专利名称：测定幼稚细胞用试剂的制作方法
技术领域：
本发明是关于对含在血液等液体试样中的幼稚细胞进行分类和计数时所用试剂的发明。
在健康人的末稍血液中含有各种血球(红血球、白血球、血小板)。最初，血细胞是在骨髓中生成的，从未成熟的细胞分化，在成熟的过程中移送到血流中。
例如，粒细胞(中性白细胞、嗜酸性白细胞、嗜碱细胞)分别要经过(成髓细胞→前骨髓细胞→骨髓细胞→后骨髓细胞)→(杆状核细胞→分叶核细胞)的过程，从幼稚的血球向成熟的血球分化。对于健康人，后骨髓细胞以前的幼稚白血球不会出现在末稍血液中，杆状核细胞也少。可是在特殊情况下，例如，得了白血病等血液病、骨髓癌转移、重症感染时，往往就出现幼稚白血球。因此，测定幼稚白血球对于诊断疾病是极其重要而且有意义的。
作为血球的自动分类和计数的技术，现有通过对血球摄像，再将其图像进行处理的方法和使血球在液体中流动，而后把从每个血球得到的信号进行信号处理的方法。现阶段，从精密度、成本等诸方面考虑，使用流动系统的测定方法较好。
在流动系统中，可检测血球在液体中流动时每个血球的信号(例如由于光学特性的差异而得到的信号和由于电学特性的差异而产生的信号)。该方法可以分别举出检测散射光和荧光的流动系统信号检测计和在微孔中流过电流、检测血球通过该微孔时产生的电信号的血球计数装置的例子。后者又可进一步分为供给直流电流然后检测由于血球的电阻的不同而产生的信号的DC法和供给数MHz的高频电流、检测出由于血球的介电常数的不同而产生的信号的RF法。在DC法中可检测出与粒子的体积成比例大小的信号，RF法可检测出反映粒子的内部结构(核的大小)、构成物质情况的信号。
例如在①WO88/09504号公报、②特开平3-252556号公报中记载了联合使用DC法和RF法对白血球的5个类群及异常细胞进行分类和计数的方法。
在①中记载了使用聚氧乙烯型非离子表面活性剂或聚氧乙烯型阴离子表面活性剂对正常(成熟的)白血球的5个类群(淋巴细胞、单细胞、中性白细胞、嗜酸性白细胞、嗜碱细胞)及异常细胞进行分类、计数(例如在
图18中示出了淋巴母细胞n、成髓细胞l、其他未成熟粒细胞k、左方移动(leftshift)j的分布)。再者，所谓左方移动是指核的分叶少的中性白细胞(杆状核中性白细胞)的增加，但是在此是指杆状核中性白细胞而言。
在②中记载了在低渗透压、酸性的条件下使用聚氧乙烯型非离子表面活性剂对白血球的5个类群及其他异常细胞(图5示出了白血球病细胞等异常细胞e的分布)进行分类、计数。
另一方面，血球的稀释液和保存液也是公知的。例如已经知道的含有氨基酸的液体。可是这些液体是为了使氨基酸吸附在细胞膜外壁上以保持细胞的形态(保护细胞)而使用的。
上述①、②的技术虽可进行幼稚血球的分类和计数，但是以把成熟白血球分成5个类群作为第一目的。由于是附带地进行幼稚细胞的分类和计数，所以存在着具有不能分类的幼稚细胞以及其分类精密度不够等问题。
例如，单用聚氧乙烯型非离子表面活性剂，就存在着成熟白血球和幼稚血球的辨别不充分(成熟白血球的收缩小)及红血球的溶血不充分(血影细胞(ghost)大)等问题。
本发明着眼于幼稚细胞的分类和计数，其目的在于提供可提高其分类、计数的精密度的试剂。
本发明的目的在于提供含有下述(1)至(4)的物质的测定幼稚细胞用试剂，通过该试剂与含有幼稚白血球的被测试样混合，可使得幼稚白血球的各类群与其他细胞群产生能分辨程度的差异。
(1)用于固定血球的细胞质及细胞膜的用下式表示的聚氧乙烯型非离子表面活性剂R1-R2-(CH2CH2O)n-H[式中，R1表示碳原子数为10～25的烷基、链烯基或炔基;
R2表示O、
或COO;
n表示10～40的整数];
(2)用于损伤并缩小血球的细胞膜的增溶剂，选自以下2组中至少1种的增溶剂a)第1组增溶剂·N-月桂酰肌氨酸钠
·月桂酰甲基β-丙氨酸钠·月桂酰肌氨酸b)第2组增溶剂·正辛基葡糖苷·CHAPS(3-[(3-氯酰氨基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐)·CHAPSO(3-[(3-氯酰氨基丙基)二甲基铵]-2-羟基-1-丙磺酸盐)·MEGA8(辛酰基-N-甲基葡糖酰胺)·MEGA9(壬酰基-N-甲基葡糖酰胺)·MEGA10(癸酰基-N-甲基葡糖酰胺)·蔗糖单癸酸盐·N-甲酰基甲基亮氨酰基丙氨酸(3)用于固定血球的细胞质及细胞膜的氨基酸;
(4)液体的pH值为5.0～9.0、渗透压为150～600mOsm/kg(毫渗透压摩尔/千克)、电导率为6.0～9.0mS/cm(毫西门子/厘米)的缓冲液。
本发明中所使用的聚氧乙烯型非离子表面活性剂虽然可以使用上述各式所表示的物质，但合适的是加成摩尔数n为10～30 R1是碳原子数为10～20的烷基、链烯基或炔基 R2是O(氧原子)的物质。这些表面活性剂均衡地具有对红血球的溶血作用和对白血球的固定化作用这两种特性。特别合适的是C18H34O(CH2CH2O)15H、C18H34O(CH2CH2O)15H。
最合适的增溶剂是N-月桂酰肌氨酸钠，除此之外也可使用上述的其他增溶剂。对于使用浓度虽没有逐一说明，但只要调整到使红血球血影细胞及祼核的成熟白血球可以有效地收缩的浓度就可以了。
对于氨基酸，构成蛋白质的任何氨基酸均可使用。构成蛋白质的氨基酸如表1所示，大致可分为中性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸。若使用作为酸性氨基酸的谷氨酸时，其浓度为1～50g/l(优选8～12g/l，例如10.0g/l)。若使用作为中性氨基酸的脂肪族氨基酸-缬氨酸时，使用的浓度为1～50g/l(优选8～12g/l，例如10.0g/l)。
从幼稚细胞的固定、幼稚白血球的分类这方面考虑，特别合适的是含硫的氨基酸，最合适的是蛋氨酸(如表1所示细分类成氨基酸＞中性氨基酸＞脂肪族氨基酸＞含硫氨基酸＞蛋氨酸)。
另外，对于用于本发明的缓冲液，可以使用HEPES、磷酸缓冲液等各种缓冲液，并且最好向其中加入作为pH调节剂的氢氧化钠、作为渗透压调节剂的食盐等，把缓冲液的pH值调到5.0～9.0、渗透压调到150～600mOsm/kg、电导率调到6.0～9.0mS/cm。
通过将这样调制出的本发明的试剂与含有幼稚白血球的被测试样(具体指血液)混合，可以产生能把幼稚白血球的各类群与其他细胞群分辨出来这样程度的差异来。
本发明的试剂的重要作用如下(1)使用本发明的聚氧乙烯型非离子表面活性剂时，幼稚白血球的细胞膜较成熟白血球的细胞膜难以受到损伤。
(2)氨基酸及聚氧乙烯型非离子表面活性剂可从细胞膜的损伤处进入到幼稚白血球的细胞内，固定细胞内成分及细胞膜。
一般认为，聚氧乙烯型非离子表面活性剂的加成摩尔数n越小，其溶血作用越强，n越大，溶血作用越弱。按照本发明发现，n为10以上时，具有使细胞稳定的作用。
一般来说，细胞膜的强度(抵抗力)的顺序细分为成熟白血球＞幼稚白血球＞红血球。可是使用本发明的试剂时，意外地成为幼稚白血球＞成熟白血球＞红血球的顺序。即幼稚白血球较成熟白血球的损伤程度小。
本发明的试剂与血液混合时，可产生以下的作用。
在pH5.0～8.0的条件下，使用本发明的聚氧乙烯型非离子表面活性剂时，各细胞均受到损伤，但其损伤的程度有差别。即红血球的细胞膜受到损伤，红血球立即溶血。成熟白血球的细胞膜受到损伤，细胞内成分全部溶出，成为裸核化状态。幼稚白血球的细胞膜也受到损伤，但是在细胞内成分溶出之前，聚氧乙烯型非离子表面活性剂及氨基酸从细胞膜的损伤处侵入到细胞内，使细胞膜及细胞内成分固定。因此，可在保持细胞膜、细胞质的状态下，使幼稚白血球得到固定。
对细胞进行分类时，要在细胞间产生能够分辨的差异，并且需要使这种状态维持一定的时间。为此，以前的方法是在使用表面活性剂后，添加固定化剂，固定细胞。例如在特开昭54-22891号(USPNo.4099917)中记载了使用甲醛作为固定化剂，在特开昭61-502277号(USPNo.4751179)中记载了使用戊二醛作为固化剂。可是本申请中的固定化方法与以前的方法不同。以前的固定方法是从外部作用在细胞膜上进行的，而本申请的固定是在细胞内部进行的。
然而，在上述的状态下，幼稚白血球和成熟白血球、红血球血影细胞的区别还是不充分的。当通过增溶剂使得红血球血影细胞和裸核化的成熟白血球收缩，便有可能把各幼稚白血球与成熟白血球、红血球血影细胞区分开来。
通过计测在形态上产生差异的每个血球，可以对幼稚白血球进行稳定的、精度良好的分类和计数。图1表示使用DC法及RF法得到的二维散布图的模式图。a、b、c、d分别是原始细胞(包含粒细胞系的原始细胞a1及淋巴细胞系的原始细胞a2)、骨髓细胞和后骨髓细胞、前骨髓细胞、杆状核中性白细胞。e是红血球血影细胞及成熟白血球。可以看到红血球和成熟白血球已经收缩到可以完全与各类幼稚白血球区分的程度。
如果首先将血液和含有氨基酸的液体混合，接着在其混合液中加入上述表面活性剂时，从最终的组成上来看与本发明中使用的试剂是相同的，但此时不会产生与本发明相同的作用和效果。这两者之间，在作用和效果上有很大的差别。现说明如下在前者的情况下，氨基酸作用在细胞膜外部，首先保持了细胞的形态。而后，即使向其中添加表面活性剂，但由于氨基酸对细胞的保护机能业已产生作用，所以表面活性剂就不能充分发挥作用，即不能对幼稚白血球进行分类。为了使幼稚白血球产生充分的差别，有必要在氨基酸对细胞产生保护机能之前，使得细胞膜损伤，而且在损伤的同时，使氨基酸侵入到细胞内部。另外，在损伤细胞膜后，即使添加氨基酸也不会产生与本发明相同的作用和效果。重要的是让氨基酸不是在细胞外部而是在内部产生作用。为此，需要将氨基酸和上述表面活性剂包含在同一液体中。
此外，使用本发明的试剂时，不仅使用电阻抗检测方法(DC法、RF法)，也可以使用光学式流动信号检测计。检测出流动信号检测计的前方散射光FSC和侧方散射光SSC，可得到以前方散射光强度FSC和侧方散射光强度SSC为轴的散布图，该图几乎与图1的散布图相同。前方散射光反映了细胞的外部情况(大小)、侧方散射反映了内部情况(核的大小和复杂程度)。由此可以知道DC信号强度DC和前方散射光强度FSC、RF信号强度RF和侧方散光强度SSC是分别相对应的。
以下对本发明的试剂的合适实施例加以说明。
实施例1试剂组成①聚氧乙烯型非离子表面活性剂
C18H34-O-(CH2CH2O)16-H 24.0g②增溶剂(阴离子表面活性剂)-N-月桂酰肌氨酸钠1.5g③氨基酸(含硫氨基酸)DL-蛋氨酸20.0g④缓冲液HEPES12.0gNaOH(1当量)0.3g⑤渗透压调节剂NaCl4.0g⑥水使整个体积成为1000ml的量用上述组成的试剂，将血液稀释到256倍。在pH值为6.8、π(渗透压)为350mOsm/kg·H2O、ρ(电导率)为7.4mS/cm、液体温度为33℃的条件下，恒温13秒后，在6秒内用RF/DC法计测各个细胞。
图2、3、4是以得到的RF信号强度和DC信号强度为轴的二维散布图的例子。各图是不同血液试样的测定结果。图2是从慢性骨髓性白血病患者、图3是从出现淋巴系的幼稚细胞的患者、图4是从健康人采取的末稍血液的测定结果。
图2的试样是含有很多原始细胞(成髓细胞)、骨髓细胞、后骨髓细胞、前骨髓细胞及杆状核细胞的试样，但它们是以原始细胞(成髓细胞)的集团a1、骨髓细胞及后骨髓细胞的集团b、前骨髓细胞的集团c、杆状核细胞的集团d的状态分布的。另外各集团a1、b、c、d分别是成髓细胞、骨髓细胞及后骨髓细胞、前骨髓细胞、杆状核细胞的集团这一结果是通过测定从血液试样中分离采集的各细胞试样、并且通过视算法的相关试验而确认的。再者，e是红血球血影细胞和成熟白血球集团。可以看出它们都经过了充分的收缩，不会妨碍对幼稚细胞的分类。
图3的试样中所含有的幼稚细胞是淋巴系的幼稚细胞(淋巴肿瘤细胞和异型淋巴细胞)，这些细胞分布成f。f是淋巴系的幼稚细胞这一结果是通过与上述相同的手段而确认的。此外，e是红血球血影细胞及成熟白血球的集团。
图4的试样是健康人的。其中只含有微量的杆状核细胞(杆状核中性白细胞)，不含有其他的幼稚细胞。杆状核细胞分布成d，这与图2分布的领域相同。
图5、6分别是急性淋巴性白血病患者、急性骨髓性白血病患者的测定结果。a2表示淋巴性的原始细胞、a1表示骨髓性的原始细胞的集团。使用细胞分类计确认了各集团是淋巴母细胞、成髓细胞。
这样，就可以把幼稚白血球与成熟的白血球区分出来，幼稚白血球又可分类成原始细胞、骨髓细胞和后骨髓细胞、前骨髓细胞、杆状核细胞，进而也可分类成淋巴母细胞、成髓细胞。
上述实施例1中是在以下的范围内使用的。
①C18 34O(CH2CH2O)16H 5～50g(20～28g)②月桂酰肌氨酸钠0.1～2.0g(1.2～2.0g)③DL-蛋氨酸1～50g(16～24g)
④pH5.0～10.0(6.0～8.0)⑤π150～500(250～380)⑥ρ3.0～12.0(6.0～9.0)⑦稀释倍数100～500(200～300)⑧液温25.0～40.0(30.0～34.0)＊()是优选的范围实施例Ⅱ使用酸性氨基酸谷氨酸代替实施例Ⅰ的氨基酸(含硫氨基酸)-蛋氨酸。使用量为10.0g(浓度为10.0g/l)。其他条件相同。此外，谷氨酸的可以使用范围是1～50g，优选8～12g。
实施例Ⅲ使用支链氨基酸缬氨酸代替实施例Ⅰ的氨基酸(含硫氨基酸)-蛋氨酸。使用量为10.0g(浓度为10.0g/l)。其他条件相同。此外，缬氨酸的可以使用范围是1～50g，优选8～12g。
实施例Ⅳ改变实施例Ⅰ的聚氧乙烯型非离子表面活性剂和增溶剂。分别使用C18H34-O-(CH2CH2O)15-H和CHAPS。C18H34-O-(CH2CH2O)15-H的使用量为5.0g(5.0g/l)、CHAPS的使用量为0.3g(0.3g/l)，其他条件相同。可以使用的范围，对于C18H34O(CH2CH2O)15-H是1～9g(优选3～7g)、对于CHAPS是0.1～0.5g(优选0.2～0.4g)。另外，使用的氨基酸是蛋氨酸。
实施例Ⅴ改变实施例Ⅰ的聚氧乙烯型非离子表面活性剂、增溶剂及氨基酸。分别使用C18H34-O-(CH2CH2O)15-H、MEGA8、缬氨酸。C18H34-O-(CH2CH2O)15-H的使用量为5.0g(5.0g/l)、MEGA8为5.0g(5.0g/l)、缬氨酸为20.0g(20.0g/l)。其他条件相同。可以使用的范围，对于C18H34O(CH2CH2O)15-H是1～9g(优选3～7g)、MEGA8是1～8g(优选4～6g)、缬氨酸是1～50g(优选16～24g)。
比较这些Ⅰ～Ⅴ的实施例时，可看出各幼稚白血球集团的出现区域相同。分类结果(计数值)的精密度以实施例Ⅰ为最佳，其后的顺序为Ⅱ及Ⅲ、Ⅳ及Ⅴ。
实施例Ⅰ-Ⅴ的试剂组成归纳在以下表2中。
按照本发明可以进行幼稚白血球的分类和计数。
进而，还可把幼稚白血球再细分并进行分类和计数。
另外，本发明的试剂由于是单一液体，所以适用于自动分析装置。
还有，不仅可以在电阻抗性检测装置、也可在光学式的装置中使用。
图的简单说明图1表示使用本发明的试剂测定血液试样时，以DC信号强度和RF信号强度为轴的二维散布图的模式图的例子。
图2表示使用本发明的试剂测定从慢性骨髓性白血病患者采取的末稍血液时，以DC信号强度和RF信号强度为轴的二维散布图。
图3表示使用本发明的试剂测定从出现淋巴系幼稚细胞的患者采取的末稍血液时，以DC信号强度和RF信号强度为轴的二维散布图。
图4表示使用本发明的试剂测定从健康人采集的末稍血液时，以DC信号强度和RF信号强度为轴的二维散布图。
图5表示使用本发明的试剂测定从急性淋巴性白血病患者采取末稍血液时，以DC信号强度和RF信号强度为轴的二维散布图。
图6表示使用本发明的试剂测定从急性骨髓性白血病患者采取的末稍血液时，以DC信号强度和RF信号强度为轴的二维散布图。
权利要求
1.测定幼稚细胞用试剂，它含有下述(1)～(4)的物质，通过该试剂与含有幼稚白血球的被测试样混合，可以使得幼稚白血球的各类群与其他细胞群产生能分辨程度的差异。(1)用于固定血球的细胞质及细胞膜的用下式表示的聚氧乙烯型非离子表面活性剂R1-R2-(CH2CH2O)n-H[式中，R1表示碳原子数为10～25的烷基、链烯基或炔基；R2表示O、
或COO；n表示10～40的整数]；(2)用于损伤并缩小血球的细胞膜的增溶剂，选自以下2组中至少1种的增溶剂a)第1组增溶剂·N-月桂酰肌氨酸钠·月桂酰甲基β-丙氨酸钠·月桂酰肌氨酸b)第2组增溶剂·正辛基葡糖苷·CHAPS(3-[(3-氯酰氨基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐)·CHAPSO(3-[(3-氯酰氨基丙基)二甲基铵]-2-羟基-1-丙磺酸盐)·MEGA8(辛酰基-N-甲基葡糖酰胺)·MEGA9(壬酰基-N-甲基葡糖酰胺)·MEGA10(癸酰基-N-甲基葡糖酰胺)·蔗糖单癸酸盐·N-甲酰基甲基亮氨酰基丙氨酸(3)用于固定血球的细胞质及细胞膜的氨基酸；(4)液体的pH值为5.0～9.0、渗透压为150～600m0sm/kg(毫渗透压摩尔/千克)、电导率为6.0～9.0mS/cm(毫西门子/厘米)的缓冲液。
2.权利要求1所述的试剂，其中氨基酸是构成蛋白质的氨基酸。
3.权利要求2所述的试剂，其中氨基酸是含硫氨基酸。
4.权利要求3所述的试剂，其中含硫氨基酸是蛋氨酸。
5.权利要求2所述的试剂，其中氨基酸是谷氨酸。
6.权利要求2所述的试剂，其中氨基酸是缬氨酸。
全文摘要
本发明提供了可以对含在血液等液体试样中的幼稚细胞进行分类和计数的试剂。它是含有下述(1)～(4)的物质的测定幼稚细胞用试剂，通过该试剂与含有幼稚白血球的被测试样混合，可以使得幼稚白血球的各类群与其他细胞群产生能分辨程度的差异(1)用于固定血球的细胞质及细胞膜的聚氧乙烯型非离子表面活性剂，(2)用于损伤并缩小血球的细胞膜的增溶剂，(3)用于固定血球的细胞质及细胞膜的氨基酸，(4)液体的pH值为5.0～9.0、渗透压为150～600mOsm/kg、电导率为6.0～9.0mS/cm的缓冲液。
文档编号G01N33/48GK1095481SQ9410290
公开日1994年11月23日 申请日期1994年3月19日 优先权日1993年3月19日
发明者辻野幸夫, 森川隆, 滨口幸雄 申请人:东亚医用电子株式会社