldagqlqtkwttwtpeesihvgvrmlelligstglvelhrpfagnvekdgeyiqlteqyvdllskragalaaiapmyqpcvvppkpwtspvgggywaagrkplslvrtgskkgleryndvympevykavniaqntpwkinkkvlavvneivnwkhcpvedvpalergelpvkpedidtneaalkawkkaasaiyrkekarvsrrmsmefmlgqankfaqfkaiwfpmnmdwrgrvyavpmfnpqgndmtkglltlakgkpigvdgyywlkihgantagvdkvdfaerikfiddnhenimsvaadpiantwwaeqdspfcflafcfeyagvqhhgmnyncslplafdgscsgiqhfsamlrdevggravnllpskevqdiyrivaervnemlreavingtdnevetvtnkdtgeiteklklgtkelagqwlaygvtrkvtkrsvmtlaygskeygfrdqvledtiqpaiddgkglmftqpnqaagymakliwesvtvtvvaaveamnwlksaakllaaevkdkktkevlrkrcavhwvtpdgfpvwqeykkpvqtrlnlmflgqirlqptvntnkdsgidarkqesgiapnfvhsmdgshlrmtvvrsnevygvesfalihdsfgtipadagnlfkavretmvntyeendvladfyeqfadqlhesqldkmpempakgsldlqeilksdfafa(seqidno:14)来自耶尔森氏菌噬菌体phiyeo3-12的rna聚合酶(uniprot:q9t145)mniieniekndfseielaaipfntladhygsalareqlalehesyelgerrflkmlerqakageiadnaaakpllatllpklttrivewleeyatkkgrkpvayaplqslkpeasafitlkvilasltstnmttiqaaagmlgkaiedearfgrirdleakhfkkhveeqlnkrhgqvykkafmqvveadmigrgllggeawsswdkettmhvgirliemliestglvelqrhnagnagsdhealqlaqeyvdvlakragalagispmfqpcvvppkpwvaitgggywangrrplalvrthskkglmryedvympevykavniaqntawkinkkvlavvneivnwkncpvadipslerqelppkpddidtneaalkewkkaaagiyrldkarvsrrislefmleqankfaskkaiwfpynmdwrgrvyavpmfnpqgndmtkglltlakgkpigeegfywlkihgancagvdkvpfperiafiekhvddilacakdpinntwwaeqdspfcflafcfeyagvahhglsyncslplafdgscsgiqhfsamlrdevggravnllpsetvqdiygivaqkvneilkqdaingtpnemitvtdkdtgeiseklklgtstlaqqwlaygvtrsvtkrsvmtlaygskefgfrqqvlddtiqpaidsgkglmftqpnqaagymakliwdavsvtvvaaveamnwlksaakllaaevkdkktkeilrhrcavhwttpdgfpvwqeyrkplqkrldmiflgqfrlqptintlkdsgidahkqesgiapnfvhsqdgshlrmtvvyahenygiesfalihdsfgtipadagklfkavretmvityenndvladfydqfadqlhetqldkmpplpkkgnlnlqdilksdfafa(seqidno:15)等同方案和范围本领域技术人员将认识到或仅仅使用常规实验就能够确定本文所述的发明的具体实施方案的许多等同方案。本发明的范围不旨在限于上述描述，而是如所附权利要求书中所阐述的。在权利要求书中，冠词诸如“一个”、“一种”和“所述/该”可以表示一个/种或超过一个/种，除非相反指示或根据上下文另外明显的。如果一个、超过一个、或所有的组成员在给定的产品或过程中存在、采用或以其它方式相关，则认为满足在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述，除非相反指示或根据上下文另外明显的。本发明包括组的正好一个成员在给定的产品或过程中存在、采用或与给定的产品或过程以其它方式相关的实施方案。本发明还包括超过一个或所有的组成员在给定的产品或过程中存在、采用或与给定的产品或过程以其它方式相关的实施方案。此外，应理解，本发明涵盖所有变型、组合和置换，其中将来自一个或多个权利要求或说明书的相关部分的一个或多个限制、要素、从句、描述性术语等引入另一个权利要求中。例如，可以将从属于另一个权利要求的任何权利要求修改为包括在从属于同一基本权利要求的任何其他权利要求中找到的一个或多个限制。此外，在权利要求叙述组合物的情况下，应理解包括用于本文公开的任何目的使用该组合物的方法，并且包括根据本文公开的任何制备方法或本领域已知的其他方法制备组合物的方法，除非另外指出或除非对本领域的普通技术人员明显的是会出现矛盾或不一致。在元件以列表呈现，例如以马库什组形式呈现的情况下，应当理解也公开了元件的每个亚组，并且可以从组中除去任何元件。还应注意，术语“包括”旨在是开放的，并允许包括额外的元件或步骤。应当理解，通常，当本发明或本发明的方面被称为包括特定元件、特征、步骤等时，本发明的某些实施方案或本发明的方面由或基本上由此类元件、特征、步骤等组成。为了简单起见，那些实施方案没有用同样的话在本文中具体阐述。因此，对于包括一个或多个元件、特征、步骤等的本发明的每个实施方案，本发明还提供了由或基本上由那些元件、特征、步骤等组成的实施方案。在给出范围的情况下，包括端点。此外，应理解的是，除非另外指出或从上下文和/或本领域普通技术人员的理解中明显的，否则以范围表示的值在本发明的不同实施方案中可以假定所述范围内的任何特定值，至所述范围的下限单位的十分之一，除非上下文另外明确规定。还应理解，除非另外指出或从上下文和/或本领域普通技术人员的理解中明显的，否则以范围表示的值可以假定给定范围内的任何子范围，其中子范围的端点表示的精确度与范围下限单位的十分之一相同。另外，应当理解，本发明的任何具体实施方案可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。在给出范围的情况下，该范围内的任何值可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。本发明的组合物和/或方法的任何实施方案、要素、特征、应用或方面可以从任何一个或多个权利要求中排除。为了简洁起见，本文中未明确阐述排除一个或多个元件、特征、目的或方面的所有实施方案。序列表<110>绿光生物科技股份有限公司<120>t7rna聚合酶变体<130>g0830.70026wo00<140>尚未分配<141>与本文一起<150>us62/655,747<151>2018-04-10<160>15<170>patentinversion3.5<210>1<211>883<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>1metasnthrileasnilealalysasnasppheseraspilegluleu151015alaalailepropheasnthrleualaasphistyrglygluargleu202530ala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