使用I型干扰素和CD40配体的溶瘤病毒或抗原呈递细胞介导的癌症治疗的制作方法

使用i型干扰素和cd40配体的溶瘤病毒或抗原呈递细胞介导的癌症治疗
1.相关申请的交叉引用
2.本申请要求于2018年6月19日提交的美国临时申请号62/687,076 的权益，其通过引用整体并入本文。
3.政府支持
4.本发明是在nci皮肤优秀专科研究项目(nci skin specializedprograms of research excellence)授予的批准号5p50ca168536
‑
03的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。


背景技术：

5.人类肿瘤表达了许多可以被t淋巴细胞(t细胞)识别的蛋白质抗原，从而为癌症免疫治疗提供了潜在的靶点。本发明总体上涉及癌症免疫疗法、细胞疫苗、病毒学、免疫学和医学领域。更具体地说，它涉及用于治疗癌症的树突状细胞疫苗和溶瘤病毒载体。
6.树突状细胞(dc)是抗原呈递细胞(apc)，在启动t细胞依赖性免疫应答中起重要作用。dc疫苗已经显示出治疗某些癌症的希望。但是， fda目前仅批准一种药物sipuleucel
‑
t用于治疗前列腺癌。基于疫苗细胞单独导致t细胞激活的基本原理，各种细胞因子混合物用于激活dc。实际上，dc代表具有不同功能的不同子集。尚不清楚 dc疫苗是否足以诱导强健(robust)的t细胞激活。此外，临床前研究表明，不同的dc子集具有不同的功能，例如与淋巴结中的t细胞激活相比，肿瘤抗原向引流性淋巴结中的转运有所不同。
7.溶瘤病毒是一类具有以下一种或两种作用机制的癌症治疗剂：1)通过在肿瘤细胞中选择性病毒复制杀死肿瘤细胞，导致肿瘤直接裂解；2) 通过释放来自破坏的肿瘤细胞的抗原诱导全身性抗肿瘤免疫。fda在 2015年批准了其第一种溶瘤病毒，talimogene laherparepvec这是一种转基因溶酶疱疹病毒，编码粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子 (gm
‑
csf)，用于局部治疗黑色素瘤。


技术实现要素：

8.本发明的某些实施方式，例如通过编码外源ifnβ和外源cd40
‑
l的组合的一种或多种异源核酸序列，提供了一种apc，例如dc，其表达外源i型ifn和外源cd40
‑
配体(cd40
‑
l，也称为cd154)的组合，例如外源ifnβ和外源cd40配体(cd40
‑
l)的组合。
9.本发明的另一个实施方式，例如通过编码ifnβ和cd40
‑
l的组合的一种或多种异源核酸序列，提供了表达i型ifn和cd40
‑
l的组合的溶瘤病毒。
10.本发明的一个优选实施方式，例如通过编码ifnβ和cd40
‑
l的组合的一种或多种异源核酸序列，提供了表达i型ifn和cd40
‑
l的组合的溶瘤腺病毒。
11.本发明的进一步的实施方式提供了通过施用本文公开的apc(例如 dc)或溶瘤病毒，以及任选地通过向受试者施用检查点抑制剂的组合来治疗受试者的恶性肿瘤的方法。当将本发明的apc如dc施用于受试者时，在施用apc或dc之前也向受试者施用放射治疗。
12.表达i型ifn和cd40
‑
l的组合，例如ifnβ和cd40
‑
l的组合的溶瘤病毒可以在不进行放射治疗的情况下施用。然而，可以通过施用检查点抑制剂来结合施用本文公开的溶瘤病毒。
13.在优选的实施方式中，患有恶性肿瘤的受试者对于使用检查点抑制剂的疗法是难治愈的。
附图说明
14.图1示出了根据本发明的治疗恶性肿瘤的方法的实施方式的示意图。在图1中提及“ifnβ”旨在代表任何的i型ifn。此外，在图1中提及“树突细胞”或“dc”旨在代表任何的apc。
15.图2示出了具有编码cd40
‑
l和ifnβ的双表达盒的溶瘤腺病毒的构建示意图。
16.图3示出了具有由内部核糖体进入位点(ires)分隔的编码cd40
‑
l 和ifnβ的单个表达盒的溶瘤病毒的构建示意图。
17.图4a
‑
4b示出了具有侵袭性b16皮下黑色素瘤的小鼠的肿瘤生长和存活。示出了对照未治疗的小鼠(n＝5)，注射有表达ifnβ(ifnβ) 的树突细胞的小鼠(n＝6)，腺病毒
‑
mem40(mem40)组(n＝6) 和双重药剂施用组(n＝5)。如图所示，在与dc相同的天数注射腺病毒
‑
mem40(每个肿瘤10
10
个病毒颗粒)。(a)示出平均肿瘤生长， (b)示出小鼠存活(肿瘤植入后36天)。与其他治疗组相比，dc
‑
ifnβ和ad
‑
mem40的联合治疗显著降低了肿瘤的生长(t检验；p<0.05)。
18.图5a
‑
5b示出，与仅表达mem40的溶瘤病毒(mem
‑
188)和对照溶瘤腺病毒(对照组oadv，无武装(unarmed)的腺病毒)相比，表达 mem40和ifnβ的溶瘤腺病毒(mem
‑
288)分别具有7倍和100倍的肿瘤杀伤和免疫激活特性。
19.图6a
‑
6b示出表达mem40和ifnβ的溶瘤腺病毒(mem
‑
288)在杀死多种肿瘤类型和癌基因驱动的癌症中是有效的。(a)与在杀死人膀胱、肝脏和胰腺肿瘤中的对照溶瘤腺病毒比较和(b)与在杀死kras 突变型肺肿瘤(hcc44细胞系)中的仅表达mem40的溶瘤腺病毒 (mem
‑
188)比较。
20.图7示出了通过在多种细胞系中表达mem40和ifnβ的溶瘤腺病毒 (mem
‑
288)的mem40和ifnβ双重转基因表达。
21.图8示出了表达mem40和ifnβ的溶瘤病毒的增强的转基因表达和复制。示出了在a549细胞系中用mem
‑
188和mem
‑
288感染后mem40 表达的比较。使用/不使用溶瘤mem
‑
188或mem
‑
288以不同的moi感染细胞2、4和6天。通过facs确定mem40表达。对于facs结果：红线
–
第2天，蓝线
–
第4天，橙线
–
第6天。(a)：未感染的细胞。 (b)：mem
‑
188moi＝100。(c)：mem
‑
188moi＝10。(d)： mem
‑
188moi＝1。(e)：mem
‑
288moi＝100。(f)：mem
‑
288 moi＝10。(g)：mem
‑
288moi＝1。
22.图9示出了与仅表达mem40的溶瘤病毒(mem
‑
188)相比，在用表达mem40和ifnβ的溶瘤腺病毒(mem
‑
288)感染后，a549肺肿瘤细胞系中mem40表达的比较。
23.图10示出了与仅表达mem40的溶瘤病毒(mem
‑
188)相比，感染表达mem40和ifnβ的溶瘤腺病毒(mem
‑
288)后，几种癌细胞系中的溶瘤能力增强。感染3天后，细胞用结晶紫染色。
24.图11示出了与仅表达mem40的溶瘤病毒(mem
‑
188)相比，用表达mem40和ifnβ的溶
瘤腺病毒(mem
‑
288)感染后，几种癌细胞系中 mem40的表达增强。moi＝100时使用/不使用溶瘤mem
‑
188或 mem
‑
288感染细胞3天。通过facs确定在(a)pc9，(b)a549，(c) h23和(d)hcc44细胞系中的mem40表达。对于facs结果：红线＝未染色，蓝线＝未处理，绿线＝mem
‑
188，橙线＝mem
‑
288。
25.图12示出了pdl1在未感染腺病毒的a549细胞系旁观者细胞中的表达。如图所示，在不同moi下使用/不使用溶瘤mem
‑
188或mem
‑
288 感染细胞3天。如图所示，还将mem
‑
188感染与外源ifnβ添加组合。在不表达mem40(即未感染)的细胞中通过facs特异性地确定pdl1 表达。
26.图13示出了载体图谱的一个实施例，描述了表达mem40和ifnβ的溶瘤腺病毒(mem
‑
288)。
27.序列表简述
28.seq id no:1是人野生型干扰素
‑
α的氨基酸序列(uniprotkb参考号 p05014)：
29.malsfsllmavlvlsyksicslgcdlpqthslgnrralillaqmgri shfsclkdrhdfgfpeeefdghqfqkaqaisvlhemiqqtfnlfstedssa aweqsllekfstelyqqlndleacviqevgveetplmnedsilavrkyf qritlyltekkys pcawevvrae imrslsfstn lqkrlrrkd
30.seq id no：2是人野生型干扰素
‑
β的氨基酸序列(uniprotkb参考号 p01574)：
31.mtnkcllqialllcfsttalsmsynllgflqrssnfqcqkllwqln grleyclkdrmnfdipeeikqlqqfqkedaaltiyemlqnifaifrqdsss tgwnetivenllanvyhqinhlktvleeklekedftrgklmsslhlkry ygrilhylkakeyshcawtivrveilrnfyfinrltgylrn
32.seq id no：3是人野生型干扰素
‑
ε的氨基酸序列(uniprotkb参考号 q86wn2)：
33.miikhffgtvlvllasttifsldlkliifqqrqvnqeslkllnklqtls iqqclphrknfllpqkslspqqyqkghtlailhemlqqifslfranisldg weenhtekfliqlhqqleylealmgleaeklsgtlgsdnlrlqvkmyfr rihdylenqdystcawaivqveisrclffvfslteklskqgrplndmkqe lttefrspr
34.seq id no：4是人野生型干扰素
‑
κ的氨基酸序列(uniprotkb参考号 q9p0w0)：
35.mstkpdmiqkclwleilmgifiagtlsldcnllnvhlrrvtwqnlr hlssmsnsfpveclreniafelpqeflqytqpmkrdikkafyemslqafni fsqhtfkywkerhlkqiqigldqqaeylnqcleedknenedmkemken emkpsearvpqlsslelrryfhridnflkekkysdcaweivrveirrcly yfykftalfrrk
36.seq id no：5是人野生型干扰素
‑
ω的氨基酸序列(uniprotkb参考号 p05000)：
37.mallfpllaalvmtsyspvgslgcdlpqnhgllsrntlvllhqmrr ispflclkdrrdfrfpqemvkgsqlqkahvmsvlhemlqqifslfhters saawnmtlldqlhtglhqqlqhletcllqvvgegesagaisspaltlrr yfqgirvylkekkysdcawevvrmeimkslflstnmqerlrskdrdlg ss
38.seq id no：6是人cd40
‑
l的氨基酸序列(uniprotkb参考号p29965)：
39.mietynqtsprsaatglpismkifmylltvflitqmigsalfavylhr rldkiedernlhedfvfmktiqrcntgerslsllnceeiksqfegfvkdim lnkeetkkensfemqkgdqnpqiaahviseasskttsvlqwaekgyytm snnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslclksp grferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvs hgtgftsfgllkl
40.seq id no：7
‑
18是嵌合cd40
‑
l氨基酸序列的实施例。
41.seq id no：19
‑
23是编码嵌合人/小鼠cd40
‑
l的核酸序列。
42.seq id no：24是编码嵌合人/小鼠cd40
‑
l mem40的核酸序列。
43.seq id no：25
‑
30是编码嵌合人/小鼠cd40
‑
l的核酸序列。
具体实施方式
44.本发明提供了1型ifn和cd40
‑
l的组合可以激活apc，例如dc的功能，以促进t细胞激活。特别地，i型ifn和cd40
‑
l的组合可以增强apc，例如dc的交叉启动(cross
‑
priming)功能，以激活cd8 t细胞。因此，在 apc(例如dc)中i型ifn，例如ifn
‑
α(或ifn
‑
α的任何亚型，例如亚型α1，α2，α4，α5，α6，α7，α8，α10，α13，α14，α16，α17或α21)、ifn
‑
β、 ifn
‑
ε、ifn
‑
κ和ifn
‑
ω以及cd40
‑
l的组合的稳定表达，会增强apc或dc 的固有功能，并且还会产生能够有效激活内源性dc的疫苗，从而增强内源性dc激活t细胞的能力。
45.如本文所用，术语“抗原呈递细胞”(apc)是指专业抗原呈递细胞，其选自树突细胞，巨噬细胞和b细胞。在一些实施方式中，apc是dc。在一些实施方式中，apc是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，apc，如dc、巨噬细胞或b细胞，是人细胞。
46.因此，本发明的某些实施方式，例如通过编码外源ifnβ和外源cd40
‑
l 的一种或多种异源核酸序列，提供了apc，例如dc，其表达i型ifn，例如ifnβ，和cd40
‑
l的组合。当与细胞死亡诱导治疗结合时，这种apc疫苗，特别是dc疫苗将诱导有效的全身性t细胞应答。在某些实施方式中， apc，如dc，包括复制缺陷病毒。
47.在某些实施方式中，本发明提供了dc疫苗，其包含具有表达ifnβ和 cd40
‑
l的组合的病毒载体，例如慢病毒的dc。
48.本发明的另外的实施方式，例如通过编码ifnβ和cd40
‑
l的组合的一种或多种异源核酸序列，提供了表达i型ifn(例如，ifn
‑
α，ifn
‑
β，ifn
‑
ε， ifn
‑
κ和ifn
‑
ω)和cd40
‑
l的组合的溶瘤病毒。可以使用任何溶瘤病毒。在一些实施方式中，溶瘤病毒可以是腺病毒、呼吸道肠道病毒、疱疹病毒、小核糖核酸病毒(包括柯萨奇病毒，脊髓灰质炎病毒和塞内卡谷病毒)、副粘病毒(包括麻疹病毒和新城疫病毒(ndv))、细小病毒、弹状病毒(包括水疱性口炎病毒(vsv))或牛痘病毒。优选地，溶瘤病毒具有复制能力。
49.本发明的另外的实施方式提供了通过施用apc(例如dc)或本文公开的溶瘤病毒，并结合通过向受试者施用检查点抑制剂来治疗受试者的恶性肿瘤的方法。当将本发明的apc例如dc施用给受试者时，在施用apc或 dc之前先对受试者施用放射治疗。图1示出了根据本发明的治疗恶性肿瘤的方法的实施方式的示意图(选项1
‑
5)。
50.ifnα可以是由seq id no：1的序列表示的人ifnα。ifnα可以是哺乳动物ifnα，例如小鼠、大鼠、兔、猪、猫、犬或牛ifnα。来自其他哺乳动物的ifnα的其他实施方式是技术人员已知的，并且此类实施方式在本发明的范围内。在某些实施方式中，ifnα具有与人野生型ifnα(例如seq id no： 1的ifnα)80.00％至最高包括99.99％(例如80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的序列同一性。
51.ifnβ可以是由seq id no：2的序列表示的人ifnβ。ifnβ可以是哺乳动物ifnβ，例如小鼠、大鼠、兔、猪、猫、犬或牛ifnβ。来自其他哺乳动物的ifnβ的其他实施方式是技术人员已知的，并且此类实施方式在本发明的范围内。在某些实施方式中，ifnβ具有与人野生型ifnβ(例如seq id no： 2的ifnβ)80.00％至最高包括99.99％(例如80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的序列同一性。在一个特定的实施方式中，ifnβ缺少seq id no：2的前22个氨基酸，任选地，还具有用丝氨酸取代所得的165个氨基
酸肽中的半胱氨酸17。
52.ifnε可以是由seq id no：3的序列表示的人ifnε。ifnε可以是哺乳动物ifnε，例如小鼠、大鼠、兔、猪、猫、犬或牛ifnε。来自其他哺乳动物的ifnε的其他实施方式是技术人员已知的，并且此类实施方式在本发明的范围内。在某些实施方式中，ifnε具有与人野生型ifnε(例如seq id no： 3的ifnε)80.00％至最高包括99.99％(例如80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的序列同一性。
53.ifnκ可以是由seq id no：4的序列表示的人ifnκ。ifnκ可以是哺乳动物ifnκ，例如小鼠、大鼠、兔、猪、猫、犬或牛ifnκ。来自其他哺乳动物的ifnκ的其他实施方式是技术人员已知的，并且此类实施方式在本发明的范围内。在某些实施方式中，ifnκ具有与人野生型ifnκ(例如seq id no： 4的ifnκ)80.00％至最高包括99.99％(例如80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的序列同一性。
54.ifnω可以是由seq id no：5的序列表示的人ifnω。ifnω可以是哺乳动物ifnω，例如小鼠、大鼠、兔、猪、猫、犬或牛ifnω。来自其他哺乳动物的ifnω的其他实施方式是技术人员已知的，并且此类实施方式在本发明的范围内。在某些实施方式中，ifnω具有与人野生型ifnω(例如seq idno：5的ifnω)80.00％至高达包括99.99％(例如80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的序列同一性。
55.cd40
‑
l可以是由seq id no：6的序列表示的人cd40
‑
l。cd40
‑
l可以是哺乳动物cd40
‑
l，例如小鼠、大鼠、兔、猪、猫、犬或牛cd40
‑
l来自其他哺乳动物的cd40
‑
l的其他实施方式是技术人员已知的，并且此类实施方式在本发明的范围内。在某些实施方式中，cd40
‑
l具有与人野生型cd40
‑
l(例如seq id no：6的cd40
‑
l)80.00％至最高包括99.99％(例如80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、91、92、93、94、95、96、 97、98或99％)的序列同一性。
56.cd40
‑
l可以是嵌合cd40
‑
l或非嵌合cd40
‑
l多肽。在一些实施方式中，在本发明的apc如dc或溶瘤病毒中表达的cd40
‑
l是嵌合cd40
‑
l。此类嵌合cd40
‑
l多肽包含来自至少两个不同物种，例如人和小鼠cd40
‑
l 的cd40
‑
l结构域或亚结构域。与天然存在的cd40
‑
l相比，嵌合cd40
‑
l 提供了更高的免疫应答刺激力。适合本发明使用的嵌合cd40
‑
l的实施例在美国专利号7,495,090、7,928,213和8,138,310中公开。这些专利中的每一个均通过引用整体并入本文。
57.在嵌合cd40
‑
l的某些实施方式中，包含人cd40
‑
l的切割位点的 cd40
‑
l的至少一个结构域或亚结构域被非人cd40
‑
l，优选鼠类cd40
‑
l的相应结构域或亚结构域替代。另外，嵌合cd40
‑
l可包含与cd40
‑
l受体结合的人cd40
‑
l的结构域或亚结构域。人cd40
‑
l(seq id no：6)的结构域i至iv对应于seq id no：6的氨基酸部分1
‑
14、14
‑
45、46
‑
110和111
‑
261。基于非人cd40
‑
l与人cd40
‑
l的序列比对，技术人员可以确定非人cd40
‑
l 的结构域i至iv。非人cd40
‑
l的某些结构域位置在美国专利号7,495,090 的表1中提供，其通过引用整体并入本文。
58.在一些实施方式中，嵌合cd40
‑
l包含非人cd40
‑
l的第一亚结构域，其中该亚结构域替代人cd40
‑
l的切割位点，和与cd40
‑
l受体结合的人 cd40
‑
l的第二亚结构域。
59.第一亚结构域可包含非人cd40
‑
l的结构域iv的亚结构域。此外，第一亚结构域可进一步包含非人cd40
‑
l的结构域iii或亚结构域或结构域iii。在某些实施方式中，第一亚结构域替代人cd40
‑
l的切割位点的一部分。在进一步的实施方式中，除了结构域iv或结构
域iv的亚结构域，以及可选地，结构域iii或结构域iii的亚结构域，嵌合cd40
‑
l还包含非人cd40
‑
l的结构域ii或结构域ii的亚结构域。此外，嵌合cd40
‑
l的第一亚结构域可包含非人cd40
‑
l的结构域i或亚结构域或结构域i。因此，在某些嵌合cd40
‑
l 中，第一亚结构域包含非人cd40
‑
l的结构域或结构域i，ii，iii和iv的亚结构域。在优选的实施方式中，非人cd40
‑
l是鼠类cd40
‑
l。
60.在优选的实施方式中，嵌合的人/小鼠cd40配体与人cd40l(seq idno：12)具有92％的氨基酸序列同源性(参见美国专利号7,495,090，通过引用并入本文并在本文中称为“mem40”)。“cd40配体”和“cd40
‑
l”在本文中可以互换使用，并且也可以称为“cd154”。具体而言，结构域i， ii和iii(分别包含该分子的细胞内、膜内和近端细胞外域的区域)已被完全人源化。在包含分子的cd40结合部分的结构域iv中，仅保留了在细胞中最佳cd40配体表达所需的那些鼠结构域。mem40在分子的3'端被完全人源化，在施用到人时，抗体结合中和鼠cd154(cd40配体)的活性。
61.可用于本发明的嵌合cd40
‑
l的非限制性实施例包括以下序列：
62.seq id no:7
63.mietysqpsprsvatglpasmkifmylltvflitqmigsvlfavylhr rldkveeevnlhedfvfikklkrcnkgegslsllnceemrrqfedlvkdi tlnkeekkensfemqrgdedpqiaahvvseansnaasvlqwakkgyyt mksnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnrepssqrpfivglwlk pssgserillkaanthsssqlceqqsvhlggvfelqpgasvfvnvtdpsq vshgtgftsfgllkl
64.seq id no:8:
65.mietynqtsprsaatglpismkifmylltvflitqmigsalfavylhr rldkiedernlhedfvfmktiqrcntgerslsllnceeiksqfegfvkdim lnkeetkkdedpqiaahvvseansnaasvlqwakkgyytmksnlvtle ngkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnrepssqrpfivglwlkpssgserillk aanthsssqlceqqsvhlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsf gllkl
66.seq id no:9:
67.mietysqpsprsvatglpasmkifmylltvflitqmigsvlfavylhr rldkveeevnlhedfvfikklkrcnkgegslsllnceemrrqfedlvkdi tlnkeekkensfemqrgdedpqiaahvvseansnaasvlqwakkgyyt mksnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfivglwlk pssgserillkaanthsssqlceqqsvhlggvfelqpgasvfvnvtdpsq vshgtgftsfgllkl
68.seq id no:10
69.mietynqtsprsaatglpismkifmylltvflitqmigsalfavylhr rldkiedernlhedfvfmktiqrcntgerslsllnceeiksqfegfvkdim lnkeetkkdedpqiaahvvseansnaasvlqwakkgyytmksnlvtle ngkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfivglwlkpssgserill kaanthsssqlceqqsvhlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgfts fgllkl
70.seq id no:11
71.mietysqpsprsvatglpasmkifmylltvflitqmigsvlfavylhr rldkveeevnlhedfvfikklkrcnkgegslsllnceemrrqfedlvkdi tlnkeekkensfemqrgdedpqiaahvvseansnaasvlqwakkgyyt mksnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfivglwlk pssgserillkaanthsssqlceqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqv shgtgftsfgllkl
72.seq id no:12
73.mietynqtsprsaatglpismkifmylltvflitqmigsalfavylhr rldkiedernlhedfvfmktiqrcntgerslsllnceeiksqfegfvkdim lnkeetkkdedpqiaahvvseansnaasvlqwakkgyytmksnlvtle ngkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfivglwlkpssgserill kaanthsssqlceqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsf gllkl
74.seq id no:13
75.mietysqpsprsvatglpasmkifmylltvflitqmigsvlfavylhr rldkveeevnlhedfvfikklkrcnkgegslsllnceemrrqfedlvkdi tlnkeekkensfemqrgdedpqiaahvvseansnaasvlqwakkgyyt mksnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfivglwlk pssgserillkaanthssakpcgqqsihlggvfelqpgascfvnvtdpsqv shgtgftsfgllkl
76.seq id no:14
77.mietynqtsprsaatglpismkifmylltvflitqmigsalfavylhr rldkiedernlhedfvfmktiqrcntgerslsllnceeiksqfegfvkdim lnkeetkkdedpqiaahvvseansnaasvlqwakkgyytmksnlvtle ngkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfivglwlkpssgserill kaanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsf gllkl
78.seq id no:15
79.mietysqpsprsvatglpasmkifmylltvflitqmigsvlfavylhr rldkveeevnlhedfvfikklkrcnkgegslsllnceemrrqfedlvkdi tlnkeekkensfemqrgdedpqiaahvvseansnaasvlqwakkgyyt mksnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnrepssqrpfivglwlk pssgserillkaanthsssqlceqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqv shgtgftsfgllkl
80.seq id no:16
81.mietynqtsprsaatglpismkifmylltvflitqmigsalfavylhr rldkiedernlhedfvfmktiqrcntgerslsllnceeiksqfegfvkdim lnkeetkkdedpqiaahvvseansnaasvlqwakkgyytmksnlvtle ngkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnrepssqrpfivglwlkpssgserillk aanthsssqlceqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfg llkl
82.seq id no:17
83.mietysqpsprsvatglpasmkifmylltvflitqmigsvlfavylhr rldkveeevnlhedfvfikklkrcnkgegslsllnceemrrqfedlvkdi tlnkeekkensfemqrgdedpqiaahvvseansnaasvlqwakkgyyt mksnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnrepssqrpfivglwlk pssgserillkaanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsq vshgtgftsfgllkl
84.seq id no:18
85.mietynqtsprsaatglpismkifmylltvflitqmigsalfavylhr rldkiedernlhedfvfmktiqrcntgerslsllnceeiksqfegfvkdim lnkeetkkdedpqiaahvvseansnaasvlqwakkgyytmksnlvtle ngkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnrepssqrpfivglwlkpssgserillk aanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfg llkl
86.在美国专利7,495,090、7,928,213和8,138,310中公开了编码seq id no： 7至18的嵌合cd40
‑
l的某些核苷酸序列。这些核苷酸序列通过引用并入本文，并且在本文中设想了此类核苷酸序列的使用。
87.本发明的apc或溶瘤病毒可包含编码ifnα的核酸，其中ifnα包括人野生型ifnα(seq id no：1)或具有与人野生型ifnα(例如seq id no： 1的ifnα)80.00％至最高包括
99.99％(例如80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的序列同一性的ifnα。
88.本发明的apc或溶瘤病毒可包含编码ifnβ的核酸，其中ifnβ包括人野生型ifnβ(seq id no：2)或具有与人野生型ifnβ(例如，seq id no： 2的ifnβ)80.00％至最高包括99.99％(例如80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的序列同一性的ifnβ。在一个具体的实施方式中，核苷酸序列编码缺少seq id no：2 的前22个氨基酸，并且任选地，还具有用丝氨酸取代所得的165个氨基酸肽的半胱氨酸17的ifnβ。
89.本发明的apc或溶瘤病毒可包含编码ifnε的核酸，其中ifnε包括人野生型ifnε(seq id no：3)或具有与人野生型ifnε(例如seq id no： 3的ifnε)80.00％至最高包括99.99％(例如80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)序列同一性的ifnε。
90.本发明的apc或溶瘤病毒可包含编码ifnκ的核酸，其中ifnκ包括人野生型ifnκ(seq id no：4)或具有与人野生型ifnκ(例如seq id no： 4的ifnκ)80.00％至最高包括99.99％(例如80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的序列同一性的ifnκ。
91.本发明的apc或溶瘤病毒可包含编码ifnω的核酸，其中ifnω包括人野生型ifnω(seq id no：5)或具有与人野生型ifnω(例如seq id no： 5的ifnω)80.00％至最高包括99.99％(例如80、81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的序列同一性的ifnω。
92.本发明的apc或溶瘤病毒可包含编码cd40
‑
l的核酸，其中所述 cd40
‑
l包括人野生型cd40
‑
l(seq id no：6)或具有与人野生型cd40
‑
l (例如seq id no：6的cd40
‑
l)80.00％至最高包括99.99％(例如80、 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98或99％)的序列同一性的cd40
‑
l。本发明的apc或溶瘤病毒还可以包含编码嵌合cd40
‑
l的核酸，其中嵌合cd40
‑
l具有选自seq id no：7至 18的序列或具有与具有选自seq id no：7至18的序列的嵌合cd40
‑
l 80.00 ％至最高包括99.99％(例如80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的序列同一性的cd40
‑
l。
93.在优选的实施方式中，本发明的apc或溶瘤病毒可包含编码mem40 的核酸。例如，在优选的实施方式中，本发明的apc或溶瘤病毒包含与人 ifnβ(seq id no：2)具有至少80％序列同一性的ifnβ，而cd40
‑
l包含与具有seq id no：12序列的嵌合cd40
‑
l至少80％的序列同一性。
94.编码i型ifn和cd40
‑
l的组合的一种或多种异源核酸序列可以在一种或多种病毒构建体中。病毒构建体的非限制性实施例包括腺病毒构建体、腺相关病毒构建体(aav)、痘病毒构建体、慢病毒构建体、α病毒构建体、疱疹病毒构建体、逆转录病毒构建体、牛痘病毒构建体、水疱性口炎病毒构建体或单纯疱疹病毒构建体。
95.除了编码i型干扰素(例如ifnβ)和cd40
‑
l(嵌合人/小鼠cd40l) 的核酸外，根据本发明的溶瘤病毒还可在其基因组中包括其他修饰。例如，它可以包含插入已经灭活的基因或替代缺失基因的其他dna。溶瘤病毒还可在其中掺入一种或多种启动子，这些启动子赋予病毒增强水平的肿瘤细胞特异性。以这种方式，溶瘤病毒可以使用癌细胞特异性启动子靶
向特定癌症类型。术语“肿瘤细胞特异性启动子”或“肿瘤细胞特异性转录调节序列”或“肿瘤特异性启动子”或“肿瘤特异性转录调节序列”表示在靶癌细胞中的水平高于正常细胞中的水平的转录调节序列、启动子和/或增强子。例如，用于本发明的溶瘤病毒可以受外源添加的调节剂的控制。
96.在优选的实施方式中，溶瘤病毒是腺病毒(ad)。ad是一种大型(约 36kb)dna病毒，可感染人类，但也显示出广泛的宿主范围。从物理上讲，腺病毒是包含双链线性dna基因组的二十面体病毒。人类腺病毒约有50 种血清型，根据分子、免疫学和功能标准分为6个家族。到成年时，实际上每个人都已经感染了更常见的腺病毒血清型，主要影响是感冒类症状。
97.宿主细胞的腺病毒感染导致腺病毒dna在游离状态下得以维持，从而降低了与整合载体相关的潜在基因毒性。此外，腺病毒在结构上是稳定的，并且在广泛扩增后未检测到基因组重排。腺病毒可以感染大多数上皮细胞，而无论其细胞周期阶段如何。迄今为止，腺病毒感染似乎仅与人类的轻度疾病如急性呼吸道疾病有关。
98.腺病毒的感染周期分为两个步骤：早期阶段，其在腺病毒基因组复制的开始之前，并允许产生调节蛋白和涉及病毒dna复制和转录的蛋白，而晚期阶段导致结构蛋白的合成。早期基因分布在分散在腺病毒基因组中的4个区域中，命名为e1至e4(“e”表示“早期”)。早期区域包含至少六个转录单位，每个转录单位具有其自己的启动子。早期基因的表达是受自身调控的，有些基因先于其他基因表达。e1，e2和e4三个区域对于病毒的复制是必不可少的。因此，如果腺病毒在这些功能之一中存在缺陷，则该蛋白质必须以反式提供，否则病毒无法复制。
99.e1早期区域位于腺病毒基因组的5'末端，并包含2个病毒转录单元e1a 和e1b。该区域编码非常早期参与病毒周期的蛋白质，并且对于腺病毒的几乎所有其他基因的表达都是必不可少的。尤其是，e1a转录单元编码一种转录激活其他病毒基因转录的蛋白质，从而诱导e1b，e2a，e2b，e3和e4 区域启动子以及晚期基因的转录。
100.腺病毒通过细胞表面受体进入允许的宿主细胞，然后被内化。与复制周期第一步所需的某些病毒蛋白相关的病毒dna进入受感染细胞的细胞核中，在此处开始转录。腺病毒dna的复制发生在被感染细胞的细胞核中，不需要细胞复制。新的病毒颗粒或病毒粒子被组装，然后从感染的细胞中释放出来，并可以感染其他的允许细胞(permissive cell)。
101.腺病毒是有吸引力的递送系统。本公开的实施方式可以利用可以不含或基本上不含蛋白质、血清和动物来源的组分的制造方法，从而使其适用于广泛的预防性和治疗疫苗产品。
102.如果腺病毒已被突变，使其具有条件复制(在某些条件下具有复制能力)，则病毒复制可能需要辅助细胞。当需要时，辅助细胞系可以衍生自人类细胞，例如人类胚胎肾细胞、肌肉细胞、造血细胞或其他人类胚胎间质细胞或上皮细胞。可替代地，辅助细胞可以源自允许人类腺病毒的其他哺乳动物物种的细胞。这样的细胞包括例如vero细胞或其他猴胚胎间质细胞或上皮细胞。在某些方面，辅助细胞系是293。培养宿主和辅助细胞的各种方法可以在本领域中找到，例如(racher,a.j.,fooks,a.r.&griffiths,j.b. biotechnol tech(1995)9:169)。
103.可以使用不同的方法分离腺病毒。最常见的是，在转染ad基因组后，从琼脂糖覆盖
的细胞中分离出腺病毒噬斑，并扩增病毒颗粒进行分析。对于详细的方案，本领域技术人员参考(graham,f.l.,和prevec,l.(1991). manipulation of adenovirus vectors.methods mol biol 7,109
‑
128)。
104.产生腺病毒载体的替代技术包括利用细菌人工染色体(bac)系统，利用包含互补腺病毒序列的两个质粒在reca+细菌菌株中进行体内细菌重组以及酵母人工染色体(yac)系统(pct公开文本95/27071和96/33280，其通过引用并入本文)。
105.作为抗癌剂，开发中的溶瘤病毒类型的范围很广，包括腺病毒(参见 russell等,2012 nat.biotechnol.；30(7):658
–
670；lawler等,2017 jamaoncology；3(6):841
‑
849；choi等,2016,biomedicines；4(3):18；和chiocca和 rabkin,2014 cancer immunol res.2(4):295
‑
300,，其通过引用整体并入本文)。
106.在针对期望的治疗活性的治疗性溶瘤腺病毒的选择或设计中，可以考虑多种生物学特性，包括：通过细胞表面蛋白的自然向性或通过改变腺病毒的基因结构以直接靶向癌细胞来选择性靶向癌细胞进行感染；在癌细胞中选择性复制；病毒发病机制的减弱；增强溶解活性；修饰可导致腺病毒快速清除的抗病毒免疫应答；通过对腺病毒进行遗传修饰以掺入细胞因子、免疫激动剂或免疫检查点阻滞剂，从而改善全身抗肿瘤免疫力。
107.具有复制能力的溶瘤腺病毒载体具有多种特性，使其对于治疗应用是理想的，包括多种的细胞和肿瘤类型的感染性、非
‑
非分裂细胞的感染、基因组整合不足、滴度高、携带转基因的能力、体外和体内的稳定性以及高水平的转基因表达。腺病毒表达载体包括含有腺病毒序列的构建体，所述腺病毒序列足以(a)支持该构建体的包封和(b)最终表达已克隆在其中的重组基因构建体。
108.溶瘤腺病毒生物学特性的调节可影响一系列免疫相互作用，这些相互作用可能对癌症的治疗有益或有害。相互作用取决于特定的肿瘤，疾病的部位和程度，免疫抑制性肿瘤的微环境，溶瘤病毒平台，剂量，时间和递送条件以及个体患者的反应(通常参见aurelian l.“oncolytic viruses asimmunotherapy:progress and remaining challenges”onco.targets ther.2016；9:2627
‑
2637)。例如，已报道腺病毒e3基因的存在可提高体外和体内条件性复制腺病毒的溶瘤潜能(参见suzuki k,alemany r,yamamoto m,和 curiel dt“the presence of the adenovirus e3 region improves the oncolyticpotency of conditionally replicative adenoviruses”clin.cancer res.2002nov；8(11):3348
‑
59)。特别地，e3
‑
11.6kda腺病毒死亡蛋白(adp)被认为是有效细胞死亡所必需的(参见tollefson a,ryerse j,和scaria a,等“thee3
‑
11.6
‑
kda adenovirus death protein(adp)is required for efficient cell death: characterization of cells infected with adp mutants,”virology 1996； 220:152
‑
162)。然而，对于治疗癌症的免疫治疗方法，平衡细胞快速死亡与免疫调节蛋白的充分表达以最佳诱导抗癌免疫反应可能很重要。本公开提供了这种溶瘤腺病毒。
109.57种人腺病毒血清型(hadv
‑
1至57)中任一种的成员均可掺入编码外源分子的异源核酸，例如本文所公开的外源i型ifn和外源cd40
‑
配体。人类ad5在遗传和生物化学上都有很好的特征(genbank m73260；ac 000008)。因此，在一个特定的实施方式中，溶瘤腺病毒是具有复制能力的 ad5血清型或包含ad5组分的杂种血清型。腺病毒可以是野生型菌株，但是可以被遗传修饰以增强肿瘤选择性，例如通过减弱病毒在正常静止细胞内复制的能力而
不影响病毒在肿瘤细胞内复制的能力。本公开内容涵盖的具有复制能力的溶瘤腺病毒的非限制性实施例包括delta
‑
24、delta
‑
24
‑
rgd、 icovir
‑
5、icovir
‑
7、onyx
‑
015、coload1、h101和ad5/3
‑
d24
‑
gmcsf。 onyx
‑
015是病毒血清型ad2和ad5的杂种，在e1b
‑
55k和e3b区域中有缺失以增强癌症的选择性。h101是onyx
‑
015的修改版本。icovir
‑
5和 icovir
‑
7包含e1a的rb结合位点缺失和e2f启动子替换e1a启动子。 coload1是嵌合的add11p/ad3血清型。ad5/3
‑
d24
‑
gmcsf(cgtg
‑
102) 是一种编码gm
‑
csf的血清型5/3衣壳修饰的腺病毒(ad5衣壳蛋白球状突起(knob)由血清型3的球状突起结构域代替)。
110.注射到肿瘤中的溶瘤腺病毒诱导细胞死亡并释放新的腺病毒后代，该新的腺病毒后代通过感染邻近细胞而产生治疗波，如果不停止治疗波，则可能导致肿瘤的完全破坏。
111.在本公开的一些实施方式中，可以将编码i型ifn和cd40
‑
l的异源序列的组合掺入腺病毒的非必需区域中。在本公开的优选实施方式中，腺病毒在e1中包含24个核苷酸的缺失，e1b
‑
55k区域的缺失和e3b区域的缺失以增强癌症选择性。
112.可以出于多种目的而改变病毒区域以赋予所需的治疗性质。治疗性质的非限制性实施例可包括增强的病毒复制和扩散，增强的溶瘤作用，相对于正常细胞肿瘤细胞的优先靶向，增强的免疫激活以及保护病毒不受宿主免疫系统的影响。用于上述目的的病毒区域可以被消除(完全或部分缺失)，使其无功能，被修饰以减弱功能，或被其他序列取代。溶瘤病毒也可以改变为包括编码治疗性蛋白质和/或免疫调节性蛋白质的一种或多种异源基因。在一个特定的实施方式中，溶瘤病毒被修饰以表达ifnβ和cd40
‑
l的组合。
113.任选地，信号肽或编码它们的核酸可以用于所需多肽的表面定位。
114.在优选的实施方式中，如dc的apc是人apc或dc。优选地，从患有恶性肿瘤的人类受试者中分离出apc，例如dc，并对其进行基因修饰以表达外源i型ifn和外源cd40
‑
l的组合，例如通过编码ifnβ和cd40
‑
l 的组合的一种或多种异源核酸序列。在优选的实施方式中，cd40
‑
l是 mem40。
115.溶瘤病毒可以进一步基因修饰以改善一种或多种用于治疗癌症的性质，包括在癌细胞中的选择性复制；病毒发病机制的减弱；增强溶解活性；可导致病毒快速清除的抗病毒免疫应答的修饰；和病毒诱导的全身抗肿瘤免疫力的修饰。
116.在溶瘤病毒具有rna基因组的实施方式中，可以在将基因插入基因组之前使编码i型ifn和cd40
‑
l的基因适于从rna病毒基因组表达。例如，编码i型ifn和cd40
‑
l的基因可以进行尿嘧啶置换胸腺嘧啶，以促进从rna病毒基因组的表达。可能适合于此类实施方式的其他修饰对于本领域普通技术人员将是已知的。
117.包含在用于本公开的载体中的表达盒包含(沿5'至3'方向)可操作地连接至蛋白质编码序列的转录启动子，包括中间序列的剪接信号和转录终止/ 聚腺苷酸化序列。控制真核细胞中蛋白质编码基因转录的启动子和增强子由多种遗传元件组成。细胞机制收集并整合每个元件传达的调控信息，从而允许不同的基因进化出独特的，通常是复杂的转录调控模式。在本公开的上下文中使用的启动子包括组成型、诱导型和组织特异性启动子。
118.i型ifn和cd40
‑
l核酸表达可以受哺乳动物细胞例如人肿瘤细胞中起作用的启动子的控制。在一个实施方式中，指导i型ifn和cd40
‑
l表达的启动子分别是sv启动子和巨细胞病毒(cmv)启动子。
119.本文提供的表达构建体可以包含启动子以驱动编程基因的表达。启动子通常包含
用于定位rna合成起始位点的序列。最好的例子是tata盒，但是在一些缺少tata盒的启动子中，例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和sv40晚期基因的启动子，覆盖起始位点本身的离散元件有助于固定起始的位置。其他启动子元件调节转录起始的频率。这些启动子通常在起始位点上游30至110bp的区域内，尽管已显示启动子在起始位点下游也包含功能性元件。为了使编码序列“处于”启动子的控制之下，将转录阅读框的转录起始位点的5
‑
引物末端定位在所选启动子(即，其3
‑
引物)的下游。“上游”启动子刺激dna的转录并促进编码的rna的表达。
120.启动子元件之间的间隔通常是灵活的，因此当元件相对于彼此反转或移动时，启动子功能得以保留。取决于启动子，似乎单个元件可以协同或独立地起作用以激活转录。启动子可以与“增强子”结合或不结合使用，“增强子”是指与核酸序列的转录激活有关的顺式作用调节序列。
121.启动子可以与核酸序列天然关联，并且可以通过分离位于编码片段和/ 或外显子上游的5
‑
引物非编码序列而获得。这样的启动子可以称为“内源的”。类似地，增强子可以与核酸序列天然关联，位于该序列下游或上游。或者，通过将编码核酸片段置于重组或异源启动子的控制下将获得某些优势，所述重组或异源启动子是指在其天然环境中通常不与核酸序列关联的启动子。重组或异源增强子还指在其天然环境中通常不与核酸序列关联的增强子。此类启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他病毒、原核或真核细胞中分离的启动子或增强子，以及不是“天然存在”的启动子或增强子，即包含不同转录调控区的不同元件，和/或改变表达的突变。
122.可以使用有效地指导在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中dna片段表达的启动子和/或增强子。分子生物学领域的技术人员通常知道使用启动子、增强子和细胞类型组合进行蛋白质表达。所用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、可诱导的、和/或在适当条件下可用于指导导入的dna片段的高水平表达，例如在大规模生产重组蛋白和/或肽中是有利的。启动子可以是异源的或内源的。
123.启动子的非限制性实施例包括早期或晚期病毒启动子，例如sv40早期或晚期启动子，巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子，劳斯肉瘤病毒(rsv) 早期启动子和真核细胞启动子。
124.特定的起始信号也可以用于本公开提供的表达构建体中以有效翻译编码序列。这些信号包括atg起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括atg起始密码子。本领域技术人员将能够很容易提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框“在框内”，以确保整个插入片段的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。可以通过包含适当的转录增强子元件来增强表达效率。
125.在某些实施方式中，使用内部核糖体进入位点(ires)元件来产生多基因或多顺反子信息。ires元件可以绕过5
‑
引物甲基化的帽(cap)依赖性翻译的核糖体扫描模型，并在内部位点开始翻译(pelletier等，1988 molecularand cellular biology)。已经描述了来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的ires元件(pelletier等，1988 molecular and cellularbiology)，以及来自哺乳动物的信息的ires(macejak等，1991 nature)。 ires元件可以链接到异源开放阅读框。可以将多个开放阅读框转录在一起，每个阅读框之间都被一个ires隔开，从而产生多顺反子信息。ires元件使每个开放阅读
框对于核糖体是可接近的，以进行有效翻译。使用单个启动子 /增强子可以有效地表达多个基因以转录单个信息(美国专利号5,925,565和 5,935,819，每个都通过引用并入本文)。在某些实施方式中，通过ires元件连接i型ifn和cd40
‑
l，以有效表达两种基因。
126.本发明的其他实施方式提供了一种组合物，其包含本发明的apc(例如 dc)或溶瘤病毒和药学上可接受的载体或佐剂。
127.如上所述，本发明提供了表达i型ifn和cd40
‑
l的组合的apc，例如 dc，当与诱导细胞死亡的治疗结合时，诱导有效的全身性t细胞应答。还可通过施用表达i型ifn和cd40
‑
l的组合的溶瘤病毒，例如通过编码ifnβ和cd40
‑
l的组合的一种或多种异源核酸序列，来提供这种效果。
128.因此，本发明的某些实施方式提供了一种治疗恶性肿瘤的方法，其包括向需要治疗的受试者施用有效量的本发明的apc(例如dc)或溶瘤病毒，其表达外源i型ifn和外源cd40
‑
l的组合，例如，通过编码ifnβ和cd40
‑
l 的组合的一种或多种异源核酸序列。
129.在优选的实施方式中，在本发明的方法中使用的apc，例如dc是自体 apc，即，分离并修饰来自患有恶性肿瘤的受试者的apc以表达外源i型 ifn和外源cd40
‑
l的组合，例如通过编码ifnβ和cd40
‑
l的组合的一种或多种异源核酸序列，并施用至受试者。但是，apc可以是自体的、同种异体的或异种的。
130.包含i型ifn和cd40
‑
l的组合的本发明的apc，例如dc或溶瘤病毒可以单独施用或与一种或多种其他抗癌剂组合施用。此类药剂包括化学治疗药物(例如美法仑)、免疫调节剂、佐剂、贫血药物(例如促红细胞生成素)、放射疗法、干细胞移植、嵌合抗原受体(car)表达t细胞(car t细胞) 或上述两个或多个的组合。在某些实施方式中，在施用apc(例如dc)或溶瘤病毒之前、期间或之后施用此类疗法。
131.仅当存在大量肿瘤抗原时才能观察到本发明的apc，例如dc的最佳活性。在接受放射治疗(ir)的人类癌症患者中观察到的现象是远位效应 (abscopal effect)，其中ir可以诱导放射区域外的肿瘤消退。远位效应基于ir诱导的细胞死亡导致肿瘤抗原释放后的t细胞激活。这种效应的稀有性可能是因为dc和t细胞激活所需的必要信号不是仅由ir提供的。人们认为，这种远位效应是基于通过ir导致诱导抗肿瘤t细胞免疫应答而释放肿瘤抗原，但是使这种远位效应更普遍以使更多患者受益的方法尚不知道。本发明提供了辐射本身可能不是足够强的导致dc激活和抗原呈递的先天免疫的激活剂。因此，本发明提供了先天免疫刺激物的外源给药将增强抗肿瘤 t细胞应答，从而导致更大的远位效应。
132.一种这样的先天免疫刺激物是apc，例如dc，其包含i型ifn和cd40
‑
l 的组合，例如，慢病毒转导的apc，例如dc，表达高水平的ifnβ和cd40
‑
l 的组合的疫苗，其调节apc(例如dc)的激活。本文公开的apc，例如 dc，可以用于肿瘤内注射。本发明提供了结合ir和包含i型ifn和cd40
‑
l 的组合，例如ifnβ和cd40
‑
l的组合的apc，通过强烈的t细胞激活而产生了有效的抗肿瘤远位效应。当结合检查点阻断疗法(checkpoint blockadetherapy)时，这种治疗特别有效。
133.根据本发明，在被辐射的肿瘤中施用包含i型ifn和cd40
‑
l的组合，例如ifnβ和cd40
‑
l的组合的apc，例如dc，将增强远位效应。
134.因此，在某些治疗受试者恶性肿瘤的方法中，包括对受试者进行放射治疗，然后施用apc，例如dc，其包含外源i型ifn和外源cd40
‑
l的组合，例如ifnβ和cd40
‑
l的组合，例如通
过编码ifnβ和cd40
‑
l的组合的一种或多种异源核酸序列。可以在大约一天至大约七天之内，优选在大约两天至大约六天之内，更优选在大约三至五天之内，甚至更优选在大约四天之内施用apc，例如dc。apc，例如dc可以在几天内多次施用。在进一步的实施方式中，可以在施用辐射后约20至40小时，优选约25至35小时，甚至更优选约30小时，最优选约24小时施用apc，例如dc。
135.施用于受试者的辐射优选是电离辐射，例如x射线，γ射线，氡或其他形式的高能辐射。
136.在某些实施方式中，apc如dc或溶瘤病毒是通过皮内注射施用的，特别是在引流至受试者的腋窝和/或腹股沟淋巴结盆的解剖部位。在其他实施方式中，将apc，例如dc或溶瘤病毒，施用于肿瘤(肿瘤内)或施用于淋巴结，例如受试者的腹股沟淋巴结。在其他实施方式中，通过血管内(例如，静脉内)注射施用apc，例如dc或溶瘤病毒。
137.在一些实施方式中，除了施用放射疗法和apc(例如dc)或施用本发明的溶瘤病毒之外，所述方法还包括对受试者进行造血细胞移植(造血干细胞或祖细胞，例如来自骨髓、外周血或脐带血)。造血细胞移植可以是自体的或同种异体的。可以在造血细胞移植之前和/或之后施用本发明的apc，例如dc或溶瘤病毒。
138.在其他的实施方式中，除了施用放射疗法和apc(例如dc)或施用本发明的溶瘤病毒，以及任选地进行造血细胞移植外，所述方法还包括对受试者进行干细胞动员(例如，使用g
‑
csf)，然后在自体造血细胞移植之前从受试者收集造血细胞。
139.通常，从受试者收集apc，例如dc，根据本发明对其进行修饰并施用于受试者。在施用至受试者之前，可以将apc(例如dc)冷冻保存。
140.在某些实施方式中，所述方法包括在施用本发明的apc(例如dc)或溶瘤病毒之前、期间或之后施用化学治疗剂(例如美法仑)。
141.在某些实施方式中，在施用放射疗法和本发明的apc如dc或溶瘤病毒之后，所述方法还包括向受试者施用检查点抑制剂。
142.某些检查点抑制剂已用于癌症治疗。检查点是指免疫系统中的抑制途径，其负责维持自我耐受并调节免疫系统反应的程度，以最小化对周围组织的损害。肿瘤细胞可以激活免疫系统检查点，从而降低针对肿瘤组织的免疫反应的效力。施用检查点抑制剂可释放对免疫系统的抑制作用，并使免疫系统具有针对肿瘤细胞的活性。示例性的检查点抑制剂包括如针对细胞毒性t 淋巴细胞抗原4(ctla4，也称为cd152)，程序性细胞死亡蛋白1(pd
‑
1，也称为cd279)和程序性细胞死亡1配体1(pd
‑
l1，也称为cd274))的例如抗体的抑制剂。示例性的抗pd
‑
1抗体是可商购的，并且包括派姆单抗 (pembrolizumab)、兰博单抗(lambrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、 amp
‑
224和匹地珠单抗(pidilizumab)。示例性的抗pd
‑
l1抗体也是可商购的，包括阿特珠单抗(atezolizumab)，mdx
‑
1105，medi4736，mpdl3280a， bms
‑
936559和mih1。示例性的抗ctla4抗体包括伊匹单抗(ipilimumab) 和曲美单抗(tremelimumab)。伊匹单抗已获得fda批准用于治疗转移性黑色素瘤(wada等，2013，j transl med 11:89)。检查点蛋白靶标的其他实施例包括但不限于b7
‑
h3、b7
‑
h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、 vista、kir、2b4(属于cd2家族的分子，在所有nk细胞和记忆cd8+t 细胞上均表达)、cd160(也称为by55)、cgen
‑
15049、chk 1和chk2 激酶、a2ar和各种b
‑
7家族配体。抗体的非限制性实施例包括medi0680 (amp
‑
514)、aunp
‑
12、阿维单抗(avelumab)
(msb0010718c)、bms935559 (mdx
‑
1105)、rhigm12b7、bms
‑
986016、gsk2831781、imp321、利瑞鲁单抗(lirilumab)(bms
‑
986015)、iph2101(1
‑
7f9)、吲哚莫德(indoximod) (nlg 9189)、nlg 919、inb024360、pf
‑
05082566、乌瑞芦单抗 (urelumab)(bms
‑
663513)和medi6469。
143.下表1中列出了可以使用的检查点抑制剂的非限制性实施例。
144.表1.检查点抑制剂，类型和靶向分子的示例
[0145][0146]
在一个实施方式中，将两种或更多种检查点抑制剂的组合施用于受试者。在一个
实施方式中，检查点抑制剂的组合选自表1中的那些。两种或多种检查点抑制剂可以相对于彼此同时或相继施用。在另一个实施方式中，两种或更多种检查点抑制剂的组合靶向两种不同的检查点蛋白，例如pd
‑
1(例如，纳武单抗或其他pd
‑
1抑制剂)和ctla
‑
4(例如，伊匹单抗或其他ctla
‑
4 抑制剂)相对于彼此同时或相继施用于受试者。在一个实施方式中，两种或更多种检查点抑制剂的组合靶向以下中的两种或更多种不同的检查点蛋白： ctla
‑
4、pd
‑
l1、pd
‑
l2、pd1、b7
‑
h3、b7
‑
h4、btla、hvem、tim3、 gal9、lag3、vista、kir、2b4、cd160、cgen
‑
15049、chk 1激酶， chk2激酶、a2ar和b
‑
7家族配体。在一个实施方式中，两种或更多种检查点抑制剂的组合靶向表1中的两种或更多种不同的检查点蛋白。
[0147]
可以根据患者的临床表现、疾病的持续时间或病程、合并症和临床护理的其他方面，对检查点抑制剂施用的剂量水平、给药频率、给药持续时间和其他方面进行优化。对于本文所体现的方法的检查点抑制剂成分的特定方面，本发明没有限制。其他检查点抑制剂是技术人员众所周知的，并且此类实施方式在本发明的范围内。
[0148]
可以根据本文公开的材料和方法治疗的癌症的实施例包括但不限于恶性上皮肿瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这种癌症的更具体的例子包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠道癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、腹膜癌、肝癌，例如肝肿瘤、膀胱癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌和甲状腺癌。在一些实施方式中，癌症是黑色素瘤、mds、卵巢癌、乳腺癌或多发性骨髓瘤。
[0149]
癌症的其他非限制性实施例是基底细胞癌、胆道癌、骨癌、脑和中枢神经系统(cns)癌症、绒毛膜癌、结缔组织癌、食道癌、眼癌、头颈部癌症、胃癌、上皮内瘤变、喉癌、淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌(例如，唇，舌，口和咽)、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统癌症、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、泌尿系统癌症，以及其他癌症和肉瘤。表2列出了可以用本发明的组合物和方法治疗的癌症类型的示例。
[0150]
表2癌症类型的示例
[0151]
[0152]
[0153]
[0154]
chem, 2006,13(12):1371
‑
87,和trabulo s等,pharmaceuticals,2010,3:961
‑
993，其通过引用整体并入本文)；病毒体；杂交病毒；噬菌体或基因靶向。
[0160]
带有其他肿瘤抗原的apc(例如dc)疫苗的制备方法及其在癌症免疫疗法中的用途是已知的，可与本文所述的i型ifn和cd40
‑
l结合使用(例如，参见palucka k等，nature reviews cancer,2012,12:265
‑
277，其通过引用整体并入本文)。
[0161]
病毒或非病毒基因递送方法可以用于转导具有编码i型ifn和cd40
‑
l 的组合的一种或多种核酸序列的细胞，例如apc，例如dc。
[0162]
可用于递送核酸序列的病毒载体的实施例包括但不限于腺病毒(av)、腺相关病毒(aav)、痘病毒、慢病毒、α病毒、疱疹病毒、逆转录酶病毒和牛痘病毒。当在apc(如dc)中使用时，该病毒通常复制不足。
[0163]
用于基因递送的非病毒方法包括但不限于裸露的dna注射、无机颗粒、合成或天然可生物降解的颗粒、以及物理方法，例如针头注射、弹道dna 注射、电穿孔、声致穿孔，光穿孔，磁转染，和加氢穿孔(hydroporation)。无机颗粒的实施例包括磷酸钙、二氧化硅、金和磁性颗粒。合成或天然可生物降解颗粒的实施例包括基于聚合物的非病毒载体，例如聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物(plga)、聚乳酸(pla)、聚(乙烯亚胺4)(pei)、壳聚糖、树状聚合物和聚甲基丙烯酸酯；基于阳离子脂质的非病毒载体，例如阳离子脂质体、阳离子乳剂和固体脂质纳米颗粒；以及基于肽的非病毒载体，例如聚l
‑
赖氨酸。
[0164]
任选地，可以将本发明的apc，例如dc或溶瘤病毒与一种或多种其他试剂同时或相继地共同施用给受试者。可以施用的抗癌药包括但不限于表1 和3中列出的那些。
[0165]
可以与本文公开的一种或多种化合物之前和/或之后，同时(以相同或分开的制剂)或相继进行共同施用其他的药剂。
[0166]
因此，本发明的apc，例如dc或溶瘤病毒，无论是单独施用还是作为药物组合物施用，都可以包括各种其他成分。可以在相关情况下使用的可接受组分或辅助剂(adjunct)的实施例包括抗氧化剂、自由基清除剂、肽、生长因子、抗生素、抑菌剂、免疫抑制剂、抗凝剂、缓冲剂、抗炎剂、抗血管生成剂、退热药、定时释放的粘合剂、麻醉剂、类固醇和皮质类固醇。这样的组分可以提供额外的治疗益处，起到影响apc(例如dc)的治疗作用的作用，或者起到防止由于施用化合物而可能引起的任何潜在副作用的作用。
[0167]
可以在体外或体内(例如在受试者中)以相同或分开的制剂被共同施用至靶细胞的添加剂包括改变给定生物学应答的那些试剂，例如免疫调节剂。添加剂可以是例如小分子、多肽(蛋白质，肽或抗体或抗体片段)或核酸(编码多肽或抑制性核酸，例如反义寡核苷酸或干扰rna)。例如，可以施用蛋白质，例如肿瘤坏死因子(tnf)、干扰素(如α
‑
干扰素和β
‑
干扰素)、神经生长因子(ngf)、血小板衍生生长因子(pdgf)和组织纤溶酶原激活剂。生物反应调节剂，例如淋巴因子、白介素(例如白介素1(il
‑
1)、白介素2(il
‑
2)和白介素6(il
‑
6))、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (gm
‑
csf)、粒细胞集落刺激因子(g
‑
csf)或其他生长因子均可施用。在一实施方式中，本发明的方法和组合物掺入一种或多种抗癌剂，例如细胞毒剂、化学治疗剂、抗信号传导剂和抗血管生成剂。
[0168]
在一些实施方式中，本发明的组合物包含至少一种其他抗癌剂(例如化学治疗剂)。在本发明方法的一些实施方式中，至少一种其他的抗癌剂与本发明的组合物一起施用。在一些实施方式中，抗癌剂选自亚磺酰苯胺异羟肟酸(saha)或其他组蛋白脱乙酰酶抑
制剂，三氧化二砷，阿霉素或其他蒽环类dna插入剂，依托泊苷或其他拓扑异构酶ii抑制剂。
[0169]
在一些实施方式中，所述组合物可以包括并且所述方法可以包括施用一种或多种蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)，自噬抑制剂(例如氯喹)，烷基化剂(例如美法仑，环磷酰胺)，mek抑制剂(例如，pd98509)，fak/pyk2 抑制剂(例如，pf562271)或egfr抑制剂(例如，厄洛替尼，吉非替尼，西妥昔单抗，帕尼单抗，扎鲁木单抗，尼妥珠单抗，马妥珠单抗)，或上述两种或多种的组合。
[0170]
因此，免疫治疗剂，无论是单独施用还是作为药物组合物施用，都可以包括各种其他成分作为添加剂。可以在相关情况下使用的可接受组分或辅助剂的实施例包括抗氧化剂、自由基清除剂、肽、生长因子、抗生素、抑菌剂、免疫抑制剂、抗凝剂、缓冲剂、抗炎剂、抗血管生成剂、退热药、定时释放的粘合剂、麻醉剂、类固醇和皮质类固醇。这样的组分可以提供额外的治疗益处，起到影响本发明化合物的治疗作用的作用，或起到防止可能由于施用化合物而引起的任何潜在副作用的作用。免疫治疗剂也可以与治疗剂或其他药剂结合。
[0171]
如本文所用，术语“免疫疗法”是指疾病治疗通过刺激、诱导、颠覆 (subversion)、模仿、增强、增大或任何其他调节受试者免疫系统以引发或放大适应性或先天性免疫(主动或被动)对抗癌性或其他有害的蛋白质、细胞或组织。免疫疗法(即免疫治疗剂)包括癌症疫苗、免疫调节剂、单克隆抗体(例如人源化单克隆抗体)、免疫刺激剂、树突状细胞和病毒疗法，无论是设计用来治疗现有的癌症或预防癌症的发展，还是用于佐剂设置减少癌症复发的可能性。癌症疫苗的例子包括gvax，stimuvax，dcvax和其他设计为引发对肿瘤和其他抗原(包括muc1，ny
‑
eso
‑
1，mage，p53 等)的免疫反应的疫苗。免疫调节剂的例子包括1mt、伊匹单抗、曲美单抗和/或任何设计为抑制或以其他方式调节针对肿瘤或其他抗原的细胞毒性或其他t细胞活性的药物，包括但不限于通过ctla
‑
4、cd80、cd86、mhc、 b7
‑
dc、b7
‑
h1、b7
‑
h2、b7
‑
h3、b7
‑
h4、cd28、其他tcr、pd
‑
1、pdl
‑
1、 icos及其配体通过阻断剂、激动剂或拮抗剂调节t
‑
reg细胞控制途径的治疗。免疫刺激剂的实施例包括皮质类固醇和任何其他抗炎剂或促炎剂，甾体或非甾体，包括但不限于gm
‑
csf、白介素(例如il
‑
2，il
‑
7，il
‑
12)、细胞因子，例如干扰素等。树突细胞(dc)治疗的实施例包括修饰的树突细胞和任何其他自体或异种抗原呈递细胞，无论是被多种抗原、完整癌细胞、单个抗原、还是通过mrna、噬菌体展示或任何其他修饰，包括但不限于离体产生的抗原加载的树突细胞(dc)以诱导抗原特异性t细胞免疫、离体基因加载的dc以诱导体液免疫、离体产生的抗原加载dc以诱导肿瘤特异性免疫、离体产生的未成熟dc以诱导耐受，包括但不限于普列威等。病毒疗法的实施例包括溶瘤病毒或衍生自病毒的遗传或其他设计为引发抗肿瘤免疫力的材料以及与肿瘤发展相关的传染性病毒抑制剂，例如前噬菌体系列药物。单克隆抗体的实施例包括阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、吉妥珠单抗、ozogamicin、利妥昔单抗、曲妥单抗、放射免疫疗法、替伊莫单抗，托西莫单抗/碘托西莫单抗方案。免疫疗法可以是单一疗法，也可以与一种或多种其他疗法(一种或多种其他免疫疗法或非免疫疗法)结合使用。
[0172]
如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指在体外和/或体内抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如， at
211
,i
131
,i
125
,y
90
,re
186
,re
188
,sm
153
,bi
212
,p
32
和lu的放射性同位素)，化学治疗剂，毒素，例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，以及抗体，包括其片段和/或变体。
[0173]
如本文所用，术语“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化合物，例如紫杉烷类，例如
紫杉醇和多西他赛，苯丁酸氮芥，长春新碱，长春碱，抗雌激素，包括例如它莫昔芬、雷洛昔芬，抑制芳香化酶的4(5)
‑
咪唑、4
‑
羟基它莫昔芬、曲沃昔芬、酮咯芬(keoxifene)、ly117018、奥那司酮和托瑞米芬，以及抗雄激素，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林。表3中列出了可以与本发明的化合物结合使用的抗癌剂，包括化学治疗剂的实施例。在一个优选的实施方式中，化学治疗剂是一种或多种蒽环霉素。蒽环霉素是一类化学治疗药物也是抗生素。蒽环霉素通过破坏dna的结构来阻止细胞分裂并通过以下方式终止其功能：(1)插入dna小沟的碱基对中；(2)引起dna中核糖的自由基损伤。蒽环霉素常用于白血病治疗。蒽环霉素的实施例包括柔红霉素，阿霉素，表柔比星和伊达比星。
[0174]
表3抗癌剂的示例
[0175]
[0176]
[0177]
[0178]
[0179]
[0180][0181][0182]
尽管可以将本发明的apc如dc或溶瘤病毒作为分离的试剂施用于受试者，但是优
选将这些细胞或病毒作为药物组合物的一部分施用。因此，本发明进一步提供了组合物，其包含与至少一种药学上可接受的载体结合的所述apc，例如dc或溶瘤病毒。药物组合物可适于各种给药途径，例如肠内、肠胃外、静脉内、肌内、局部、皮下等。如本领域普通技术人员可以确定的，施用可以是连续的或以不同的间隔。
[0183]
可以根据用于制备药学上有用的组合物的已知方法来配制根据本发明的方法施用的组合物。在许多来源中描述了制剂，这些来源是本领域技术人员众所周知的并且容易获得的。例如，remington’s pharmaceutical science (martin,e.w.,1995,easton pennsylvania,mack publishing company,第19 版)描述了可用于与本发明相关的制剂。适于施用的制剂包括，例如，无菌注射水溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，它们使制剂与预期接受者的血液等渗；水性和非水性无菌悬浮液，可包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶，并且可以在仅需要无菌液体载体条件的冷冻干燥(冻干)条件下储存，例如使用前注射用水。临时的注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒、片剂等制备。应该理解，除了上述特别提及的成分以外，本发明的组合物可以包括考虑到有关制剂类型的领域中常规的其他试剂。
[0184]
药学上可接受的盐的实施例是与形成生理上可接受的阴离子的酸形成的有机酸加成盐，例如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α
‑
酮戊二酸盐和α
‑
甘油磷酸盐。也可以形成合适的无机盐，包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。
[0185]
化合物的药学上可接受的盐可以使用本领域众所周知的标准方法获得，例如，通过使足够碱性的化合物例如胺与提供生理上可接受的阴离子的合适的酸反应来获得。也可以制备碱金属(例如钠，钾或锂)或碱土金属(例如钙)的羧酸盐。
[0186]
本发明的组合物，apc(例如dc)或溶瘤病毒以及用于本发明方法的其他试剂可以局部施用于一个或多个解剖部位，例如不需要细胞生长的部位 (例如肿瘤部位(例如注射或局部施用于肿瘤)，任选地与药学上可接受的载体例如惰性稀释剂组合。本发明的组合物和本发明方法中使用的其他试剂可以全身性施用，例如静脉内或口服，任选地与药学上可接受的载体例如惰性稀释剂或可吸收的可食用载体组合用于口服递送。它们可以装入硬壳或软壳明胶胶囊中，可以压制成片剂，也可以直接掺入患者饮食的食物中。对于口服治疗给药，所述试剂可以与一种或多种赋形剂组合，并以可吸收片剂、口腔片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆、薄片、气雾剂等形式使用。
[0187]
片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等还可包含以下物质：粘合剂，例如胶黄芪胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；可以加入甜味剂，例如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜，或调味剂，例如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊剂时，除上述类型的材料外，它还可包含液体载体，例如植物油或聚乙二醇。各种其他材料可以作为包衣存在或以其他方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆或酏剂可以包含活性化合物，蔗糖或果糖作为甜味剂，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯(methyl and propylparaben)作为防腐剂，染料和调味剂，例如樱桃或橙子调味剂。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应是药学上可接受的，并且在使用量上基本上是无毒的。此外，可以将组合物和试剂掺入缓释制剂和装置中。
[0188]
可以将本发明的活性剂(例如，apc，例如dc或溶瘤病毒)施用至肿瘤(肿瘤内)或进入淋巴结，例如受试者的腹股沟淋巴结。本发明的活性剂还可以通过输液或注射皮内、静脉内或腹膜内施用。在一些实施方式中， apc，例如dc，是通过皮内注射施用的，例如在引流至受试者的腋窝和/ 或腹股沟淋巴结盆的解剖部位。活性剂的溶液可以在水中制备，任选地与无毒的表面活性剂混合。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇、三乙酸甘油酯及其混合物中和在油中制备。在常规的储存和使用条件下，这些制剂可以包含防腐剂以防止微生物的生长。
[0189]
适于注射或输液的药物剂型可以包括无菌水溶液或分散液或包含本发明的apc(例如dc)或溶瘤病毒的无菌粉末，其适合于临时制备无菌注射或输液溶液或分散液，任选包裹在脂质体中。最终剂型在生产和储存条件下应是无菌的，流体的且稳定的。液体载体或媒介物可以是溶剂或液体分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯和其合适的混合物。适当的流动性可以例如通过形成脂质体，通过在分散剂的情况下维持所需的粒径或通过使用表面活性剂来维持。任选地，可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来预防微生物的活动，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸，硫柳汞等。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖、缓冲液或氯化钠。可以通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。
[0190]
无菌注射溶液的制备方法是，将所需量的apc(例如dcs)或溶瘤病毒和其他药剂与上述各种其他成分掺入适当的溶剂中，然后进行过滤灭菌。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分以及在先前无菌过滤的溶液中存在的任何其他所需成分的粉末。
[0191]
对于局部给药，组合物和试剂可以以纯形式，即当它们是液体时施用。然而，通常期望将它们作为组合物与皮肤病学上可接受的载体组合地局部施用至皮肤，所述载体可以是固体或液体。
[0192]
有用的固体载体包括细分的固体，例如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。有用的液体载体包括水、醇或二醇或水
‑
乙醇/乙二醇共混物，其中肽可以有效水平溶解或分散，可选地借助无毒表面活性剂。可以添加如香料的添加剂和其他抗微生物剂，以优化给定用途的性能。所得的液体组合物可以从吸收垫上施用，用于浸渍绷带和其他敷料，或使用例如泵式或气溶胶喷雾器喷到患处。
[0193]
增稠剂，例如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料，也可以与液体载体一起使用，形成可涂抹的糊剂、凝胶、软膏、肥皂等，直接施用于用户的皮肤。在jacquet等(美国专利号4,608,392)， geria(美国专利号4,992,478)，smith等(美国专利号4,559,157)和woltzman (美国专利号4,820,508)中公开了可用于将肽递送至皮肤的有用的皮肤病学组合物的实施例。
[0194]
本发明药物组合物的有用剂量可以通过比较它们的体外活性和动物模型中的体内活性来确定。在小鼠和其他动物中向人外推有效剂量的方法是本领域已知的；例如，参见美国专利号4,938,949。
[0195]
因此，本发明包括药物组合物，其包含任选地与药学上可接受的载体组合的apc，例如dc或溶瘤病毒。适于口服、局部或肠胃外给药的药物组合物，其包含一定量的apc，例如dc或溶瘤病毒，构成本发明的优选实施方式。在本发明的上下文中，给予患者，特别是人的
剂量应足以在合理的时间内在患者体内实现治疗反应，而无致命毒性，并且优选引起不超过可接受水平的副作用或发病率。本领域技术人员将认识到，剂量将取决于多种因素，包括受试者的状况(健康)、受试者的体重、同时治疗的种类(如果有的话)、治疗的频率、治疗比率以及病理状况的严重程度和阶段。有利地，在一些实施方式中，本发明化合物的施用在受试者中不引起体重减轻或明显的毒性迹象。
[0196]
取决于待治疗的病症或疾病状况(例如恶性肿瘤，例如骨髓瘤)，合适的剂量可以是将减少靶细胞的增殖或生长或诱导细胞死亡的量。在癌症的情况下，合适的剂量导致癌症组织(例如恶性肿瘤)中活性试剂的浓度增加的量，已知该量可达到所需的反应。优选的剂量是导致癌细胞生长的最大抑制而没有难以控制的副作用的量。如本领域普通技术人员可以确定的，apc，例如dc或溶瘤病毒和其他试剂的施用可以是连续的或以不同的间隔。
[0197]
为了提供这样剂量的施用以进行所需的治疗，在一些实施方式中，基于包括载体或稀释剂的整个组合物的重量，本发明的药物组合物可以包括约 0.1％至45％，特别是1至15％的本发明的一种或多种试剂的总重量。说明性地，所施用的活性成分的剂量水平可以是：按照动物(身体)重量，静脉内，0.01至约20mg/kg；和腹膜内，0.01至约100mg/kg；皮下，0.01至约 100mg/kg；肌内0.01至约100mg/kg；口服0.01至约200mg/kg，优选约1 至100mg/kg；鼻内滴注，0.01至约20mg/kg；和气雾剂，0.01至约20mg/kg。
[0198]
制备apc，例如dc
[0199]
apc在引发有效的免疫反应中很重要。apc不仅将抗原呈递给具有抗原特异性受体的t细胞，而且还提供t细胞激活所必需的信号。此类信号仍未完全定义，但已知涉及多种细胞表面分子以及细胞因子或生长因子。激活初始(naive)或未致敏(unprimed)的t细胞所必需的因子可能与重新激活先前致敏(primed)的记忆t细胞所需的因子不同。尽管单核细胞和b细胞已表明是有适应力的apc，但它们的抗原呈递能力似乎仅限于先前致敏的 t细胞的重新激活。因此，它们不能直接激活功能上初始或未致敏的t细胞群体。另一方面，dc可以激活初始t细胞和先前致敏的t细胞。
[0200]
dc具有独特的形态和广泛的组织分布，包括血液。树突细胞的细胞表面不寻常，具有典型的膜状(veil
‑
like)突起。成熟的树突细胞通常被鉴定为cd3
‑
，cd11c+，cd19
‑
，cd83+，cd86+和hla
‑
dr+。
[0201]
dc处理并呈递抗原，并刺激来自初始或未致敏的t细胞和记忆t细胞的应答。特别地，dc具有高的mhc
‑
限制性t细胞敏化能力，并且在向t 细胞呈递抗原方面非常有效，包括呈递t细胞发育和耐受期间的自身抗原和以及免疫应答期间的外源抗原均有效。除了在抗原呈递中的作用外，dc还直接与非淋巴组织进行通讯并调查非淋巴组织的损伤信号(例如，局部缺血，感染或炎症)或肿瘤的生长。一旦发出信号，dc通过释放刺激淋巴细胞和单核细胞活性的细胞因子来启动免疫反应。
[0202]
由于其在抗原呈递上的有效性，dc在体内和离体都可用作免疫刺激剂。然而，由于外周血中dc的频率低和通过现有方法分离的dc的纯度低，限制了分离的dc作为免疫刺激剂的使用。特别是，人类外周血中dc的频率估计约为白细胞的0.1％。类似地，从其他组织(如淋巴器官)获得的dc 也有限。dc的低频使对分离富含dc前体的细胞群以及离体或体外培养这些前体以获得富集的未成熟或成熟的dc群越来越感兴趣。因为dc前体的特征仍然未完全定义，所以通常用于分离dc前体的方法不会产生所需前体的纯化部分，而是通常产生富含
dc前体的混合白细胞群。已经鉴定出几种细胞类型具有充当dc前体的潜力。血液来源的cd14+单核细胞，特别是那些在其表面表达生长因子粒细胞
‑
单核细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)受体的细胞，是已知的dc前体。可以通过首先去除单核细胞和其他“非树突细胞前体”来分离其他血液来源的dc前体。(例如参见，美国专利号5,994,126 和5,851,756。)。其他已知的dc前体包括表达cd34细胞表面标志物的骨髓来源的细胞。
[0203]
已经通过各种方法获得了富含dc前体的细胞群，并且可以与本发明一起使用，例如密度梯度分离，荧光激活细胞分选，免疫细胞分离技术，例如淘选、补体裂解、玫瑰花结(rosetting)、磁性细胞分离技术、尼龙毛分离以及这些方法的组合(例如参见，o'doherty等,j.exp.med.178:1067
‑
76 (1993)；young和steinman,j.exp.med.171:1315
‑
32(1990)；freudenthal和 steinman,proc.natl.acad.sci.usa 87:7698
‑
702(1990)；macatonia等, immunol.67:285
‑
89(1989)；markowicz和engleman,j.clin.invest.85:955
‑
61 (1990)，所有通过引用整体并入本文)。用于免疫选择dc的方法包括，例如，使用针对与树突细胞前体相关的细胞表面标志物的抗体，例如偶联至底物的抗cd34和/或抗cd14抗体。(例如参见，bernhard等,cancer res. 55:1099
‑
104(1995)；caux等,nature 360:258
‑
61(1992))。
[0204]
在一种典型的示例方法中，通过白细胞去除术程序分离白细胞。通常使用其他方法进行进一步纯化，以富集被认为含有dc和/或dc前体的细胞部分。类似地，如差速离心(例如，分离血沉棕黄层)，用对某些细胞表面蛋白特异的单克隆抗体淘选(例如，阳性和阴性选择)以及过滤的方法也产生含有dc前体的白细胞的粗混合物。
[0205]
分离增殖的dc前体的另一种报道的方法是使用经商业处理的塑料基质 (例如，珠或磁珠)以选择性去除粘附的单核细胞和其他“非树突细胞前体”。 (例如参见，美国专利号5,994,126和5,851,756)。丢弃粘附的单核细胞和非dc前体，而保留非粘附的细胞用于离体培养和成熟。在另一种方法中，将粘附细胞在塑料培养袋中培养，在塑料培养袋中加入塑料即聚苯乙烯或苯乙烯微载体珠以增加袋的表面积。将细胞培养足够长的时间以使细胞粘附至珠，并从袋中洗涤未粘附的细胞。(maffei等，transfusion 40：1419
‑
1420 (2000)；wo 02/44338，其通过引用并入本文)。
[0206]
在基本上所有报道的制备富含dc前体的细胞群的方法之后，通常将细胞群离体或体外培养以分化dc前体或维持和/或扩增dc。简而言之，单核细胞dc前体的离体分化涉及在细胞生长因子(例如细胞因子)的组合存在下培养富含dc前体的混合细胞群。例如，单核细胞dc前体需要粒细胞/ 单核细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)与至少一种其他细胞因子结合，例如这些细胞因子选自：白介素4(il
‑
4)、白介素15(il
‑
15)、白介素13(il
‑
13)、干扰素α(ifn
‑
α)等以将细胞分化为最佳状态以进行抗原摄取、加工和/或呈递。来自非单核细胞dc前体的dc数目，例如通过去除单核细胞和其他非dc前体细胞(吸附到塑料表面上)或选择cd34+细胞获得的dc数目，也可以通过在某些细胞因子存在下进行培养来扩大。单独的gm
‑
csf或将gm
‑
csf与il
‑
4组合已被用于从这种增殖的dc前体中产生dc群，以用于治疗的方法。
[0207]
然而，由于富含dc和dc前体的起始种群的质量，这种离体分化、维持和/或扩增的有效性受到限制。在某些培养条件下，被中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞或其组合严重污染的dc和dc前体种群可能被后来的细胞所取代，从而导致dc的产量低下。含有大量嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞或其组合的dc的培养不太适合用作免疫刺激制剂。
[0208]
可以通过快速浓注(bolus injection)，连续输液，从植入物的持续释放或本领域
已知的其他合适技术，向受试者施用apc，例如dc，以刺激免疫应答。apc，例如dc，也可以与生理上可接受的载体、赋形剂、缓冲剂和/ 或稀释剂共同施用。此外，可以使用本领域技术人员熟知的方法离体使用 apc，例如dc，以激活t细胞，例如细胞毒性t细胞。这些组合物可单独使用或作为其他疗法的佐剂，例如手术切除、化学疗法、放射疗法，嵌合抗原受体(car)表达t细胞(car t细胞)及其组合，以及适合所治疗病症的其他治疗方式。
[0209]
定义
[0210]
术语“包含”，“由...组成”和“基本上由...组成”是根据其标准含义限定的。在整个本申请中，这些术语可以彼此替换以附加与每个术语相关的特定含义。
[0211]
术语“分离的”或“生物学上纯的”是指材料基本上或基本上不含当以其天然状态发现时通常伴随该材料的组分。因此，根据本发明的化合物优选在其原位环境中不包含通常与肽关联的材料。
[0212]
如本说明书中所使用的，单数形式“一(a)”，“一(an)”和“该 (the)”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一种化合物”包括多种这样的化合物。提及“一个细胞”包括多个这样的细胞，依此类推。
[0213]
如本文所用，术语“溶瘤病毒”是指具有以下一种或两种作用机制的一类癌症治疗性病毒：1)通过在肿瘤细胞中选择性病毒复制而杀死肿瘤细胞，导致直接的肿瘤溶解，以及2)通过从破坏的肿瘤细胞中释放抗原来诱导全身性抗肿瘤免疫力。
[0214]
除非另有说明，否则本发明的实施可以采用本领域技术范围内的分子生物学、微生物学、重组dna技术、电生理学和药理学的常规技术。此类技术在文献中有充分的解释(例如参见，sambrook,fritsch&maniatis, molecular cloning:a laboratory manual,second edition(1989)；dna cloning, vols.i and ii(d.n.glover ed.1985)；perbal,b.,a practical guide tomolecular cloning(1984)；the series,methods in enzymology(s.colowick和 n.kaplan eds.,academic press,inc.)；transcription and translation(hames等 eds.1984)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.h.miller等eds. (1987)cold spring harbor laboratory,cold spring harbor,n.y.)；scopes, protein purification:principles and practice(2nd ed.,springer
‑
verlag)；和pcr: a practical approach(mcpherson等eds.(1991)irl press))，其每一个均通过引用整体并入本文。
[0215]
在包含外源i型ifn和外源cd40
‑
l的组合(例如ifnβ和cd40
‑
l组合)的apc(例如dc)中，i型ifn和cd40
‑
l通过包含编码i型ifn和 cd40
‑
l的异源基因的一种或多种异源核酸序列表达，即除apc(例如dc) 内天然存在的基因以外的基因。编码i型ifn和cd40
‑
l的异源基因可以具有与apc(例如dc)中存在的天然存在的相应基因相同的序列。与apc(例如dc)中存在的相应天然存在的基因相比，异源基因可以具有不同的序列。异源基因可以编码与apc(例如dc)中相应天然存在的基因编码的相同或不同的i型ifn和/或相同或不同的cd40
‑
l。
[0216]
cd40
‑
l的术语“切割位点”是指被蛋白酶例如基质金属蛋白酶识别的氨基酸序列。蛋白酶从表达cd40
‑
l的细胞表面切割cd40
‑
l。cd40
‑
l的切割位点通常在cd40
‑
l的结构域iii和iv的边界处或周围。一个这样的切割位点大约位于seq id no：6的氨基酸108和116之间的区域中。
[0217]
与天然人cd40
‑
l相比，较不易裂解的cd40
‑
l是指嵌合cd40
‑
l对蛋白水解裂解的更
高抗性。嵌合cd40
‑
l对裂解的易感性通常通过一段时间内由给定数量的细胞产生的可溶性cd40
‑
l的量来测量。本发明的嵌合cd40
‑
l 以比天然cd40
‑
l低至少90％的速率裂解。
[0218]
术语“序列同一性”表示两个氨基酸序列之间或相等长度的两个核酸序列之间的同源程度的定量测量。如果要比较的两个序列的长度不相等，则必须将它们进行比对以提供最佳的匹配度，从而允许在多肽序列或核苷酸序列的末端插入缺口或截短。
[0219]
关于与核苷酸序列有关的本发明的所有实施方式，一种或多种序列之间的序列同一性百分比也可以基于使用具有默认设置的任何合适的软件例如 clustalw软件(参见全球网站：ebi.ac.uk/clustalw/index.html)的比对。对于核苷酸序列比对，这些设置为：比对＝3dfull，空位开放(gap open)10.00，空位延伸(gap ext.)0.20，空位分离距离(gap separation dist.)4，dna 重量矩阵(weight matrix)：同一性(iub)。或者，可以使用任何合适的软件例如dnasis max来分析核苷酸序列，并且可以在全球网站 paralicin.orci/上进行序列的比较。该服务基于称为smith
‑
waterman(sw) 和paralign的两种比较算法。第一个算法由smith和waterman(1981)发布，是一种可以找到两个序列的最佳局部比对的建立完善的方法。另一种算法paralign是一种用于序列比对的启发式方法。有关该方法的详细信息，公布于rognes(2001)中。使用分数矩阵和空位罚分以及e值的默认设置。
[0220]
当提及互补序列时，可以应用以下碱基配对规则，g配对c和u，a配对t和u。“核酸序列”和“多核苷酸序列”在本发明的上下文中是可互换的术语。
[0221]
术语“载体”是指用作将重组遗传物质转移到宿主细胞中的载体的dna 分子。载体的四种主要类型是质粒，噬菌体和其他病毒，粘粒和人工染色体。载体本身通常是由插入物(异源核酸序列，转基因)和充当载体“骨架”的较大序列组成的dna或rna序列。将遗传信息转移到宿主的载体的目的通常是在靶细胞中分离，繁殖或表达插入物。被称为表达载体(表达构建体) 的载体特别适于在靶细胞中表达异源序列，并且通常具有驱动异源序列表达的启动子序列。与表达载体不同，称为转录载体的更简单的载体只能转录但不能翻译：它们可以在靶细胞中复制但不能表达。转录载体用于扩增插入的异源序列。转录物随后可被分离并用作适合于体外翻译系统的模板。在本发明的实施方式中使用的载体的选择取决于编码本发明的多肽或多核苷酸的载体的具体应用。在一些实施方式中，载体是病毒载体。在其他实施方式中，载体是非病毒载体。
[0222]
术语“可操作地连接”是指作为功能单元如基因或开放阅读框(例如，编码ifnβ)的一部分的元件的连接。因此，通过将启动子与编码ifnβ的核酸序列可操作地连接，这两个元件成为功能单元
‑
基因的一部分。表达控制序列(启动子)与核酸序列的连接使得核酸序列的转录由启动子指导。表达控制序列可以通过表达构建体与编码ifnβ或cd40
‑
l的核酸序列连接。例如，编码ifnβ和cd40
‑
l的核酸序列都可以在相同表达控制下进行控制，即表达控制的单拷贝。或者，编码ifnβ和cd40
‑
l的每个核酸序列可以在单独的表达控制下进行控制，即，表达控制序列的第一个拷贝控制ifnβ的表达，而表达控制序列的第二个拷贝控制cd40
‑
l的表达。在一些实施方式中，第一表达控制序列控制ifnβ的表达，而第二表达控制序列控制cd40
‑
l 的表达，即，两个表达控制序列彼此不同。
[0223]
材料和方法
[0224]
树突细胞生成和肽库加载。可通过将7
‑
11 x 106pbmc/ml悬浮在无血清xvivo
‑
15培养基(lonza，allendale，nj)中，然后在25cm2细胞培养瓶(corning，corning，ny)中培养3
小时来产生dc。然后可以将细胞在pbs中洗涤两次，以去除非粘附细胞。可以在无血清x
‑
vivo培养基中培养粘附细胞6天，该培养基中分别补充gm
‑
csf和il
‑
4(r&d systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州)各1000单位/ml。然后可以收集dc，清洗并计数。通过在补充有1μg/肽/ml的100μl xvivo
‑
15培养基中于37℃培养1 小时，可为dc加载指定的肽库。
[0225]
树突细胞转导。产生塑性粘附后，dc可以重悬于500μl补充有gm
‑
csf 和il
‑
4的无血清xvivo
‑
15培养基中，并用一个或多个表达ifnβ和cd40
‑
l 的病毒的20,000个病毒颗粒/细胞在37℃(25)转导2小时。2小时后，将 2 x 105dc/孔接种到24孔板中，并补充1.5ml完全培养基(xvivo
‑
15+10 ％人血清(seracare)+青霉素/链霉素)，持续另外的24小时。
[0226]
本发明的实施方式的实施例包括但不限于：
[0227]
实施方式1.一种抗原呈递细胞(apc)，其包含外源i型干扰素和外源cd40
‑
l的组合或编码外源i型ifn和外源cd40
‑
l 3的组合的一种或多种异源核酸序列。
[0228]
实施方式2.根据实施方式1所述的apc，其中：
[0229]
a)i型ifn是：包括与人ifnα(seq id no：1)至少80％序列同一性的ifnα，包括与人ifnβ(seq id no：2)至少80％序列同一性的ifnβ，包括与人ifnε(seq id no：3)至少80％序列同一性的ifnε，包括与人 ifnκ(seq id no：4)至少80％序列同一性的ifnκ或包括与人ifnω(seq id no：5)至少80％序列同一性的ifnω；和/或
[0230]
b)cd40
‑
l包括与人cd40
‑
l(seq id no：6)至少80％的序列同一性，与具有选自seq id no：7至18序列的嵌合cd40
‑
l至少80％的序列同一性，或与具有seq id no：12的序列的嵌合cd40
‑
l至少80％的序列同一性；和/或
[0231]
c)i型ifn是包括与人ifnβ(seq id no：2)至少80％序列同一性的 ifnβ，而cd40
‑
l包括与具有seq id no：12序列的嵌合cd40
‑
l至少80 ％的序列同一性。
[0232]
实施方式3.根据实施方式1或2所述的apc，其中编码i型ifn和 cd40
‑
l的组合的一种或多种异源核酸序列在一种或多种病毒构建体中。
[0233]
实施方式4.根据实施方式3所述的apc，其中一种或多种病毒构建体中的每一个独立地是腺病毒构建体、腺相关病毒构建体(aav)、痘病毒构建体、慢病毒构建体、α病毒构建体、疱疹病毒构建体、逆转录病毒构建体、牛痘病毒构建体、水疱性口炎病毒构建体或单纯疱疹病毒构建体。
[0234]
实施方式5.根据前述实施方式中任一项所述的apc，其中所述apc是人apc。
[0235]
实施方式6.根据前述实施方式中任一项所述的apc，其中，apc是 dc。
[0236]
实施方式7.一种包含前述实施方式中任一项所述的apc和药学上可接受的载体的组合物。
[0237]
实施方式8.根据实施方式7所述的组合物，还包含佐剂。
[0238]
实施方式9.一种用于治疗恶性肿瘤的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的前述实施方式中任一项所述的apc。
[0239]
实施方式10.根据实施方式9所述的方法，其中所述apc是自体细胞。
[0240]
实施方式11.根据实施方式9或10中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用一种或多种其他抗癌剂。
[0241]
实施方式12.根据实施方式9至11中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用化学治疗药物(例如，美法仑)、免疫调节剂、佐剂、贫血药物(例如，促红细胞生成素)、
放射疗法、干细胞移植、嵌合抗原受体 (car)表达t细胞(car t细胞)、或上述两种或多种的组合。
[0242]
实施方式13.根据实施方式9至12中任一项所述的方法，其包括在施用apc之前施用放射疗法。
[0243]
实施方式14.根据实施方式9至13中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
[0244]
实施方式15.根据实施方式9至14中任一项所述的方法，其中所述apc 通过皮内注射、肿瘤内注射或向引流到肿瘤的淋巴结的注射来施用。
[0245]
实施方式16.根据实施方式15所述的方法，其中所述皮内注射在引流至所述受试者的腋窝和/或腹股沟淋巴结盆的解剖部位。
[0246]
实施方式17.根据实施方式9至16中任一项所述的方法，其中所述apc 在几天的时间内多次施用。
[0247]
实施方式18.根据实施方式9至17中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括对受试者进行造血细胞移植(造血干细胞或祖细胞，例如来自骨髓，外周血或脐带血)。
[0248]
实施方式19.根据实施方式18所述的方法，其中所述造血细胞移植是自体的。
[0249]
实施方式20.根据实施方式18或19所述的方法，其中所述apc在造血细胞移植之前和之后施用。
[0250]
实施方式21.根据实施方式18至20中任一项所述的方法，其还包括在自体造血细胞移植之前对受试者进行干细胞动员(例如，使用g
‑
csf)并收集来自受试者的造血细胞。
[0251]
实施方式22.根据实施方式9至21中任一项所述的方法，其进一步包括，在所述施用apc之前，收集来自受试者的apc以产生待施用给受试者的apc。
[0252]
实施方式23.根据实施方式22所述的方法，其中所述apc在所述施用之前被冷冻保存。
[0253]
实施方式24.根据实施方式9至23中任一项所述的方法，其进一步包括在所述施用apc之前、期间或之后施用化学治疗剂(例如美法仑)。
[0254]
实施方式25.根据实施方式24所述的方法，其进一步包括在造血细胞移植期间施用化学治疗剂(例如美法仑)。
[0255]
实施方式26.根据实施方式9至24中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用检查点抑制剂。
[0256]
实施方式27.根据实施方式26所述的方法，其中检查点抑制剂是以下的抑制剂：细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla4，也称为cd152)，程序性细胞死亡蛋白1(pd
‑
1，也称为cd279)或程序性细胞死亡1配体1(pd
‑
l1，也称为cd274)。
[0257]
实施方式28.根据实施方式27所述的方法，其中ctla4的抑制剂是结合ctla4的抗体，pd
‑
1的抑制剂是结合pd
‑
1的抗体，并且pd
‑
l1的抑制剂是结合pd
‑
l1的抗体。
[0258]
实施方式29.一种溶瘤病毒，其包含i型干扰素和cd40l的组合或编码i型ifn和cd40
‑
l的组合的一种或多种核酸序列。
[0259]
实施方式30.根据实施方式29所述的溶瘤病毒，其中：
[0260]
a)i型ifn是：包括与人ifnα(seq id no：1)至少80％序列同一性的ifnα，包括与人ifnβ(seq id no：2)至少80％序列同一性的ifnβ，包括与人ifnε(seq id no：3)至少80％序列同一性的ifnε，包括与人 ifnκ(seq id no：4)至少80％序列同一性的ifnκ或包括与人
ifnω(seq id no：5)至少80％序列同一性的ifnω；和/或
[0261]
b)cd40
‑
l包括与人cd40
‑
l(seq id no：6)至少80％的序列同一性，与具有选自seq id no：7至18序列的嵌合cd40
‑
l至少80％的序列同一性；和/或
[0262]
c)i型ifn是包括与人ifnβ(seq id no：2)至少80％序列同一性的 ifnβ，而cd40
‑
l包括与具有seq id no：12序列的嵌合cd40
‑
l至少80 ％的序列同一性。
[0263]
实施方式31.根据实施方式29
‑
30中任一项所述的溶瘤病毒，其中溶瘤病毒是腺病毒、呼吸道肠道病毒、疱疹病毒、小核糖核酸病毒(包括柯萨奇病毒，脊髓灰质炎病毒和塞内卡谷病毒)、副粘病毒(包括麻疹病毒和新城疫病毒(ndv))、细小病毒、弹状病毒(包括水疱性口炎病毒(vsv))、牛痘病毒、痘病毒、辛德毕斯病毒、粘液瘤病毒、马拉巴病毒、流感病毒、腮腺炎病毒、沙粒病毒、牛痘病毒或含有e1aδ
‑
24缺失，e1b
‑
55k缺失和 e3区域缺失的重组腺病毒。
[0264]
实施方式32.一种包含实施方式29
‑
31中任一项所述的溶瘤病毒和药学上可接受的载体的组合物。
[0265]
实施方式33.根据实施方式32所述的组合物，其进一步包含佐剂。
[0266]
实施方式34.一种治疗恶性肿瘤的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的实施方式29
‑
31中任一项所述的溶瘤病毒或实施方式31或32所述的组合物。
[0267]
实施方式35.根据实施方式34所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用一种或多种其他抗癌剂。
[0268]
实施方式36.根据实施方式35所述的方法，其中所述方法进一步包括施用化学治疗药物(例如美法仑)、免疫调节剂、佐剂、贫血药物(例如促红细胞生成素)、放射疗法、干细胞移植、嵌合抗原受体(car)
‑
表达t 细胞(car t细胞)或上述两种或多种的组合。
[0269]
实施方式37.根据实施方式34至36中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
[0270]
实施方式38.根据实施方式34至37中任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒在几天内多次施用。
[0271]
实施方式39.根据实施方式34至38中任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒通过皮内注射、肿瘤内注射、静脉内注射或注射到引流到肿瘤的淋巴结中来施用。
[0272]
实施方式40.根据实施方式39所述的方法，其中，所述皮内注射在引流至所述受试者的腋窝和/或腹股沟淋巴结盆的解剖部位。
[0273]
实施方式41.根据实施方式34至40中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括对受试者进行造血细胞移植(造血干细胞或祖细胞，例如来自骨髓，外周血或脐带血)。
[0274]
实施方式42.根据实施方式41所述的方法，其中所述造血细胞移植是自体的。
[0275]
实施方式43.根据实施方式41或42所述的方法，其中溶瘤病毒在造血细胞移植之前和之后施用。
[0276]
实施方式44.根据实施方式34至43中任一项所述的方法，其还包括在自体造血细胞移植之前对受试者进行干细胞动员(例如，使用g
‑
csf)并收集来自受试者的造血细胞。
[0277]
实施方式45.根据实施方式34至44中任一项所述的方法，其进一步包括在施用溶瘤病毒之前、期间或之后施用化学治疗剂(例如美法仑)。
[0278]
实施方式46.根据实施方式43至45中任一项所述的方法，其进一步包括在造血细胞移植期间施用化学治疗剂(例如美法仑)。
[0279]
实施方式47.根据实施方式34至46中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用检查点抑制剂。
[0280]
实施方式48.根据实施方式47所述的方法，其中检查点抑制剂是以下的抑制剂：细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla4，也称为cd152)、程序性细胞死亡蛋白1(pd
‑
1，也称为cd279)或程序性细胞死亡1配体1(pd
‑
l1，也称为cd274)。
[0281]
实施方式49.根据实施方式48所述的方法，其中ctla4的抑制剂是结合ctla4的抗体，pd
‑
1的抑制剂是结合pd
‑
1的抗体，并且pd
‑
l1的抑制剂是结合pd
‑
l1的抗体。
[0282]
本文所参考或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开申请，均通过引用整体并入本文，包括所有附图和表格，只要它们不与本说明书的明确教导相抵触即可。
[0283]
以下是说明实施本发明的方法的实施例。这些实施例不应被解释为限制性的。除非另有说明，所有百分比均以重量计，所有溶剂混合物比例均以体积计。
[0284]
实施例1
–
双表达盒mem40和ifnβ溶瘤腺病毒的构建
[0285]
使用包括cmv启动子、mem40核苷酸序列和聚腺苷酸化序列的用于 mem40的表达盒构建5型溶瘤腺病毒。将表达盒插入包含24个核苷酸缺失的腺病毒e1a基因区域的上游。此外，将包含sv40启动子，ifnβ核苷酸序列和聚腺苷酸化序列的用于ifnβ的第二表达盒插入删除腺病毒e3区域的腺病毒基因组位置。腺病毒基因组的e1b 55k区域也已被删除。图2示出了具有编码cd40
‑
l和ifnβ的双表达盒的示例性溶瘤腺病毒的构建示意图。
[0286]
实施例2
‑
单表达盒mem40和ifnβ溶瘤腺病毒的构建
[0287]
使用包括cmv启动子、由内部核糖体进入位点分隔的mem40和ifnβ核苷酸序列以及聚腺苷酸化序列的用于mem40和ifnβ的表达盒构建5型溶瘤腺病毒。将表达盒插入包含24个核苷酸缺失的腺病毒e1a基因区域的上游。腺病毒包含e3和e1b 55k区域缺失。图3示出了具有由内部核糖体进入位点(ires)分隔的编码cd40
‑
l和ifnβ的单个表达盒的示例性溶瘤病毒的构建示意图。
[0288]
实施例3
–
表达ifnβ和mem40的病毒的溶瘤活性
[0289]
测试了ifnβ和mem40表达对患有侵袭性b16皮下黑色素瘤的小鼠的肿瘤生长的单独和联合作用。如图4a所示，将表达ifnβ的树突细胞(106个用表达ifnβ的慢病毒转导的细胞)和表达mem40的复制缺陷型腺病毒 (ad
‑
mem40，10
10
个病毒颗粒)注射到肿瘤中。重要的是，与单独使用任何一种药物相比，联合治疗显著降低了肿瘤的生长(图4a)。如图4b所示，在用两种试剂治疗之后，所有植入了侵袭性b16黑色素瘤肿瘤细胞的小鼠在实验完成时都还活着。相反，在用ad
‑
mem40处理后，植入了b16黑色素瘤肿瘤细胞的小鼠在实验完成时没有存活。在用仅表达ifnβ的dc处理后，只有17％的植入b16黑色素瘤肿瘤细胞的小鼠在实验完成时还活着。
[0290]
测试了表达mem40和/或ifnβ的腺病毒(δ24)在各种癌症模型中的溶瘤能力。mem
‑
188是指仅表达mem40的腺病毒δ24，而mem
‑
288是指同时表达mem40和ifnβ的腺病毒δ24。在a549肺肿瘤细胞中，与对照 oadv和mem
‑
188相比，mem
‑
288分别显示7倍和100倍的更大的肿瘤杀死率和免疫激活率。例如，图5a示出随着mem
‑
288剂量增加，在a549 肺肿瘤细胞中的感染导致约5％的非常低的细胞活力(cell viability)。获得了mem
‑
288的感染复数(moi)为26的ld
50
。相反，随着mem
‑
188剂量增加，a549肺肿瘤细胞中的感染导致细胞活力略高，约为15％，和moi 为194的更高的ld
50
。对照oadv没有显示出明显的细胞杀伤特性。对于这些实
验，通过荧光素酶活性试验来确定细胞活力。
[0291]
在用mem
‑
188、mem
‑
288或对照oadv感染48小时后，通过qrt
‑
pcr 确定ifnβcxcl10的下游靶标(图5b)。图5b示出在用mem
‑
288感染后约48小时，作为干扰素诱导趋化因子和t细胞活化剂的cxcl10的表达增加了约200至300倍。用对照oadv的感染没有显示出这种增加，而用 mem
‑
188的感染则显示出约2
‑
3倍的中等增加。
[0292]
图6a示出了mem
‑
288对几种肿瘤类型具有广泛的活性。用mem
‑
288 (蓝色)或对照oadv(灰色)感染不同类型的癌(carcinoma)肿瘤，并在 48小时后分析细胞死亡。与对照oadv感染相比，mem
‑
288感染提供了明显更高的细胞毒性。
[0293]
用递增剂量的mem
‑
188和mem
‑
288感染kras突变型肺肿瘤(hcc44 细胞系)，其是肺腺癌中最常见的致癌驱动突变形式的一个示例。通过结晶紫染色测量细胞活力(紫色＝存活；透明＝死亡)。图6b示出，与mem
‑
188 相比，mem
‑
288在杀死该肿瘤细胞系方面的效力高约100倍。用其他肺肿瘤细胞系观察到相似的结果(图10)。
[0294]
测试了mem40和ifnβ在不同肿瘤细胞系中的体外表达，结果如图7 所示。将细胞用mem
‑
288以250的moi感染2天。通过荧光激活细胞分选(facs)在人a549肺癌细胞系，小鼠肺癌lkr和344细胞系和小鼠 b16
‑
ova黑色素瘤细胞系中确定mem40表达，而通过elisa测定法确定 ifnβ表达。所有细胞系均表达可检测的mem40的细胞表面表达，并向培养上清液中释放ifnβ。
[0295]
图8示出了在人肺癌细胞系a549中感染mem
‑
288的增强的转基因表达和复制。在该实验中，用指示的moi的mem
‑
188(b
‑
d)或mem
‑
288 (e
‑
g)感染或不感染a549(a)。使用针对小鼠cd40l的抗体通过流式细胞计数检测mem40表达。在如所示不同的moi下的两种病毒感染后第2、 4和6天检测到mem40表达。mem
‑
188感染后的mem40表达在第2天较高，但到第6天基本减少(图8b)。相反，mem
‑
288感染的细胞在第4 天和第6天保留了较高的mem40表达(图8e)。当moi为10时，在mem
‑
288 感染的细胞中很容易检测到mem40表达(图8f)，而在mem
‑
188感染的细胞(图8c)中则没有检测到。在moi为1的mem
‑
288感染后，mem40 在第2、4和6天分别从低表达到高表达暂时升高(图8g)。在mem
‑
188 感染的细胞中未发生此类变化(图8d)，该结果表明mem
‑
288的复制活性明显高于mem
‑
188。根据图8中的结果绘制了a549细胞系中mem
‑
188或 mem
‑
288感染后mem40的表达，并显示在图9中。
[0296]
在多种肺癌细胞系中测试了mem
‑
288的溶瘤能力。用不同的moi下的 mem
‑
188或mem
‑
288感染细胞3天。通过在pc9、a549、h23和hcc44 细胞系中进行细胞计数测定和结晶紫测定来确定细胞活力。mem
‑
288在 moi为10和100时对所有这些细胞系均显示出更高的细胞杀伤能力(图10)。 mem40在图10中所示的细胞系中的表达如图11所示。在moi＝100时，使用/不使用溶瘤mem
‑
188或mem
‑
288感染细胞3天，之后发现在 mem
‑
288感染的细胞中mem40的表达明显更高。
[0297]
图12示出在mem
‑
288感染和未感染细胞的混合培养物中的细胞，旁观者未感染细胞上调了pdl1表达。除非添加外源性ifnβ，否则mem
‑
188 感染不会上调旁观者细胞中pdl1的表达。因此，在mem
‑
288感染后，ifnβ增加旁观者未感染细胞中pdl1的表达。
[0298]
图13示出mem
‑
288和表达mem40和/或ifnβ的溶瘤腺病毒(δ24) 的病毒载体图。
[0299]
应该理解的是，本文描述的实施例和实施方式仅用于示例性目的，并且根据其的各种修改或改变将被建议给本领域技术人员，并且将被包括在本申请的精神和范围以及所
附权利要求书的范围之内。此外，本文公开的任何发明或其实施方式的任何要素或限制可以与任何和/或所有其他元素或限制 (单独或以任何组合)或本文公开的任何其他发明或其实施方式结合，并且所有这样的组合是可以理解为在本发明的范围内，但不限于此。