白介素35在制备治疗自身免疫性皮肤病药物中的用途和治疗药物以及IL?35?Fc融合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明属于生化药物领域，具体涉及IL?35在制备治疗自身免疫性皮肤病药物中的用途和治疗药物以及IL?35?Fc融合蛋白。本发明所要解决的技术问题为是自身免疫性皮肤病的治疗提供一种新的有效手段。本发明解决该技术问题的技术方案为提供了白介素?35在制备治疗银屑病的药物中的用途。结果表明使用含IL?35对银屑病进行治疗，治疗效果好，毒副作用小，治疗简便，为银屑病、硬皮病、天疱疮等自身免疫性皮肤病的治疗提供了新的选择。
【专利说明】
白介素35在制备治疗自身免疫性皮肤病药物中的用途和治疗 药物以及I L-35-Fc融合蛋白
技术领域
[0001] 本发明属于生化药物领域，具体涉及白介素35在制备治疗自身免疫性皮肤病药物 中的用途和治疗药物以及新的IL-35-Fc融合蛋白。
【背景技术】
[0002] 自身免疫性皮肤疾病是指机体对自身抗原产生过度免疫反应而导致自身皮肤组 织严重受损所引起的疾病，自身免疫性皮肤病主要包括银肩病、硬皮病、天疱疮等。银肩病 是一种代表性的慢性自身免疫性皮肤疾病，受遗传因素影响较大。临床上，银肩病表现为多 样性、凸显性并伴有明显的红肿和红斑等容易辨认的症状。该疾病主要是由于真皮血管渗 透性增加且血管内皮生长因子(VEGF)表达上调引起的，具有病程长，难治愈，易复发等特 点，给患者带来了严重的经济负担和精神压力。近年来，关于银肩病复杂的发病免疫机制取 得了新的进展。研究表明，在银肩病患者体内，发生了Thl与Thl7极化引起的免疫反应，这种 免疫反应主要是Thl与Thl7细胞通过紧凑的自分泌或旁分泌过程与过度增殖的角化形成细 胞、浸润的淋巴细胞以及活化的微血管内皮细胞相互作用引起。
[0003] 白介素-35(IL-35)是2007年发现的IL-12细胞因子家族的新成员，是胸腺来源的 自然调节性T细胞(Treg)分泌的一种免疫抑制性细胞因子。IL-35具有免疫抑制作用，它在 体内外能抑制TefT细胞增殖，抑制Thl7细胞分化、介导⑶4+⑶25+T细胞的增殖和IL-10的产 生。
[0004] 目前，本领域急需解决传统治疗银肩病方法的弊端，如治疗麻烦(激光疗法），毒性 反应强(化疗药甲氨蝶呤)和易复发(激素类药物地塞米松)等，开发新的有效的银肩病治疗 手段。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题为是自身免疫性皮肤病的治疗提供一种新的有效手 段。
[0006] 本发明解决该技术问题的技术方案为提供了IL_35(白介素-35)蛋白在制备治疗 自身免疫性皮肤病的药物中的用途。
[0007] 其中，上述用途中所述的IL-35-FC融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 进一步的，上述用途中所述的IL-35为在IL-35的C末端连接IgGl的Fc片段而得的 IL-35-Fc融合蛋白。
[0009] 其中，上述用途中所述的IL-35-FC融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。 [0010]其中，上述用途中所述的IL-35-Fc融合蛋白每次的用量为5~100yg/kg体重。进一 步的，上述用途中所述的IL-35每次的用量为12.5~50yg/kg体重。
[0011]其中，上述用途中所述的自身免疫性皮肤病为银肩病、硬皮病或天疱疮中的至少 一种。
[0012] 在上述技术方案的基础上，本发明还提供了一种治疗自身免疫性皮肤病的药物。 该药物是以携带IL-35为主要活性成分添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。其中，所 述IL-35为融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0013] 进一步的，上述药物中所述的IL-35为在IL-35的C末端连接IgG的Fc片段而得的 IL-35-Fc融合蛋白。
[0014] 其中，上述药物中所述的IL-35-FC融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。
[0015] 进一步的，上述药物的剂型为注射剂。进一步的，上述药物的剂型为冻干制剂。
[0016] 其中，上述药物中所述的自身免疫性皮肤病为银肩病、硬皮病或天疱疮中的至少 一种。
[0017] 此外，本发明还提供了一种IL-35-Fc融合蛋白。该IL-35-Fc融合蛋白的结构为在 氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示的多肽的C末端连接IgG的Fc片段。
[0018] 其中，上述IL-35-Fc融合蛋白中所述的IgG的Fc片段为IgG 1的Fc片段。
[0019] 进一步的，IgG 1的Fc片段的氨基酸序列为SEQ ID NO.2
[0020] 更进一步，上述IL-35-Fc融合蛋白中所述的IL-35-Fc融合蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO .3所示。
[0021] 此外，本发明还提供了编码上述IL-35-Fc融合蛋白的基因。
[0022] 本发明创造性地将具有免疫抑制功能的IL-35及IL-35-Fc融合蛋白用于治疗银肩 病等自身免疫性皮肤病。在治疗过程中，IL-35-Fc融合蛋白在模型动物K14-VEGF转基因小 鼠中可以抑制Thl7细胞增殖、介导CD4+CD25+T细胞的活化和IL-10的产生，从而增强病灶微 环境的免疫负调控状态。同时IL-35-Fc融合蛋白可以在体内抑制巨噬细胞活化和增殖，并 抑制巨噬细胞和T细胞局部浸润，从而抑制了机体产生的过度免疫反应，对银肩病的治疗有 显著的效果。
[0023] 本发明的有益效果在于:本发明方案对自身免疫性皮肤病进行治疗的效果好，毒 副作用小，治疗简便，具有很好的开发价值，为银肩病、硬皮病或天疱疮等自身免疫性皮肤 病的治疗提供了新的选择。
【附图说明】
[0024] 图1 · IL-35-Fc融合蛋白纯化后western blotting验证蛋白纯度及分子量大小。1、 未转染组；2、pcDNA3.4空载体组；3、pcDNA3.4-IL-35-FC转染后所纯化的IL-35-Fc融合蛋 白；4、IL-35-Fc阳性对照蛋白。
[0025]图2. IL-35-Fc融合蛋白治疗K14-VEGF银肩病小鼠结束时的治疗效果图，A、治疗结 束时，小鼠耳朵组织表型图；B、银肩病严重程度的宏观评分细则PASI;C、H&E染色病理学检 测;D、Baker评分。
[0026]图3.流式检测K14-VEGF转基因小鼠脾脏和淋巴结中的巨噬细胞浸润情况。
[0027]图4.IL-35-FC融合蛋白治疗K14-VEGF银肩病小鼠结束后第60天的治疗效果，
[0028] A、治疗结束后第60天时，小鼠耳朵组织表型图；B、银肩病严重程度的宏观评分细 则PASI;C、H&E染色病理学检测;D、Baker评分。
[0029] 图5. IL-35-Fc融合蛋白治疗咪喹莫特诱导的银肩病小鼠模型效果图。
[0030] A. IL-35-FC融合蛋白治疗结束时，小鼠背部皮肤组织表型图；B、H&E染色。
【具体实施方式】
[0031]本发明为自身免疫性皮肤病的治疗提供了一种新的有效手段，即提供了IL-35蛋 白在制备治疗自身免疫性皮肤病的药物中的用途。这些自身免疫性皮肤病包括银肩病、硬 皮病或天疱疮等。
[0032] 进一步的，上述的IL-35蛋白为重组蛋白，为天然IL-35的两个异源亚基融合而成， 其氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0033]此外，上述用途中所述的的IL-35为在IL-35的C末端连接IgG的Fc片段而得的IL-35-Fc融合蛋白。进一步的，上述用途中所述的IL-35-Fc融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 3所示。
[0034] 而每次注射治疗时，上述的IL-35-Fc融合蛋白的用量为每次5~100yg/kg体重。优 选的，每次治疗时，上述用途中所述的IL-35-Fc融合蛋白的用量为每次12.5~50yg/kg体 重。
[0035] 本发明还提供了一种治疗自身免疫性皮肤病的药物。该药物是以IL-35为主要活 性成分添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。进一步的，上述的IL-35蛋白为重组蛋 白，为天然IL-35的两个异源亚基融合而成，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0036] 此外，所述的的IL-35为在IL-35的C末端连接IgG的Fc片段而得的IL-35-Fc融合蛋 白。优选的，上述的IL-35-Fc融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。显然，该药物可以 制成各种能起作用的常规注射、口服乃至外用剂型。优选，上述药物的剂型为注射剂。更优 选的，上述药物的剂型为冻干制剂为佳。所述自身免疫性皮肤病为银肩病、硬皮病或天疱疮 等。
[0037] 同时，本发明还提供了一种IL-35-Fc融合蛋白。该IL-35-Fc融合蛋白的结构为在 氨基酸序列为SEQ ID NO. 3所示的多肽的C末端连接IgG的Fc片段。其中的IgG的Fc片段为 IgGl的Fc片段。进一步的，IgG 1的Fc片段的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。而本发明也提 供了一种氨基酸序列为SEQ ID NO. 3所示的IL-35-Fc融合蛋白。并通过实验证明其可以在 体内抑制巨噬细胞活化和增殖，并抑制巨噬细胞和T细胞局部浸润，从而抑制了机体产生的 过度免疫反应，对银肩病的治疗有显著的效果。
[0038] 此外，本发明还提供了编码上述IL-35-Fc融合蛋白的基因。该基因的核苷酸序列 如SEQ ID NO .5所示。
[0039] 需要说明的是，本发明中生产和操作重组基因、重组载体、蛋白表达和纯化以及注 射剂的制备的相关技术是本领域技术人员可以根据公开的操作指南和手册完成的描述的 技术完成的。
[0040] 以下结合附图通过对【具体实施方式】的描述以详细说明但不限制本发明。
[0041 ]实施例一 IL-35-FC质粒表达载体的制备以及IL-35-FC蛋白的表达和纯化
[0042]质粒表达载体的构建：由南京金斯瑞公司合成需要的含有IL-35-Fc目的基因序列 (带信号肽的编码序列，其核苷酸序列为SEQ ID如.6所示）的？(^嫩3.1-11^354(3质粒，利 用PCR从pcDNA3.1-IL-35-Fc质粒中扩增IL-35-Fc基因全长序列，所扩增的IL-35基因全长 序列与pcDNA 3.4TQP〇?TA克隆载体进行连接，并转化细菌感受态，对长出的克隆先进行菌 落PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序比对分析，比对正确的即为构建成功的重组 IL-35-Fc表达质粒pcDNA 3.4-IL35-Fc。
[0043] 将表达质粒pcDNA3.4-IL-35-Fc转染悬浮培养的Expi293F细胞（购买自Life technology公司），转染第6天时，收集转染上清。将上清放到离心管中，3000rpm离心20min， 将细胞碎片全部沉淀掉，然后将上清用〇. 45μπι滤网过滤后，用超滤管浓缩培养上清。把浓缩 的上清通过液体交换装置，溶液换成蛋白纯化需要的缓冲液。将换好缓冲液的蛋白溶过柱 子，进行挂柱，最后洗脱柱子中的蛋白，得到IL-35-Fc融合蛋白备用。制备得到产物蛋白经 western blotting验证为目的蛋白（参见图1)。
[0044] 具体的纯化步骤为纯化柱用的是HiTrap rProtein A FF(购自GE公司），纯化过程 主要为：1)样品预处理，收集细胞上清，〇.45μπι滤器过滤，超滤。2)上样前，样品要用使用10 XPBS平衡，柱子预处理（10ml H2〇,5ml Elution buffer，IOml Binding buffer)。3)上样： 流速lml/min，上完样后，Binding buffer(20mM PBS ρΗ = 7·0)洗脱至无杂峰，加入5ml Elution buffer(0.1 M柠檬酸盐缓冲液ΡΗ=4·0)溶解，并加入 100μ1 IM Tris-HCL ρΗ=9·0 中和ΡΗ，得到氨基酸序列为SEQ ID从).3所示的11^-354(：融合蛋白。
[0045] 实施例二本发明IL-35-Fc融合蛋白治疗银肩病小鼠动物实验评估结果
[0046] 每组7只K14-VEGF转基因小鼠（购买自 Jackson Lab(Bar Harbor,ME,USA))(10周 龄)共分为2组，按照IL-35-Fc融合蛋白在小鼠体内表达动力学，我们每隔一天治疗小鼠一 次，共治疗10次，5yg/只/次(预实验注射剂量为每只小鼠2.5yg/只/次、5yg/只/次和I Oyg/ 只/次，最后确定最佳治疗剂量为5yg/只/次）。等治疗结束后，测量小鼠耳朵厚度，取小鼠耳 朵称量耳朵重量，按照PISA评分系统对小鼠耳朵组织进行各项评分，其中包括红肿、鳞肩、 红斑等。取耳朵组织进行H&E染色，按照Baker评分标准对耳朵组织进行评分。此治疗实验重 复3次。
[0047] 实验结果表明：与IgG组相比，IL-35-Fc融合蛋白治疗组（图中示为IL-35组）小鼠 耳朵组织发病不明显，而对照组小鼠在颈部和耳部表现出银肩病样的损伤，包括红肿、鳞 肩、红斑等。同时PASI评分也显示，IL-35-Fc融合蛋白的评分明显降低。H&E染色表明对照组 小鼠表皮角化过度伴有角化不全，角质层可见微脓肿，表皮增生成杵状，真皮乳头上延，真 皮层毛细血管扩张充血，血管周围可见淋巴细胞为主的炎症细胞浸润。Baker评分也显示， IL-35-Fc融合蛋白治疗组小鼠的评分明显降低(参见图2)。
[0048] 经IL-35-Fc融合蛋白治疗后，用流式检测K14-VEGF转基因小鼠脾脏和淋巴结中的 巨噬细胞浸润情况，结果显示，IL-35-Fc融合蛋白明显抑制小鼠脾脏组织中巨噬细胞的浸 润，而淋巴节中的巨噬细胞没有明显的变化(参见图3)。
[0049]为了研究IL-35-Fc融合蛋白对银肩病小鼠的治疗是否具有长期性，将IIL-35-Fc 融合蛋白治疗结束第60天的小鼠进行观察并测量小鼠耳朵厚度，取小鼠耳朵称量耳朵重 量，按照PISA评分系统对小鼠耳朵组织进行各项评分。取耳朵组织进行H&E染色，按照Baker 评分标准对耳朵组织进行评分。与IgG组相比，治疗结束后第60天后，IL-35-Fc融合蛋白治 疗组小鼠耳朵组织发病症状没有加重的迹象。而且PASI评分和Baker评分结果也说明，随着 时间的推移，IL-35-Fc融合蛋白治疗组的小鼠银肩病症状没有加重，但是IgG组的小鼠银肩 病病症明显加重(参见图4)。
[0050]实施例三本发明IL-35-FC融合蛋白治疗咪喹莫特MQ诱导的银肩病小鼠动物实 验评估结果。
[0051 ] 将购买的Babl/c小鼠分为两组进行治疗：IgG组，8只；IL-35-FC融合蛋白（5yg)，8 只（图中示为IL-35组）；共治疗七次后进行模型建立。将小鼠背部毛用剃毛刀剃干净，暴露 出背部皮肤，然后用5%咪喹莫特乳膏（頂〇)(62.5!^/只/次）涂抹背部皮肤。连续涂抹6天， 每天观察各族小鼠的发病情况。在建模的过程中继续按照上述治疗方案治疗三次，在最后 一次治疗结束后第二天，收集小鼠的皮肤组织。皮肤组织用来做组织病理检测，用H&E染色 进行银肩病皮损严重程度评价。结果显示，IgG组的小鼠背部皮肤出现大量鳞肩，皮肤厚度 明显增厚呈深红色且出现凹凸不平的褶皱；IL-35-Fc融合蛋白小鼠背部皮肤鳞肩减少，皮 肤厚度轻微增厚，褶皱较少。H&E染色结果显示，与IgG组小鼠相比，IL-35-Fc融合蛋白预防 组小鼠的表皮增厚、角化不全或角化过度等棘皮症状进展缓慢。同时，IL-35-Fc融合蛋白预 防组小鼠表皮的指突向真皮层的延长、起伏不明显，炎症细胞浸润较少，说明IL-35-Fc融合 蛋白对银肩病小鼠模型的预防作用效果是值得肯定的(参见图5)。
【主权项】
1. IL-35在制备治疗自身免疫性皮肤病的药物中的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的IL-35的为氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示。3. 根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的IL-35为在IL-35的C末端连接人 的IgGl的Fc片段而得的IL-35-Fc融合蛋白。4. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的IL-35-Fc融合蛋白的氨基酸序列为 SEQIDN0.3**。5. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的IL-35-Fc融合蛋白每次的用量为5~ 100yg/kg 体重。6. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述的IL-35-Fc融合蛋白每次的用量为 12 · 5~50yg/kg 体重。7. 根据权利要求7~11任一项所述的用途，其特征在于所述的自身免疫性皮肤病为银 肩病、硬皮病或天疱疮中的至少一种。8. 治疗自身免疫性皮肤病的药物，其特征在于：以IL-35为主要活性成分添加药学上可 接受的辅助性成分制备而成。9. 根据权利要求8所述的治疗自身免疫性皮肤病的药物，其特征在于:所述的IL-35的 氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示。10. 根据权利要求8或9所述的治疗自身免疫性皮肤病的药物，其特征在于:述的IL-35 为在IL-35的C末端连接IgG的Fc片段而得的IL-35-Fc融合蛋白。11. 根据权利要求10所述的治疗自身免疫性皮肤病的药物，其特征在于:其特征在于所 述的IL-35-FC融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDN0.3所示。12. 根据权利要求8~11任一项所述的治疗自身免疫性皮肤病的药物，其特征在于:所 述的药物的剂型为注射剂。13. 根据权利要求11所述的治疗自身免疫性皮肤病的药物，其特征在于:所述的药物的 剂型为冻干制剂。14. 根据权利要求11所述的治疗自身免疫性皮肤病的药物，其特征在于:所述的自身免 疫性皮肤病为银肩病、硬皮病或天疱疮中的至少一种。 15.IL-35-FC融合蛋白，其特征在于:所述IL-35-Fc融合蛋白的结构为在氨基酸序列为 SEQ ID从).3所示的11^-35融合多肽的(：末端连接人1861的？(3片段。16. 根据权利要求15所述的IL-35-Fc融合蛋白，其特征在于:所述IgG的Fc片段为IgG 1 的Fc片段。17. 根据权利要求16所述的IL-35-Fc融合蛋白，其特征在于:所述IL-35-Fc融合蛋白的 氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。18. 编码权利要求15~17-项所述的IL-35-Fc融合蛋白的基因。
【文档编号】A61P17/02GK106075401SQ201610378480
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】邓洪新, 张俊凤, 黎鸣, 黎一鸣, 魏于全
【申请人】四川大学