用于在植物中产生高水平PUFA的改进方法与流程

文档序号:25541916发布日期:2021-06-18 20:38
用于在植物中产生高水平PUFA的改进方法与流程

本发明涉及用于产生基因修饰植物的材料和方法,特别地所述植物用于产生至少一种不饱和或多不饱和脂肪酸。本发明还涉及鉴定向植物或植物细胞传递不饱和脂肪酸代谢特性的基因,并且总体上涉及磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(pdct)领域。

极长链多不饱和脂肪酸(vlc-pufa),如花生四烯酸(ara;20:4ω6)、二十碳五烯酸(epa;20:5ω3)和二十二碳六烯酸(dha;22:6ω3)、对人类健康具有可显示的益处(swanson等人,2012;haslam等人,2013),但人类不能以足够量合成这些脂肪酸。转基因油料作物是vlc-pufa的备选来源:这类系统最少地需要两个去饱和步骤和一次延伸,以使植物衍生的亚油酸(la;18:2ω6)和ala转化成vlc-pufa(venegas-caleron等人,2010)。

在植物中产生不常见脂肪酸时,通过诸如酰基-coapc、dag和tag等汇集物池改进脂肪酸流量特别有意义(wu等人,2005)

已经显示埃塞俄比亚芥(brassicacarinata)具有作为vlc-pufa生产的宿主植物的潜力(cheng等人,2010)。ruiz-lopez等人(2014)显示作为宿主植物,亚麻荠(camelinasativa)也良好发挥作用,并且能够显示产生与鱼油中所存在相似的vlc-pufa水平。多个小组也已经使用芥菜(brassicajuncea)(wu等人2005)和欧洲油菜(brassicanapus)作为宿主植物产生各种脂肪酸,包括vlc-pufa、γ-亚麻酸(gla)和硬脂艾杜糖酸(sda)(petrie等人,2014;ursin等人,2003;liu等人,2001)。

当参与epa和dha生物合成的酶(及其多种前体)异位表达时,在这些植物之间观察到vlc-pufa产生的差异,这可以部分地归因于脂肪酸合成途径中发挥作用的内源酶的差异(cheng等人,2010)。这类差异可以反映在这些植物的脂肪酸特征中;例如,亚麻荠属(camelina)种子油的ala(18:3)高,水平约30%(iskandarov等人,2014),而欧洲油菜(b.napus)的ala水平通常是约10%(singer等人,2014)并且埃塞俄比亚芥种子油平均为18%(genet等人2004)。更好地理解影响epa和dha产生的内源代谢将导致改善这些脂肪酸在任何宿主植物产生的策略。

鉴定拟南芥属(arabidopsis)(拟南芥(arabidopsisthaliana))rod1基因编码的磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(pdct)(lu等人,2009)导致对多不饱和脂肪酸(pufa)掺入三酰甘油(tag)的理解改进。pdct通过在从头合成的二酰甘油(dag)和磷脂酰胆碱(pc)之间交换磷酸胆碱首基发挥作用;pc随后可以转化回dag并随后转化成tag(lu等人,2009)。这类交换在拟南芥种子中显著有助于pufa流入tag池(bates等人,2012)。

为了使得用多不饱和ω-3-脂肪酸强化食物和/或饲料成为可能,仍迫切需要用于产生、尤其在真核系统中产生前述每种长链多不饱和脂肪酸的简单、廉价方法。

本发明因此涉及提供轻易生产vlc-pufa的可靠来源。为此目的,本发明还涉及提供可靠产生vlc-pufa、优选地epa和/或dha的植物。本发明还涉及提供获得、改进和种植这类植物的手段和方法,并且还涉及从这类植物、特别地从其种子中可获得的含有vlc-pufa的油。另外,本发明提供这类植物和其部分的用途。

拟南芥rod1突变体与亚麻pdct(wickramarathna等人,2015)和蓖麻pdct(hu等人,2012)的互补作用恢复拟南芥种子的脂肪酸特征,显示来自不同物种的pdct通过相似机理发挥作用。

欧洲油菜、埃塞俄比亚芥和亚麻荠是多倍体物种,各自具有多于一个拷贝的pdct基因。这三个物种内部及之间pdct基因的差异可以影响多不饱和脂肪酸在转基因植物中产生。使用拟南芥作为模型系统研究来自欧洲油菜、埃塞俄比亚芥和亚麻荠的pdct对种子中pufa产生的影响,发现各个pdct群组具有影响种子中pufa产生的不同功能特性。

现在已经令人惊讶地发现植物、植物细胞或植物种子中本发明磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(pdct)(例如,pdct19)的增加表达、细胞活性增加或从头表达可以在能够产生dpa、dha和/或epa且表达δ-6去饱和酶的植物、植物细胞或种子中增加dpa、dha和/或epa的水平。

此外,发现本发明pdct(例如pdct19)的增加表达、细胞活性增加或其从头表达导致产生其中ala和la合计水平(ala加la水平)低于c18、c20和c22pufa合计水平的植物、其部分、植物细胞、植物种子或植物种子油。

另外,另人惊讶地,观察到在植物、植物细胞和/或植物种子中本发明pdct(例如pdct19)的增加表达、活性增加或从头表达可以在产生c18、c20和/或c22脂肪酸且表达δ-6去饱和酶的植物、植物细胞和/或植物种子中增加δ6去饱和酶转化效率。

因此,通过利用本发明的pdct,可以在植物中改进δ6去饱和酶转化效率,产生ala和la合计水平低于c18、c20和c22pufa合计水平的植物,和在植物中增加pufa产生,

“pufa的水平”意指作为存在于种子或种子油中的总脂肪酸的百分数、优选地作为重量百分数的pufa水平。

优选地,植物、植物细胞和/或种子还表达δ-6去饱和酶和/或δ-6延伸酶。

本发明也提供一种在植物、植物细胞、植物种子或其部分中产生sda、eta、gla、hgla、epa、dha和/或dpa的方法,所述方法包括提供能够产生sda、eta、gla、hgla、epa、dha和/或dpa的植物、种子或植物细胞且所述植物、种子和/或植物细胞功能性表达:

编码δ-12去饱和酶活性的至少一种核酸序列

编码ω3去饱酶活性的至少一种核酸序列,

编码δ-6-去饱和酶活性的至少一种核酸序列,和

编码δ-6延伸酶活性的至少一种核酸序列,和

编码δ-5去饱和酶活性的至少一种核酸序列,和

编码δ-5延伸酶活性的至少一种核酸序列,和

编码δ-4去饱和酶活性的至少一种核酸序列,和

其中至少一种去饱和酶使用磷作为底物,并且其中植物具有一种或多种本发明pdct(例如pdct19)的增加活性。

因此,本发明提供一种方法,所述方法包括提供或产生具有一种或多种pdct的增加活性或从头表达的植物、其部分、植物细胞和/或植物种子,所述pdct选自:

(a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct19的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct19活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:35、37和/或47;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct19的片段,其具有pdct19活性。

根据本发明,可以例如通过从头表达,例如经相应的表达构建体转化后,或通过增加内源活性,增加pdct19的活性。因此,本发明的方法包括还增加至少一种内源性pdct19的内源活性。

根据本发明,可以通过引入并表达编码如本文所述的pdct19的表达构建体,在埃塞俄比亚芥(c.carinata)中增加pdct19活性。例如,pdct19活性可以是如表1中所述的来自欧洲油菜或亚麻芥(carinatasativa)或芥菜的pdct19基因。在一个实施方案中,通过增加如表5中所显示的欧洲油菜pdct1的活性增加欧洲油菜中的pdct19活性。此外,可以在欧洲油菜中通过增加如表5中所述的非内源pdct1(例如来自芥菜或亚麻芥(carinatasativa)的pdct)的活性,增加pdct1活性。在一个实施方案中,通过增加如表5中所显示的芥菜pdct1的活性增加芥菜中的pdct1活性。此外,可以在芥菜中通过增加如表5中所述的非内源pdct1(例如来自欧洲油菜或亚麻芥(carinatasativa)的pdct)的活性,增加pdct1活性。在一个实施方案中,通过增加如表5中所显示的亚麻荠pdct1的活性增加亚麻荠中的pdct1活性。此外,可以在亚麻荠中通过增加如表5中所述的非内源pdct1(例如来自芥菜或欧洲油菜的pdct)的活性,增加pdct1活性。

根据本发明,还可以例如通过从头表达,例如经相应的表达构建体转化后,或通过增加内源活性,增加pdct1的活性。因此,本发明的方法包括还增加至少一种pdct1的活性,其中所述pdct1选自:

(a)与seqidno2、4、6、8、10、12、14、16、40、42、44和/或46具有至少80%序列同一性的pdct1;

(b)由多核苷酸编码的pdct1,所述多核苷酸与seqidno:1、3、5、7、9、11、13或15具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct1,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno2、4、6、8、10、12、14、16、40、42、44和/或46的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno2、4、6、8、10、12、14、16、40、42、44和/或46的pdct1的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct1,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:1、3、5、7、9、11、13或15;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct的片段,其具有pdct1活性。

此外,根据本发明的方法,还可以降低pdct3和/或pdct5的活性。pdct3和/或pdct5可以例如选自

(a)与seqidno:18、20、22、24、26、28、30、32、50、52、54、56、58和/或60具有至少80%序列同一性的pdct3和/或pdct5;

(b)由多核苷酸编码的pdct3和/或pdct5,所述多核苷酸与seqidno:17、18、19、21、23、25、27、29或31具有至少80%序列同一性;

(c)由核苷酸编码的pdct3和/或pdct5,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:18、20、22、24、26、28、30、32、50、52、54、56、58和/或60的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno2、4、6、8、10、12、14、16、40、42、44和/或46的pdct3和/或pdct5的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct3,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:17、19、21、23、27、29、31、49、51、53、55和/或57;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct的片段,其具有pdct3和/或pdct5活性。

根据本发明,在本发明的方法中降低pdct3和/或pdct5的活性,例如通过表达任何减少或抑制表达的物质如转录因子、核酶、微rna或反义分子;或通过整合入编码pdct3或pdct5序列或调节其表达或活性的基因或调节元件或使编码或调节pdct3和/或pdct5表达或活性的基因或调节元件突变来降低,其中诸措施导致抑制pdct3或pdct5活性或导致多肽从具有插入物的那个基因根本不表达或导致无活性多肽从编码对照或野生型细胞中pdct3或pdct5的基因表达。

因此,根据本发明的方法,消耗、抑制、降低或减少或阻断本发明方法中所用的植物、植物细胞或种子中至少一种pdct3和/或pdct5的活性与用来实现减少、消耗、抑制、降低或阻断活性的方法无关。

因此,在pdct3和/或pdct5活性或表达的语境下,术语“降低”在本文中意指,与如本文所述的对照相比,降低、阻断、消耗或抑制植物、细胞、种子或其部分中pdct3和/或pdct5的活性。例如,在本文所述的测定法中,不能测量到pdct3和/或pdct5活性或能测量到其降低的活性。例如,术语“降低”还涵盖在植物、植物细胞或种子中突变或敲除编码pdct3或pdct5的基因。因此,术语“降低”还包括突变或敲除产生pufa的油籽作物(例如欧洲油菜、埃塞俄比亚芥、芜青(b.rapa)、亚麻荠或芥菜)的pdct3和/或5或表达靶向所述植物中pdct3和/或pdct5(例如包含如序列表中所示欧洲油菜序列、亚麻荠序列或芥菜序列的基因)的反义rna、核酶或微rna分子。

任选地,本发明的方法包括从植物、植物种子或植物细胞分离油的步骤。

因此,如果一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(pdct)酶具有磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(pdct)活性并且进一步地在包括于表达δ6延伸酶和δ6去饱和酶的拟南芥rod1突变体内表达pdct的功能性分析中,ala和la水平低于c18、c20和c22pufa水平且δ6去饱和酶转化率增加,则将它视为本发明的pdct活性或“pdct19”。实施例中显示相应功能性试验的示例。本文中将这种活性描述为“本发明的pdct活性”或“pdct19活性”。优选地,本发明的pdct与seqidno.36、38和/或48具有80%或更高同一性。优选地,pdct不是亚麻荠c15多肽,例如,如seqidno:34中所示。例如,δ-6去饱和酶是磷脂依赖性的。

此外,根据本发明,如果在功能性分析中包括在表达δ6延伸酶和δ6去饱和酶的拟南芥中表达一种pdct,并且该pdct具有磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(pdct)活性,其中δ6延伸酶转化率增加,则该pdct视为“pdct1”。优选地,总pufa水平增加。优选地,pdct1与seqidno.2和/或4、优选地还与seqidno.6、8、10和/或12具有80%或更高同一性。甚至更优选地还与seqidno.14或16具有80%的同一性。优选地δ-6去饱和酶是磷脂依赖性的。

此外,根据本发明,如果在功能性分析中包括在表达δ6延伸酶和δ6去饱和酶的拟南芥rod1突变体中表达一种pdct,并且该pdct具有磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(pdct)活性,并且其中δ6延伸酶转化率降低,则该pdct视为“pdct3”或“pdct5”。例如,eta水平也降低。优选地,pdct3和/或pdct5与seqidno:18、20、22、24、26、28、30、32、50、52、54、56、58和/或60具有80%或更高同一性。优选地,pdct3与seqidno.18、22或24具有至少80%的同一性。优选地,pdct5与seqidno.20、26或28具有至少80%的同一性。优选地,δ-6去饱和酶是酰基coa依赖性的。

根据本发明,可以例如通过从头表达,例如经相应的表达构建体转化后,或通过增加内源活性,增加pdct19的活性。因此,本发明的方法包括还增加至少一种内源性pdct19的内源活性。

水平增加或脂肪酸增加或脂肪酸的组合增加或pufa增加或总pufa增加或相似的表达指与对照相比,具体化合物或化合物的组合增加。例如,所述化合物或化合物的组合增加是来自植物、植物细胞或植物种子的相应提取物内部的相对增加。根据本发明,脂肪酸或脂肪酸(例如,一种pufa或多种pufa,如多种vlcpufa)组合的增加是在提取自植物、植物细胞或植物种子的油或脂肪酸中按体积百分数或重量百分数、优选地重量百分数计量。例如,来自植物、植物细胞或植物种子或来自植物、植物细胞或植物种子的提取物的含量和组成可以如实施例中所示那样测量。

如本发明中所用的“总pufa”指gla18:3n-6、sda18:4n-3、dgla20:3n-6、etra20:3n-3、eta20:4n-3、ara20:4n-6、epa20:5n-3、dpa22”5n-3和dha22:6n-3的水平。

“总”或“新”pufa的水平意指gla18:3n-6、sda18:4n-3、dgla20:3n-6、etra20:3n-3、eta20:4n-3、ara20:4n-6、epa20:5n-3、dpa22”5n-3和dha22:6n-3的水平。例如,该术语不包括(18:2n-6)和ala(18:3n-3)。

根据本发明,不饱和脂肪酸优选地是这样的多不饱和脂肪酸,它们是包含至少两个、更优选地至少三个和甚至更优选地至少或正好4个碳-碳双键的脂肪酸。不饱和脂肪酸,包括多不饱和脂肪酸,通常是技术人员已知的,重要的不饱和脂肪酸划分成ω-3、ω-6和ω-9系列,无任何预期限制。ω-6系列不饱和脂肪酸例如包括并且而不限于γ-亚麻酸(18:3n-6;gla)、二-高-γ-亚麻酸(c20:3n-6;dgla)、花生四烯酸(c20:4n-6;ara)、肾上腺酸(也称作二十二碳四烯酸或dta;c22:4n-6)和二十二碳五烯酸(c22:5n-6)。ω-3系列的不饱和脂肪酸例如包括并且而不限于硬脂艾杜糖酸(18:4n-3;sta或sda)、二十碳三烯酸(c20:3n-3;eta)、二十碳四烯酸(c20:4n-3;eta)、二十碳五烯酸(c20:5n-3;epa)、二十二碳五烯酸(c22:5n-3;dpa)和二十二碳六烯酸(c22:6n-3;dha)。不饱和脂肪酸还包括具有超过22个碳且具有4个或更多个双键的脂肪酸,例如并且而不限于c28:8(n-3)。ω-9系列不饱和脂肪酸例如包括并且而不限于米德酸(20:3n-9;5,8,11-二十碳三烯酸)、芥酸(22:1n-9;13-二十二碳烯酸)和神经酸(24:1n-9;15-二十四碳烯酸)。其他不饱和脂肪酸是二十碳二烯酸(c20:2d11,14;eda)和二十碳三烯酸(20:3d11,14,17;etra)。

在本发明的方法中,产生多种在野生型作物植物中非自然存在、尤其在油籽作物植物中不存在的vlc-pufa和中间体,不过这些vlc-pufa和中间体可以存在于多种其他生物中。这些脂肪酸包括但不限于18:2n-9、gla、sda、20:2n-9、20:3n-9、20:3n-6、20:4n-6、22:2n-6、22:5n-6、22:4n-3、22:5n-3和22:6n-3。

根据本发明,代谢特性优选地是ω-6型和/或ω-3型不饱和脂肪酸的产生和特别优选地产量。这种产量优选地定义为所述脂肪酸相对于总脂肪酸提取物、优选地植物或种子油的百分数。因此,优选地本发明的分析方法涉及测量不饱和脂肪酸的量和/或浓度、优选地具有至少20个碳原子长度(例如18、20和22个碳原子长度)并属于ω-3或ω-6系列的不饱和脂肪酸的量和/或浓度。

优选地,dpa、dha和/或epa水平在从根据本发明方法提供的植物、植物细胞或种子衍生或分离的脂质或油中或脂肪酸组合物中增加。

对植物提取物、优选地植物油或植物脂质测定量和/或浓度。术语”脂质”是指分子的复杂混合物,所述分子包含化合物如固醇、蜡、脂溶性维生素如生育酚和类胡萝卜素/维甲酸、鞘脂、磷酸甘油酯、糖脂如糖鞘脂、磷脂如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油、单酰甘油酯、二酰甘油酯、三酰甘油酯或其他脂肪酸酯如乙酰辅酶a酯。可以使用本领域技术人员熟知的方案,通过溶剂提取法,从生物样品,如真菌、藻类、植物、叶、种子或其提取物获得“脂质”(例如,如bligh,e.g.和dyer,j.j.(1959)canj.biochem.physiol.37:911-918中所述)。

术语“油”指包含酯化成甘油三酯的不饱和脂肪酸和/或饱和脂肪酸的脂肪酸混合物。油还可以包含游离脂肪酸。脂肪酸含量可以例如在通过酯交换使脂肪酸转化成甲基酯,借助gc分析测定。多种脂肪酸在油或脂肪中的含量可以变动,尤其取决于来源。植物油中的大部分脂肪酸已知在三酰甘油酯中酯化。另外,本发明的油可以包含其他分子种类,如单酰甘油酯、二酰甘油酯、磷脂或包含脂质的任何分子。另外,油可以包含小量的本发明多核苷酸或载体。然而,仅通过高度灵敏的技术如pcr才可以检出这种少的量。可以通过从任何含有脂质的生物组织提取脂质获得油并且回收的油的量取决于组织中存在的三酰甘油酯的量。从生物材料提取油可以按多种方式实现,包括溶剂提取和机械提取。具体而言,提取卡诺拉油菜油一般涉及溶剂提取和机械提取这两者,其产物经合并以形成粗制油。粗制卡诺拉油菜油经进一步纯化,以移出磷脂、游离脂肪酸、色素和金属及通过依次脱胶、精制、漂白和脱嗅,移出散发气味的化合物。这些步骤后的终产物是精制、漂白和脱嗅的油,其优势地包含三酰甘油形式的脂肪酸。

本发明的方法包括提供和/或产生植物的步骤。根据本发明,术语“植物”应意指处于任何发育阶段的植物或其部分。特别地,术语“植物”在本文中应理解成指示愈伤组织、苗、根、茎、枝、叶、花、花粉和/或种子和/或其任何部分。植物可以是单子叶植物或双子叶植物并且优选地是作物植物。作物植物包含芸苔属物种(brassicasp.)、谷物、苜蓿、向日葵、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟和烟草。植物优选地是油料植物。优选的植物属于十字花目(brassicales)、特别优选属于家族十字花科(brassicaceae)。

甚至更优选地是油籽作物的植物,例如亚麻荠(camelinasativa)、芸苔属物种(brassicasp.)、brassicaaucheri、巴利阿里芸苔(brassicabalearica)、brassicabarrelieri、埃塞俄比亚芥(brassicacarinata)、埃塞俄比亚芥x欧洲油菜、埃塞俄比亚芥x芜青(brassicarapa)、埃塞俄比亚芥x芥菜(brassicajuncea)、宝塔花菜(brassicacretica)、曲梗芥(brassicadeflexa)、brassicadesnottesii、brassicadrepanensis、短喙芥(brassicaelongata)、地中海包心菜(brassicafruticulosa)、brassicagravinae、brassicahilarionis、毛野生甘蓝(brassicaincana)、brassicainsularis、芥菜(brassicajuncea)、brassicamacrocarpa、brassicamaurorum?brassicamontana、欧洲油菜、欧洲油菜x芥菜、欧洲油菜x黑芥(brassicanigra)、黑芥、甘蓝(brassicaoleracea)、brassicaoxyrrhina、brassicaprocumbens、芜青、brassicarepanda、brassicarupestris、蔓青(brassicaruvo)、brassicasouliei、芸苔属物种(brassicasp.)、非洲芥菜(brassicatournefortii)或brassicavillosa。。

本发明方法的植物能够表达如本文定义的pdct、尤其pdct19。可以通过任何适宜的手段提供植物。例如,可以通过以下方式提供植物,用包含编码本发明pdct、尤其pdct19的基因的核酸转化植物细胞并且将这类转化的植物细胞培育成经充分发育以测量植物代谢特性的植物。根据本发明,植物也可以按这种已转化植物的后代的形式提供。这种后代可以从亲本植物的材料无性地产生,或可以通过使植物与另一株植物杂交,优选地通过近交来产生。

植物能够表达本发明pdct、尤其pdct19。根据本发明,术语“能够表达基因产物”意指细胞将生产基因产物,条件是细胞生长条件足以产生所述基因产物。例如,能够表达本发明pdct、尤其pdct19的植物是在所述植物的任何发育阶段期间,所述植物的细胞将产生本发明的相应pdct、尤其pdct19。不言而喻,尽管表达取决于人类干预,例如施加诱导物,但将植物同样视为能够表达本发明的pdct、尤其pdct19。

具有这种所需序列同一性和/或序列相似性和功能的pdct也称作本发明的pdct。pdct的作用示于图5中。

关于用来产生不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的代谢途径,参见例如wo2006100241的图4或图1。

本文提及的pdct的示例示于实施例、附图和表中,例如表5或表6中:

根据本发明,植物能够表达本发明的pdct,尤其pdct19,其中本发明的所述pdct,尤其pdct19,与seqidno:36、38和/或44至少具有pdct1950、70、80、85、87、88、90、91、92、92、94、95、96、97、98、99或100%序列同一性。例如,所述方法的pdct与seqidno:36具有至少50、70、80、85、87、88、90、91、92、92、94、95、96、97、98、99或100%序列同一性。此外,例如,所述方法的pdct与seqidno:38具有至少50、70、80、85、87、88、90、91、92、92、94、95、96、97、98、99或100%序列同一性。同样地,例如,所述方法的pdct与seqidno:44具有至少50、70、80、85、87、88、90、91、92、92、94、95、96、97、98、99或100%序列同一性。

本发明方法的植物也可以能够表达如本文定义的其他pdct、尤其pdct1。可以通过任何适宜的手段提供植物。例如,可以通过以下方式提供植物,用包含编码pdct1的基因的核酸转化植物细胞并且将这类转化的植物细胞培育成经充分发育以测量植物代谢特性的植物。

该植物能够表达pdct、尤其pdct1和pdct19。根据本发明,术语“能够表达基因产物”意指细胞将生产基因产物,条件是细胞生长条件足以产生所述基因产物。例如,能够表达pdct19的植物是在所述植物的任何发育阶段期间,所述植物的细胞将产生pdct19。不言而喻,尽管表达取决于人类干预,例如施加诱导物,但将植物同样视为能够表达pdct91,例如pdct1和pdct19。

根据本发明,植物能够表达本发明的pdct,尤其pdct1,其中本发明的所述pdct,尤其pdct1,与seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16或46至少具有pdct150、70、80、85、87、88、90、91、92、92、94、95、96、97、98、99或100%序列同一性。例如,所述方法的pdct与seqidno:2或6具有至少50、70、80、85、87、88、90、91、92、92、94、95、96、97、98、99或100%序列同一性。此外,例如,所述方法的pdct与seqidno:4或8具有至少50、70、80、85、87、88、90、91、92、92、94、95、96、97、98、99或100%序列同一性。同样地,例如,所述方法的pdct与seqidno:46具有至少50、70、80、85、87、88、90、91、92、92、94、95、96、97、98、99或100%序列同一性。

根据本发明,编码pdct19的核酸序列可以与seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16或46具有50、70、80、85、87、88、90、91、92、92、94、95、96、97、98、99或100%序列同一性。

本发明方法的植物也可以能够表达如本文定义的其他pdct、尤其pdct3或pdct5。惊讶地,发现降低、消耗、抑制或消除内源pdct3和/或pdct5的活性导致pufa、尤其epa、dha和/或dpa的产生改进。可以通过任何适当的手段提供其中与对照相比已经降低、消耗、抑制或缺失内源活性和/或表达的植物、植物细胞或植物种子。例如,可以通过以下方式提供植物:用包含对pdct3和/或pdct5表达或活性的抑制物的核酸(例如微rna、反义、核酶、抗体、抑制物、敲除等)转化植物细胞并且将这类转化的植物细胞培育成经充分发育以测量植物代谢特性的植物。根据本发明,植物也可以按这种已转化植物的后代的形式提供。这种后代可以从亲本植物的材料无性地产生,或可以通过使植物与另一株植物杂交,优选地通过近交来产生。

例如,在本发明的方法中,植物不能够表达内源pdct3和/或5或与对照相比,具有减少的pdct3或5表达、并且仍然具有增加的pdct1和/或pdct19活性。例如,不能够pdct3和/或pdct5的植物是在所述植物的任何发育阶段期间,所述植物的细胞将不产生pdct3和/或pdct5。不言而喻的是,如若降低表达或活性取决于人类干预,例如施加阻遏物,例如微rna、反义、核酶、抗体、抑制物、敲除等,采用部分或完全阻抑的pdct3和/或pdct5的内源活性时,植物、植物细胞或种子中可能仍然能够表达pdct1和/或pdct19。

根据本发明,pdct3和/或pdct5可以与seqidno:18、20、22、24、26、28、30、32和/或xx具有50、70、80、85、87、88、90、91、92、92、94、95、96、97、98、99或100%序列同一性。根据本发明,编码pdct3和/或pdct5的核酸序列可以与seqidno:17、19、21、23、25、27、29、31和/或xx具有50、70、80、85、87、88、90、91、92、92、94、95、96、97、98、99或100%序列同一性。

根据本发明,植物也可以按这种已转化植物的后代的形式提供。这种后代可以从亲本植物的材料无性地产生,或可以通过使植物与另一株植物杂交,优选地通过近交来产生。

可以通过从头合成获得编码本发明pdct的基因。始自氨基酸序列seqidno.36、38和/或48之任一者,本领域普通技术人员可以使选择的序列反向翻译成核酸序列并且合成该序列。如本文所述,本领域普通技术人员还可以向选择的氨基酸序列或相应核酸序列引入一个或多个突变,包含插入、置换和缺失。为了反向翻译,本领域普通技术人员可以并且应当使用核酸密码子,从而反映意图表达本发明所述pdct的植物的密码子频率。通过使用根据seqidno.36、38和/或48本身或一个或多个突变的任一个氨基酸序列,本领域技术人员可以使用例行技术和标准设备获得这样的pdct,其具有本文所述的有益特性并且在多个植物物种中显示这些有益特性。

本发明pdct的氨基酸序列可以与根据seqidno.36、38和/或48的序列中任一者相同。但是,在某些实施方案中,优选本发明pdct的氨基酸序列不是根据seqidno.36的序列和/或不是根据seqidno.38的氨基酸序列和/或不是根据seqidno.44的氨基酸序列和/或不是根据seqidno.34的氨基酸序列。如若本领域普通技术人员出于任何原因想要避开根据seqidno.36、38和/或48的任一个或多个氨基酸序列,本领域普通技术人员可以使用这个序列集合的剩余序列中任一者。其不过,本领域普通技术人员还可以通过以下方式构成新的氨基酸和相应核酸序列:从根据seqidno.36、38和/或48的氨基酸序列集合选择基本序列并且在基本序列的适宜位置引入一个或多个突变(插入、置换和/或缺失)以获得衍生的序列。通常,本领域普通技术人员将考虑,基本序列和衍生序列之间的序列同一性和/或相似性越高,相应的衍生pdct将更显得像与本发明pdct基本序列或pdct活性对应的pdct活性。因此,如果本领域普通技术人员使用根据本发明突变的pdct并且这种突变的pdct出乎意料地不传递出本发明pdct(例如,具有本发明pdct活性的pdct)的益处,则本领域普通技术人员应当减少pdct序列的差异值,以增加与根据seqidno.36、38和/或48的序列中任一者的相似性。

为了置换选自序列seqidno.36、38和/或48中任一者的基本序列的氨基酸序列,同时不考虑这些序列的其他者中氨基酸的出现情况,则只要维持本发明的pdct活性,以下适用,其中字母使用其常用缩写表示l氨基酸,并且加括号的数字表示替换的偏好性(更大的数字表示更高的偏好性):a可以由选自s(1)、c(0)、g(0)、t(0)或v(0)的任何氨基酸替换。c可以由a(0)替换。d可以由选自e(2)、n(1)、q(0)或s(0)的任何氨基酸替换。e可以由选自d(2)、q(2)、k(1)、h(0)、n(0)、r(0)或s(0)的任何氨基酸替换。f可以由选自y(3)、w(1)、i(0)、l(0)或m(0)的任何氨基酸替换。g可以由选自a(0)、n(0)或s(0)的任何氨基酸替换。h可以由选自y(2)、n(1)、e(0)、q(0)或r(0)的任何氨基酸替换。i可以由选自v(3)、l(2)、m(1)或f(0)的任何氨基酸替换。k可以由选自r(2)、e(1)、q(1)、n(0)或s(0)的任何氨基酸替换。l可以由选自i(2)、m(2)、v(1)或f(0)的任何氨基酸替换。m可以由选自l(2)、i(1)、v(1)、f(0)或q(0)的任何氨基酸替换。n可以由选自d(1)、h(1)、s(1)、e(0)、g(0)、k(0)、q(0)、r(0)或t(0)的任何氨基酸替换。q可以由选自e(2)、k(1)、r(1)、d(0)、h(0)、m(0)、n(0)或s(0)的任何氨基酸替换。r可以由选自k(2)、q(1)、e(0)、h(0)或n(0)的任何氨基酸替换。s可以由选自a(1)、n(1)、t(1)、d(0)、e(0)、g(0)、k(0)或q(0)的任何氨基酸替换。t可以由选自s(1)、a(0)、n(0)或v(0)的任何氨基酸替换。v可以由选自i(3)、l(1)、m(1)、a(0)或t(0)的任何氨基酸替换。w可以由选自y(2)或f(1)的任何氨基酸替换。y可以由选自f(3)、h(2)或w(2)的任何氨基酸替换。

酶变体可以由它们与亲本酶相比时的序列同一性定义。序列同一性通常作为“序列同一性%”或“同一性%”提供。为了确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数,在第一步骤中,在这两个序列之间生成配对序列比对结果,其中将两个序列在其整个长度范围内比对(即,配对的全局比对)。用实施needlem和wunsch算法(j.mol.biol.(1979)48,第443-453页)的程序,优选地通过使用程序“needle”(欧洲分子生物学开放软件套件(europeanmolecularbiologyopensoftwaresuite)(emboss)),采用程序默认参数(空位开口=10.0、空位延伸=0.5和矩阵=eblosum62),生成比对结果。用于本发明的优选比对是从中可以确定最高序列同一性的比对。

以下实例意在说明两个核苷酸序列,但是相同计算适用于蛋白质序列:

seqa:aagatactg长度:9个碱基

seqb:gatctga长度:7个碱基

因此,较短序列是seqb。

产生在其整个长度范围内显示两个序列的两两全局比对产生了

比对结果中的“i”符号表示相同的残基(其意指dna的碱基或蛋白质的氨基酸)。相同残基的数目是6。

比对结果中的“-”符号指示空位。seqb内部因比对引入的空位数是1。通过比对引入的空位的编号在seqb的边界处是2,并且在seqa的边界处为1。

在其整个长度范围内显示比对序列的比对长度是10。

根据本发明产生在其整个长度范围内显示较短序列的两两比对因此产生:

根据本发明产生在其整个长度范围内显示序列a的两两比对因此产生:

根据本发明产生在其整个长度范围内显示序列b的两两比对因此产生:

在其整个长度范围内显示较短序列的比对长度是8(存在一个在较短序列的比对长度中考虑的缺口)。

因此,在其整个长度范围内显示seqa的比对长度将是9(意指seqa是本发明的序列)。

因此,在其整个长度范围内显示seqb的比对长度将是8(意指seqb是本发明的序列)。

在比对两个序列后,在第二步骤中,从产生的比对结果测定同一性值。为了本说明书的目的,通过以下方式计算同一性百分数:同一性%=(相同残基/在其整个长度范围内显示两个对齐序列的比对区域的长度)*100。因此根据这个实施方案,通过相同残基的数目除以在其整个长度范围内显示两个对齐序列的比对区域的长度,计算与比较两个氨基酸序列有关的序列同一性。这个值乘以100以得出“同一性%”。根据上文提供的示例,同一性%是:(6/10)*100=60%。

另外,实施needlem和wunsch算法(j.mol.biol.(1979)48,第443-453页)的优选程序是采用程序默认参数(空位开口=10.0、空位延伸=0.5和矩阵=ednafull)的“needle”(欧洲分子生物学开放软件套件(europeanmolecularbiologyopensoftwaresuite)(emboss))。

在表6中,显示在本发明方法中所用的pdct和其他pdct之间如本文所述计算的同一性。

本发明的pdct优选地与序列seqidno.36、38和/或48中任一者具有至少50%氨基酸序列同一性。最优选地,本发明的pdct与序列seqidno.36具有至少50%氨基酸序列同一性。这种pdct可以显示在众多植物物种中有功能、易于获得并且传递本发明pdct的益处。优选地,本发明的pdct与序列seqidno.36、38和/或48中任一者具有至少55%氨基酸序列同一性,其中与seqidno.36的同一性特别优选地、甚至更优选地至少65%、甚至更优选地至少72%、甚至更优选地至少78%、甚至更优选地至少80%、甚至更优选地至少82%、甚至更优选地至少89%、甚至更优选地至少91%、甚至更优选地至少96%。本发明的pdct优选地与序列seqidno.38中任一者具有至少50%氨基酸序列同一性。优选地,本发明的pdct与序列seqidno.44具有至少50%氨基酸序列同一性。这种pdct可以显示在众多植物物种中有功能、易于获得并且传递本发明pdct的益处。优选地,本发明的pdct与序列seqidno.36、38和/或48中任一者具有至少60%氨基酸序列同一性,其中与seqidno.36的同一性特别优选地、甚至更优选地至少73%、甚至更优选地至少75%、甚至更优选地至少89%、甚至更优选地至少95%、甚至更优选地至少96%、甚至更优选地至少97%、甚至更优选地至少98%、甚至更优选地至少99%。优选地,本发明的pdct具有必备或优选的最小同一性和必备或优选的最小相似性。在本发明pdct的氨基酸序列和根据seqidno.36、38和/或48的氨基酸序列之间的相似性和同一性越高,本发明的pdct将越可靠地在如本文所述的植物细胞、植物或种子中显示出pdct活性和传递出本发明的益处。优选地,本发明的pdct不是pdct3或pdct5,具有seqidno.18、20、22、24、26、28、30、32、50、52、54、56、58和/或60序列的任一者。

优选地,本发明pdct的氨基酸序列与根据seqidno.36、38和/或48中任一者的氨基酸酸序列仅在这样的一个或多个位置处不同,其中根据图1,氨基酸序列seqidno.36或38(cl1和cl19)中至少一者与序列seqidno.36或38的至少另一者不同,优选地不允许任何氨基酸插入或缺失。图1显示本发明pdct的两个氨基酸序列的比对结果。优选地,本发明pdct的氨基酸序列可以认为是从序列seqidno.36或38的一个已选择基本序列中选择的氨基酸交换成序列seqidno.36或38的任一其他序列的相应位置处相应氨基酸的结果。另外,优选地,任何突变应当增加本发明pdct的氨基酸序列与根据seqidno.36或38的序列的相似性或甚至更优选地同一性,并且减少与根据seqidno.34的氨基酸序列的相似性或甚至更优选地同一性。

出于上文所示的原因,本发明的pdct优选地由氨基酸序列seqidno.36组成。不太优选地,本发明pdct的氨基酸序列与seqidno.36的氨基酸酸序列仅在其中序列seqidno.38与seqidno.36的氨基酸序列的这类位置不同。更优选地,本发明的pdct并不因插入或缺失不同于seqidno.36的氨基酸序列并且因此仅包含一个或多个置换。甚至更优选地,本发明的pdct由这样的氨基酸序列组成,所述氨基酸序列仅因氨基酸序列seqidno.36的相应位置处存在的氨基酸不同于seqidno.38。

本发明的植物进一步能够表达至少一种或多种不饱和脂肪酸代谢酶。优选地,这类酶能够使用ω-6系列和/或更优选地ω-3系列的不饱和脂肪酸作为底物。优选的酶活性是:去饱和酶、延伸酶、acs、酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶(agpat)、胆碱磷酸转移酶(cpt)、二酰甘油酰基转移酶(dgat)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(gpat)、溶血磷脂酸酰基转移酶(lpat)、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(lpcat)、溶血磷脂酰乙醇胺酰基转移酶(lpeat)、溶血磷脂酰基转移酶(lplat)、磷脂酸磷酸酶(pap)、磷脂:二酰甘油酰基转移酶(pdat)、磷脂酰胆碱:二酰甘油胆碱磷酸转移酶(pdct)、特别地δ-12去饱和酶、δ-8去饱和酶、δ-6去饱和酶、δ-5去饱和酶、δ-4去饱和酶、δ-9延伸酶、δ-6延伸酶、δ-5延伸酶、ω-3去饱和酶。

至少一种酶能够使用亚油酸作为底物。技术人员称这类酶为ω-3去饱和酶、δ-15去饱和酶、δ-9去饱和酶和δ-6去饱和酶。可能的是,一种或多种不饱和脂肪酸代谢酶可以具有多于一种活性。例如,ω-3去饱和酶常见还是δ-15去饱和酶和/或δ-17去饱和酶和/或δ-19去饱和酶。其他优选的不饱和脂肪酸代谢的酶是我们的δ-12去饱和酶、ω-3去饱和酶、δ-6去饱和酶、δ-6延伸酶、δ-5去饱和酶、δ-5延伸酶和δ-4去饱和酶。认为这些酶中至少之一与植物代谢特性有关。优选地,代谢特性是相应酶的产物的存在和/或浓度。因此,植物代谢特性优选地是gla、sda、eda、etra、gla、edta、ara、epa、dta、dpa和dha中任一者的存在和/或其浓度,其中特别地优选ara、epa和dha的浓度。

在本发明的方法中,植物能够在培育植物期间表达本发明的pdct和至少一种更多种不饱和脂肪酸代谢途径酶。本发明的“培育”意指养育植物材料,植物优选地可以如此使用胚胎或种子,从而所述植物材料的细胞可以发育并且优选地繁殖,从而可以预计发育的植物材料的至少一个细胞显示出植物代谢特性。例如,当表达编码不饱和脂肪酸代谢酶(例如去饱和酶或延长酶)的基因处于组织特异性启动子控制下,则如此培育植物材料,从而相应的组织发育。

随后通过任何合适的手段测量植物代谢特性。例如,可以从植物材料、优选地植物种子的提取物和最优选地从种子油测量处于游离脂肪酸形式或单酰甘油、二酰甘油或三酰甘油形式的脂肪酸的浓度。

本发明的方法优选地不对一株植物而对植物群组进行。以这种方式,测量的植物代谢特性将比仅对单株植物的植物材料(例如单粒种子)取得的量值在统计上更有意义。即使本发明的分析方法优选地对植物群组进行,对单株植物进行的本发明分析方法也是有用和有益的。这类方法允许快速筛选植物并且因此特别地适于高通量评价编码不饱和脂肪酸代谢酶的基因和基因组合。

根据本发明的方法,可以通过在植物、植物细胞或种子中从头表达pdct或通过增加内源pdct表达或活性,增加其活性在本发明方法中增加的pdct的活性。

编码本发明pdct的基因优选地与表达控制序列有效连接以允许所述基因组成型或非组成型表达。技术人员已知本发明的表达控制序列为启动子、转录因子结合位点和调节性核酸,如例如rnai。优选地,表达控制序列指导基因以组织特异性方式表达。在植物是油料种子植物、优选地芸苔属物种(brassicasp.)的情况下,基因的表达优选地对处于其一个或多个发育阶段的植物种子为特异性。根据本发明,组织特异性表达不需要其他组织中完全不存在基因表达。但是,针对选定组织的组织特异性表达意指mrna转录物在这种组织中的最大数量是所述mrna在其他组织中最大数量的至少2倍、优选地至少5倍、甚至更优选地至少10倍、甚至更优选地至少20倍、甚至更优选地至少50倍和最优选地至少100倍。另外,技术人员已知允许通过使用者应用的信号(例如,应用的诱导物(如iptg)),诱导或阻抑表达的表达控制序列。

本发明的pdct或在本发明方法中所用的pdct可以在本发明方法中所用的细胞、植物或种子中作为单拷贝基因或以多个基因拷贝存在。

本发明的或在本发明方法中所用的pdct优选地在还表达其他至少一种或更多种不饱和脂肪酸代谢酶的相同植物细胞中表达。可能但并非必要的是,本发明的或在本发明方法中所用的pdct在与一种、一些或全部所述其他不饱和脂肪酸代谢基因相同的时间表达。

如若植物、植物细胞或种子能够表达c18、c20和c22pufa,则植物、植物细胞或种子中的本发明pdct表达、尤其pdct19从头表达,或若已经存在于野生型中或对照中,通过增加本发明pdct的内源活性,产生低于c18、c20和c22pufa水平的ala和la水平。

通常,ala加la水平可以高于c18、c20和c22pufa水平。

在植物、植物细胞或种子表达δ-6去饱和酶的情况下,本发明pdct(例如pdct19)的活性增加,其中pdct优选地可以选自:

(a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct19的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct19活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:35、37和/或47;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct19的片段,其具有pdct19活性。

导致δ-6去饱和酶转化效率增加。可以因从头表达而增加pdct的活性,所述从头表达归因于用包含核酸分子的表达构建体稳定转化,所述核酸分子编码pdct19并提供其表达,或若本发明pdct已经存在于野生型中或对照中,通过增加其内源活性而增加pdct的活性。

难以评估来自t-dna中存在的每个去饱和酶基因和延伸酶基因对vlc-pufa数量的贡献,但是可以算得每个途径步骤的转化效率,例如通过使用图7中所示的公式算得。这些计算基于所讨论组织或油的脂肪酸组成并且显示从特定酶的底物形成的产物脂肪酸(和下游产物)的量。转化效率有时称作“表观”转化效率,因为对于这些计算中的某些,认可计算不考虑可能影响反应的全部因素。然而,转化效率值可以用来评估每个去饱和酶反应或延伸酶反应对vlc-pufa总体生产的贡献。通过比较转化效率,可以在不同的各种子、植物、整装种子批、事件、芸苔属种质或转基因构建体之间比较给定酶促步骤的相对有效性。

pdct活性可以如实施例中所述那样计量,例如通过如实施例中所述那样在植物中表达pdct来计量。

优选地,在油料作物种子中、例如在亚麻荠中,例如通过用本发明的pdct、例如用优选地选自以下的pdct稳定转化亚麻荠,从头表达本发明的pdct:

(a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct19的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct19活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:35、37和/或47;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct19的片段,其具有pdct19活性。

所得到的油优选地富含epa、dpa和/或dha。本发明的方法还可能产生“ala加la”水平可以高于c18、c20和c22pufa水平的油。

此外,本发明涉及一种产生植物、其部分、植物细胞、植物种子/或包含油的植物种子的方法,其中二酰甘油(dag)级分中以%(w/w)计的18:2脂肪酸水平介于三酰甘油(tag)级分中以%(w/w)计的18:2脂肪酸水平的75%和130%之间,提供能够产生gla并且与野生型相比,具有一种或多种pdct的增加活性或表达的植物,所述pdct选自:

(a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct19的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct19活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:35、37和/或47;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct19的片段,其具有pdct19活性。

任选地,分离种子油。

此外,本发明涉及一种在植物或其部分,如植物细胞,和/或部分种子、或其部分中产生包含脂肪酸20:0的组合物例如油的方法,

其中三酰甘油级分中以%(w/w)计的20:0水平低于二酰甘油级分中以%(w/w)计的20:0水平,包括,

提供能够产生20:0脂肪酸并且与野生型相比具有一种或多种pdct的增加活性或表达的植物,所述pdct选自:

(a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct19的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct19活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:35、37和/或47;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct19的片段,其具有pdct19活性。

此外,本发明涉及一种在植物或其部分,如植物细胞,和/或部分种子、或其部分中产生包含dgla的组合物例如油的方法,

其中三酰甘油级分中以%(w/w)计的dgla水平约等于或低于二酰甘油级分中以%(w/w)计的dgla水平,包括,

提供能够产生dgla并且与野生型相比具有一种或多种pdct的增加活性或表达的植物,所述pdct选自:

(a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct19的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct19活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:35、37和/或47;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct19的片段,其具有pdct19活性。

此外,本发明涉及一种在植物或其部分,如植物细胞,和/或部分种子、或其部分中产生包含脂肪酸22:1的组合物例如油的方法,

其中三酰甘油级分中以%(w/w)计的22:1水平低于二酰甘油级分中以%(w/w)计的22:1水平,包括,

提供能够产生20:0脂肪酸并且与野生型相比具有一种或多种pdct的增加活性或表达的植物,所述pdct选自:

(a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct19的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct19活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:35、37和/或47;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct19的片段,其具有pdct19活性。

因此,本发明也涉及一种产生包含油的植物或其部分、植物细胞和/或植物种子的方法:

i.其中二酰甘油(dag)级分中以%(w/w)计的18:2脂肪酸水平介于三酰甘油(tag)级分中以%(w/w)计的18:2脂肪酸水平的75%和130%之间

ii.其中三酰甘油组合物中以%(w/w)计的20:0水平低于二酰甘油级分中以%(w/w)计的20:0水平,

iii.其中三酰甘油组合物中以%(w/w)计的dgla水平约等于或低于二酰甘油级分中以%(w/w)计的dgla水平,

iv.其中三酰甘油级分中以%(w/w)计的22:1水平低于二酰甘油级分中以%(w/w)计的22:1水平,

v.其中ala和la水平低于c18、c20和c22pufa的水平,

vii.其中ala和la水平低于sda、eta、gla、hgla、epa、dha和dpa水平,

viii.其中ala和la水平低于c18脂肪酸和包含vlcpufa的脂肪酸的水平,和/或

ix.其中ala和la水平低于sda、eta、gla、hgla、epa、dha和dpa水平

并且任选地,包括从植物或其部分、植物细胞和/或植物种子分离油的进一步的步骤。

因此,本发明还涉及油,例如原料油、种子油、和/或从压榨本文所述种子产生的油,所述油包含

i.其中二酰甘油(dag)级分中以%(w/w)计的18:2脂肪酸水平介于三酰甘油(tag)级分中以%(w/w)计的18:2脂肪酸水平的75%和130%之间

ii.其中三酰甘油组合物中以%(w/w)计的20:0水平低于二酰甘油级分中以%(w/w)计的20:0水平,

iii.其中三酰甘油组合物中以%(w/w)计的dgla水平约等于或低于二酰甘油级分中以%(w/w)计的dgla水平,

iv.其中三酰甘油级分中以%(w/w)计的22:1水平低于二酰甘油级分中以%(w/w)计的22:1水平,

v.其中ala和la水平低于c18、c20和c22pufa的水平,

vii.其中ala和la水平低于sda、eta、gla、hgla、epa、dha和dpa水平,

viii.其中ala和la水平低于c18脂肪酸和包含vlcpufa的脂肪酸的水平,和/或

ix.其中ala和la水平低于sda、eta、gla、hgla、epa、dha和dpa水平

发现本发明pdct的表达影响脂肪酸在不同脂质池之间的运输。例如通过在种子中过量表达基因,例如在植物经本文所述的核苷酸序列或构建体转化后,增加本发明多核苷酸的活性,则与对照如仅表达天然存在的pdct的植物相比,在tag池和dag池中脂肪酸之间的比率改变。例如,从例如表达δ-6-去饱和酶和δ-6-延伸酶的不成熟种子分离脂肪酸组合物。

如果过量表达或增加本文所述的pdct19或序列,则18:2脂肪酸的水平在dag级分中较tag级分中更低,而在对照中,18:2水平在tag级分中较dag级分更小。二酰甘油级分中的18:2脂肪酸水平多于作为三酰甘油级分中18:2脂肪酸级分的脂肪酸水平的60%和少于其130%或80%、90%或更大,例如,多于70%、80%、85%、90%、95%和少于120%、110%、100%、90%,例如介于70%和95%之间。发现在对照中,三酰甘油组合物中的18:2脂肪酸水平低于二酰甘油级分中,例如,在tag级分中是二酰甘油级分中水平的约70%。可以如实施例中所述那样测定不同汇集物池中脂肪酸的比率。

如果过量表达或增加本文所述的pdct19或序列,则20:0脂肪酸的水平在tag级分中较dag级分中更低,而在对照中,20:0水平在tag级分中较dag级分中更高。二酰甘油级分中的20:0水平多于三酰甘油级分中20:0脂肪酸级分的脂肪酸比例的150%,例如200%、250%、300%;或350%或更大,例如,介于150%和300%之间并且少于500%、450%、或400%。发现在对照中,二酰甘油级分中的20:0脂肪酸水平低于三酰甘油级分中的20:0脂肪酸水平。可以如实施例中所述那样测定不同汇集物池中脂肪酸的比率。

如果过量表达或增加本文所述的pdct19或序列,则dgla脂肪酸的水平在dag级分中较tag级分中更高,而在对照中,dgla水平在tag级分中较dag级分中更高。二酰甘油级分中的dgla水平处在与tag级分中水平大致相同的水平或更高,例如,它多于三酰甘油级分中dgla水平的80%、90%、100%、110%或120%和少于150%或140%,例如介于90%和120%之间。发现在对照中,二酰甘油级分中的dgla水平远低于三酰甘油级分中的dgla水平。可以如实施例中所述那样测定不同汇集物池中脂肪酸的比率。

此外,如果与对照相比,如本文所述的pdct如所述那样过量表达,则以%(w/w)计的dgla/总脂肪酸比率更高,例如,如实施例1或2中所测量。

如果过量表达或增加本文所述的pdct19或序列,则22:1脂肪酸的水平在tag级分中较dag级分中更低,而在对照中,22:1水平在tag级分中大致与dag级分中相同。二酰甘油级分中的22:1脂肪酸水平高于三酰甘油级分中,例如,它较三酰甘油中的22:1水平高120%、150%、200%、300%400%或500%或更大并且较其小1000%、800%、700%、600%或更小,例如介于200%和400%之间。发现在对照中,三酰甘油级分中的22:1脂肪酸水平大致与二酰甘油级分中相同,例如,在tag级分中是二酰甘油级分中水平的约100%。可以如实施例中所述那样测定不同汇集物池中脂肪酸的比率。

例如,在本发明方法中所用的植物还表达如本文所述的δ-6-延伸酶和/或如本文所述的δ-6-延伸酶。此外,植物其部分可以具有如本文所述的增加的总pufa含量。在一个实施方案中,植物或植物部分,例如种子,包含dpa、dha和/或epa含量如本文所述那样增加的油或脂肪酸组合物。

根据本发明,δ-6去饱和酶优选地是酰基coa依赖性的。

在一个实施方案中,在本发明的方法中,植物、植物细胞和/或种子例如表达零种、一种或多种酰基coa依赖性去饱和酶,例如酰基coa依赖性δ-4去饱和酶、δ-5去饱和酶、δ-6去饱和酶、δ-12去饱和酶和/或ω-3去饱和酶,例如,如本文所述的酰基coa依赖性δ-6去饱和酶。

此外,在本发明的方法中,植物、植物细胞和/或种子例如表达零种、一种或多种磷脂依赖性去饱和酶。

优选地,在本发明方法中所用的零种、一种去饱和酶、尤其一种选自δ-4去饱和酶、δ-5去饱和酶、δ-6去饱和酶、ω.3去饱和酶、δ5/δ6-去饱和酶、δ-8去饱和酶或δ-9去饱和酶、δ-8/9去饱和酶、δ-12去饱和酶所组成的组中的去饱和酶使用磷脂作为底物。

优选地,至少一种来自该组的去饱和酶使用酰基-coa作为底物。

根据本发明,例如,自以上群组的零种或一种或多种去饱和酶使用酰基-coa作为底物。因此,例如,至少一种去饱和酶使用磷脂作为底物并且一种去饱和酶使用酰基-coa作为底物。优选地,去饱和酶选自δ-4去饱和酶、δ-5去饱和酶、δ-6去饱和酶、ω.3去饱和酶或δ-12去饱和酶。因此,例如,在本发明的方法中使用以磷脂作为底物的δ-6去饱和酶。

因此,在本发明的方法中,植物、植物细胞和/或种子例如还表达δ-4去饱和酶、δ-5去饱和酶、δ-6去饱和酶、δ-12去饱和酶和/或ω-3去饱和酶,其中零种、一种或多种去饱和酶使用酰基coa活化的脂肪酸作为底物,和/或其中零种、一种或多种去饱和酶使用磷脂活化的脂肪酸作为底物。因此,在本发明的方法中,例如,植物、植物细胞和/或种子例如表达一种或多种使用酰基coa活化的脂肪酸作为底物的δ-4去饱和酶、δ-5去饱和酶、δ-6去饱和酶、δ-12去饱和酶和/或ω-3去饱和酶以及一种或多种使用磷脂活化的脂肪酸作为底物的δ-4去饱和酶、δ-5去饱和酶、δ-6去饱和酶、δ-12去饱和酶和/或ω-3去饱和酶。

因此,例如,至少一种去饱和酶使用磷脂作为底物并且一种去饱和酶使用酰基-coa作为底物。优选地,去饱和酶选自δ-4去饱和酶、δ-5去饱和酶、δ-6去饱和酶、ω.3去饱和酶、或δ-12去饱和酶。因此,例如,在本发明的方法中,δ-6去饱和酶使用磷脂作为底物。

本发明也提供一种在植物或其部分中或在植物或其部分的发育阶段期间、优选地在种子发育期间增加本发明的pdct(例如pdct19)活性和/或稳定本发明pdct(例如pdct19)活性的方法,所述方法方法包括培育表达本发明pdct的植物。

因此,本发明还提供一种在植物中产生一种或多种所需不饱和脂肪酸的方法,包括培育植物,所述植物表达、至少暂时表达,本发明的pdct和一种或多种进一步基因,以使亚油酸转化成所述的一种或多种所需不饱和脂肪酸。如上文所示,一种或多种编码用来产生不饱和脂肪酸的酶的其他基因优选地包含去饱和酶和延伸酶。

本发明也提供包含基因的核酸,所述基因编码本发明的pdct,其中该基因不编码确切序列seqidno.36、38和/或48中任一者的pdct。因此,本发明提供包含基因的核酸,所述基因编码pdct,其中所述pdct与序列seqidno.36、38和/或48中任一者具有至少50%总氨基酸序列同一性和/或与序列seqidno.36、38和/或48中任一者具有至少60%总氨基酸序列相似性,并且其中序列不是序列seqidno.18、20、22、24、26、28、30、32、50、52、54、56、58和/或60中任一者。优选地,本发明的或在本发明方法中(过量)表达的核酸分子不编码pdct3或pdct5。

本发明也提供包含基因的核酸,所述基因编码本发明的pdct,其中基因与表达控制序列有效连接,并且其中如果基因编码根据seqidno.36、38和/或48的确切序列中任一者,表达控制序列对所述基因为异源。因此,本发明特别地提供自然界中不存在的启动子和基因组合。

本发明的核酸优选地是可用于转化植物细胞并引起本发明pdct基因至少暂时表达、优选地在植物或植物细胞或种子发育期间稳定的表达载体、转化构建体或表达构建体。因此,本发明的核酸促进实现如本文所述的本发明传送的益处。另外,本发明提供由本发明核酸中任一者编码的纯化的pdct多肽以及特异性结合本发明pdct多肽的抗体,例如单克隆抗体或其片段,只要这些片段特异性结合本发明的pdct即可。

根据本发明,还提供一种植物细胞,其包含编码本发明pdct的非天然基因。可以如上文所述那样通过以下方式获得这类植物细胞:转化野生型植物细胞或其后代,例如使包含编码本发明pdct的基因的植物与不包含这类基因的植物杂交并且选择包含所述基因的后代、优选地种子。以这种方式,可能轻易地将编码本发明pdct的基因从一个种质转移至另一个种质。本发明的植物细胞优选地包含编码本发明pdct之一的基因以实现由这类优选的pdct传送的益处。还如上文所述,编码本发明pdct的基因优选地与表达控制序列有效连接,并且特别优选所述表达控制序列指导相对于植物发育的某些组织和某些时间的表达,例如相对于发育着的种子组织和上文所示的开花后优选时间。

优选地,包含本发明多核苷酸(例如pdct19)的植物细胞、植物或种子是亚麻荠属(camelina)物种或芸苔属(brassica)物种、优选地欧洲油菜、芥菜、埃塞俄比亚芥或亚麻荠。

由于本发明提供也可以用于筛选和比较目的的分析方法,本发明还提供包括至少2个植物群组的植物集合,每个群组由一株或多株植物组成,其中每个群组的一株植物或多株植物能够表达本发明的pdct,并且其中所述群组的一株植物或多株植物包含一个或多个编码至少一种或更多种不饱和脂肪酸代谢酶的基因,所述酶中至少一者能够使用亚油酸作为底物,并且所述酶中至少一者假定与植物代谢特性有关,并且其中所述群组的一株植物或多株植物在不饱和脂肪酸代谢酶中至少一者的表达方面有差异。为了在不饱和脂肪酸代谢酶中至少一者的表达方面有差异,在一个群组的一株植物或多株植物中存在的一个基因可以在另一个群组的一株植物或多株植物中丢失,或可以在不同的时间或在不同组织中或以不同的强度表达。例如,2个群组的植物均可以包含在相同表达控制序列控制下编码δ-4去饱和酶的基因,但是δ-4去饱和酶核酸序列衍生自不同的生物,从而相应δ-4去饱和酶的氨基酸序列对每个群组的植物是独特的。替代地或除了δ-4去饱和酶基因有差异,这些群组还可以在编码不饱和脂肪酸代谢酶的任何其他核酸序列方面有差异,所述的酶包括但不限于ω-3去饱和酶、δ-6去饱和酶、δ-9延伸酶、δ-6延伸酶、δ-8去饱和酶、δ-5去饱和酶和δ-5延伸酶。

用于克隆、dna分离、扩增和纯化的标准技术、涉及dna连接酶、dna聚合酶、限制性核酸内切酶等的酶促反应和各种分离技术是本领域技术人员已知并且常用的那些技术。下述文献中描述了多种标准技术:m.green和j.sambrook(2012)molecularcloning:alaboratorymanual,第4版,coldspringharborlaboratorypress,csh,newyork;ausubel等人,currentprotocolsinmolecularbiology,wileyonlinelibrary;maniatis等人,1982molecularcloning,coldspringharborlaboratory,plainview,n.y.;wu(编著)1993meth.enzymol.218,第i部分;wu(编著)1979methenzymol.68;wu等人,(编著)1983meth.enzymol.100及101;grossman和moldave(编著)1980meth.enzymol.65;miller(编著)1972experimentsinmoleculargenetics,coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,n.y.;old和primrose,1981principlesofgenemanipulation,universityofcaliforniapress,berkeley;schleif和wensink,1982practicalmethodsinmolecularbiology;glover(编著)1985dnacloning第i和ii卷,irlpress,oxford,uk;hames和higgins(编著)1985nucleicacidhybridization,irlpress,oxford,uk;以及setlow和hollaender1979geneticengineering:principlesandmethods,第1-4卷,plenumpress,newyork。

如本文所用的术语“培育”指在允许细胞产生所述多不饱和脂肪酸(即上文所提及的pufa和/或vlc-pufa)的培养条件下维持和生长转基因植物。这暗含在转基因植物中表达本发明的多核苷酸,从而去饱和酶、延伸酶还如酮酰基-coa-合酶、酮酰基-coa-还原酶、脱水酶和烯酰-coa-还原酶活性存在。在下文更详细地描述用于培育宿主细胞的合适培养条件。

如本文所用的术语“获得”包括提供细胞培养物(包括宿主细胞和培养基)或本发明的植物或植物部分、尤其种子,以及提供其纯化或部分纯化的制备物,所述制备物以游离形式或以coa结合形式包含作为膜磷脂或作为三酰甘油酯的多不饱和脂肪酸,优选地,ara、epa、dha。更优选地,pufa和vlc-pufa将作为甘油三酯形式(例如以油形式)获得。可以在本文其他地方找到关于纯化技术的更多细节。

根据本发明,术语“多核苷酸”指脱氧核糖核酸和/或核糖核酸。除非另外声明,否则本文中“多核苷酸”指单链dna多核苷酸或指双链dna多核苷酸。根据本发明,多核苷酸的长度通过规定碱基对(“bp”)或核苷酸(“nt”)的数目指定。根据本发明,两种规定可互换地使用,无论相应的核酸是否为单链或双链核酸。另外,由于多核苷酸依据其相应的核苷酸序列确定,术语“核苷酸/多核苷酸”和“核苷酸序列/多核苷酸序列”互换使用,因此对核酸序列的提及还意在确定包含其序列与核酸序列相同的核酸片段或由该核酸片段组成的核酸。

尤其,如根据本发明使用的术语“多核苷酸”,只要它涉及去饱和酶或延伸酶基因,则涉及包含下述核酸序列的多核苷酸,所述核酸序列编码具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽。优选地,由本发明多核苷酸编码的一旦在植物中表达就具有去饱和酶、或延伸酶活性的多肽应当能够在例如种子油或完整植物或其部分中增加pufa的量和尤其vlc-pufa的量。可以通过本领域熟知的统计检验(包括例如置信水平为至少90%、优选地至少95%和甚至更优选地至少98%的studentt-检验),确定某种增加是否具有统计显著性。更优选地,增加是与野生型对照(优选地以重量计)相比,尤其与来自野生型对照的种子、种子油、提取的种子油、粗制油、或精制油相比,含有vlc-pufa的甘油三酯的量增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%或至少30%。优选地,前文所指的vlc-pufa是具有c20、c22或c24脂肪酸主体的多不饱和脂肪酸,更优选地是epa或dha。在后续实施例中显示油样品的脂质分析。

在本发明的植物中、尤其在从本发明植物获得或可获得的油中,如与从对照植物获得或可获得的油相比,某些脂肪酸的含量应当减少或尤其增加。特别地,如与来自对照植物的种子、种子油、粗制油或精制油相比,含量减少或增加。选择合适的对照植物是实验设计的例行部分,并且可以包括相应的野生型植物或无编码如本文提到的去饱和酶和延伸酶的多核苷酸的相应植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子(或失效对照植物)是因分离而丢失转基因的个体。此外,将对照植物在与本发明植物的培育条件相同或基本上相同的培育条件下培育,即在本发明植物附近并与之同时培育。如本文中所用的“对照植物”优选地不仅指完整植物,也指植物部分,包括种子和种子部分。对照还可能是来自对照植物的油。

优选地,对照植物是同基因的对照植物。因此,例如,对照油或种子应当来自同基因的对照植物。

具有多不饱和c20-和/或c22-脂肪酸分子的脂肪酸酯可以从用于制备脂肪酸酯的生物,按油或脂质的形式分离,例如按包含具有至少两、三、四、五或六个双键、优选地五或六个双键的多不饱和脂肪酸的化合物如鞘脂、磷酸甘油酯、脂质、糖脂如糖鞘脂、磷脂如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油、单酰甘油酯、二酰甘油酯、三酰甘油酯或其他脂肪酸酯如乙酰辅酶a酯的形式分离。优选地,它们按其二酰甘油酯、三酰甘油酯的形式和/或按磷脂酰胆碱的形式、特别优选地按三酰甘油酯的形式分离。除这些酯之外,多不饱和脂肪酸还在非人类转基因生物或宿主细胞、优选地在植物中作为游离脂肪酸存在或结合在其他化合物中。通常,各种上述化合物(脂肪酸酯和游离脂肪酸)在生物中按以下的近似分布存在:按重量计80%至90%的甘油三酯、按重量计2%至5%的甘油二酯、按重量计5%至10%的甘油单酯、按重量计1%至5%的游离脂肪酸、按重量计2%至8%的磷脂,按重量计各种化合物总计占100%。在本发明的方法中,基于上文所提及的非人类转基因生物或宿主细胞中的总脂肪酸,已经产生的vlc-pufa按下述含量产生:对于dha,至少按重量计5.5%、至少按重量计6%、至少按重量计7%、有利地按重量计至少8%、优选地按重量计至少9%、特别优选地按重量计至少10.5%、非常特别优选地按重量计至少20%;对于epa,至少按重量计9.5%、按重量计至少10%、至少按重量计11%、有利地按重量计至少12%、优选地按重量计至少13%、特别优选地按重量计至少14.5%、非常特别优选地按重量计至少30%。脂肪酸优选地以结合形式产生。借助本发明的多核苷酸和多肽,这些不饱和脂肪酸有可能定位于优选产生的甘油三酯的sn1、sn2和/或sn3位置处。

在本发明的方法或生产方法中,本发明的多核苷酸和多肽可以与至少一种其他编码脂肪酸或脂质生物合成的酶的多核苷酸一起使用。在这种情况下,优选的酶是如上文提到的去饱和酶和延伸酶,还是编码具有δ-8-去饱和酶和/或δ-9-延伸酶活性的酶的多核苷酸。全部这些酶反映了据此从起始化合物亚油酸(c18:2)或亚麻酸(c18:3)产生本发明方法的终产物(例如epa或dha)的各个步骤。通常,这些化合物不作为基本上纯的产物生成。相反,微小痕量的前体还可能存在于终产物中。例如,如果亚油酸和亚麻酸均存在于起始宿主细胞、生物或起始植物中,则终产物如epa或dha作为混合物存在。基于所讨论终末产物的量,前体应当有利地占到以重量计不多于20%、优选地以重量计不多于15%、更优选地以重量计不多于10%、最优选地以重量计不多于5%。有利地,在宿主细胞中,仅epa或更优选地仅dha(结合型或作为游离酸)作为本发明方法中的终产物产生。如果化合物epa和dha同时产生,则它们优选地按至少1:2(dha:epa)的比率产生,更优选地,该比率是至少1:5并且最优选地是1:8。通过本发明产生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物优选地包含6%至15%的棕榈酸、1%至6%的硬脂酸、7-85%的油酸、0.5%至8%的异油酸、0.1%至1%的花生酸、7%至25%的饱和脂肪酸、8%至85%的单不饱和脂肪酸以及60%至85%的多不饱和脂肪酸,在每种情况下均以100%为基础及以生物的总脂肪酸含量为基础。作为优选的长链多不饱和脂肪酸,dha基于总脂肪酸含量以优选地至少0.1%;0.2%;0.3%;0.4%;0.5%;0.6%;0.7%;0.8%;0.9或1%的浓度存在于脂肪酸酯或脂肪酸混合物中。

也可以通过本文所述的方法合成化学纯的vlc-pufa或脂肪酸组合物。为此目的,通过提取、蒸馏、结晶、色谱或这些方法的组合从相应样品分离脂肪酸或脂肪酸组合物。这些化学纯的脂肪酸或脂肪酸组合物有利于食品业领域、化妆品领域和特别地制药业领域的应用。

与属性或值相联系的情况下,术语“实质地”、“约”、“大致”、“基本上”等还分别具体地确切限定该属性或确切限定该值。在相同功能活性或基本上相同功能的语境下,术语“基本上”意指与参比功能相比,优选地在20%范围内、更优选地在10%范围内、最优选地在5%或更小范围内功能的差异。在制剂和组合物的语境下,术语“基本上”(例如,“基本上由化合物x组成的组合物”)可以在本文中如下使用:制剂和组合物内部基本上含有具有给定效果的所指化合物、不含具有这类效果的其他化合物或按这类化合物的不显示出可度量或有意义效果的最大量含有所指化合物。在给定数值或范围的情况下,术语“约”特别设计处于给予的所述值或范围的20%以内、10%以内或5%以内的值或范围。如本文所用,术语“包含”也包括术语“由……组成”。

术语“分离的”意指材料基本上不含至少一种在其原始环境内部与之天然结合的其他组分。例如,活动物中存在的天然存在的多核苷酸、多肽或酶不是分离的,然而与该天然系统中一些或全部共存物质分开的相同多核苷酸、多肽或酶是分离的。作为又一示例,一种分离的核酸分子,例如dna或rna分子是这样的分子,它并不紧密邻接于5′和3′侧翼序列,所述侧翼序列通常在衍生该分子的生物的天然存在的基因组中存在时与所述分子紧密邻接。此类多核苷酸可能是载体的部分、并入具有不相关遗传背景的细胞的基因组中(或并入具有基本上相似遗传背景的细胞的基因组,但处在与其天然存在位点不同的位点)、或通过pcr扩增或限制性酶消化产生、或是通过体外转录产生的rna分子,和/或这类多核苷酸、多肽或酶可以是组合物的一部分,并且仍可以是分离的,从而这种载体或组合物不是其天然环境的一部分。

用于克隆、dna分离、扩增和纯化的标准技术、涉及dna连接酶、dna聚合酶、限制性核酸内切酶等的酶促反应和各种分离技术是本领域技术人员已知并且常用的那些技术。下述文献中描述了多种标准技术:m.green和j.sambrook(2012)molecularcloning:alaboratorymanual,第4版,coldspringharborlaboratorypress,csh,newyork;ausubel等人,currentprotocolsinmolecularbiology,wileyonlinelibrary;maniatis等人,1982molecularcloning,coldspringharborlaboratory,plainview,n.y.;wu(编著)1993meth.enzymol.218,第i部分;wu(编著)1979methenzymol.68;wu等人,(编著)1983meth.enzymol.100及101;grossman和moldave(编著)1980meth.enzymol.65;miller(编著)1972experimentsinmoleculargenetics,coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,n.y.;old和primrose,1981principlesofgenemanipulation,universityofcaliforniapress,berkeley;schleif和wensink,1982practicalmethodsinmolecularbiology;glover(编著)1985dnacloning第i和ii卷,irlpress,oxford,uk;hames和higgins(编著)1985nucleicacidhybridization,irlpress,oxford,uk;以及setlow和hollaender1979geneticengineering:principlesandmethods,第1-4卷,plenumpress,newyork。

除非另外说明,否则本文中所用的术语将根据相关领域技术人员的常规用法来理解。除了本文所提供术语的定义之外,分子生物学领域中常见术语的定义也可以在rieger等人,1991glossaryofgenetics:classicalandmolecular,第5版,柏林:springer-verlag并在currentprotocolsinmolecularbiology,f.m.ausubel等人,编著,greenepublishingassociates,inc与johnwiley&sons,inc.之间的合资公司currentprotocols(1998supplement)中找到。

应当理解如本说明书中和权利要求中所用,”一个”或“一种”可以意指一个或多个,这取决于使用它的上下文。因此,例如,对“一个细胞”的提及可以利用至少一个细胞。应当理解本文中所用术语的目的仅在于描述具体实施方案,并且不意图是限制性的。

“纯化”意指该物质处于相对纯的状态,例如,至少约90%纯度,至少约95%纯度或至少约98%或99%纯度。优选地,“纯化的”意指材料处于100%纯状态。

术语“非天然存在的”指不存在于其原始环境或来源中的(多)核苷酸、氨基酸、(多)肽、酶蛋白、细胞、生物或其他材料,不过它可以最初衍生自其原始环境或来源并且随后通过其他手段加以繁殖。这类非天然存在的(多)核苷酸、氨基酸、(多)肽、酶蛋白、细胞、生物或其他材料可以在结构上和/或功能上与其天然副本相似或相同。

术语“天然”(或“野生型”或“内源”)细胞或生物和“天然”(或野生型或内源)多核苷酸或多肽指如自然界中存在的细胞或生物并且分别指如细胞中其自然形式和遗传环境下存在(即,无任何人类干预)的所讨论多核苷酸或多肽。

术语“异源”(或外源或外来或重组)多肽在本文中定义为:

相对于宿主细胞并非天然的多肽。这种异源多肽的蛋白质序列是合成的、非天然存在的、“人造的”蛋白质序列;

多肽,其相对于宿主细胞为天然的,但包含作为通过改变天然多肽的重组dna技术操纵宿主细胞的dna之结果的结构性修饰,例如,缺失、置换、和/或插入;或

相对于宿主细胞为天然的多肽,其中作为重组dna技术操作dna宿主细胞的结果(例如,更强启动子),定量地改变其表达或从异于天然宿主细胞的基因组位置指导其表达。

上文b)和c)的描述指处于其天然形式但不天然地由用于产生它的细胞表达的序列。产生的多肽因此更精确地定义为“重组表达的内源多肽”,其与上文定义不矛盾但反映以下特殊情形:它不是合成性质或操作的蛋白质的序列,而是产生多肽分子的方式。

类似地,术语“异源”(或外源或外来或重组)多核苷酸指:

相对于宿主细胞并非天然的多核苷酸;

多核苷酸,其相对于宿主细胞为天然的,但包含作为通过改变天然多核苷酸的重组dna技术操纵宿主细胞的dna之结果的结构性修饰,例如,缺失、置换、和插入;

相对于宿主细胞为天然的多核苷酸,其中作为重组dna技术操作多核苷酸的调节元件之结果(例如,更强启动子),定量地改变其表达;或

多核苷酸,其相对于宿主细胞为天然,但作为重组dna技术遗传操作之结果而未整合于其天然遗传环境内部。

对于两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个氨基酸序列,术语“异源”用来表征两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个氨基酸序列并非按照特定的彼此组合天然出现。

术语“基因”意指涉及产生多肽链的dna区段;它包含编码区(前导序列和尾随序列)之前和之后的区域以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

术语“基因”意指dna区段,其含有从亲本传递给后代并且促成生物表型的遗传信息。通过转录成rna(trna、rrna、mrna、非编码性rna)和在mrna情况下翻译成肽和蛋白质,介导基因对生物的形式和功能的影响。

本发明的术语杂交意指杂交必须在本发明序列的整个长度范围发生。

如本文中所定义的术语“杂交”是其中基本上互补的核苷酸序列相互复性的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行,即两种互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖凝胶(sepharose)珠或任何其他树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生,通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其它二级结构。

术语“严格性”指杂交发生的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成的影响。通常,将低严格条件选择成在定义的离子强度和ph处,低于特定序列的热解链温度(tm)约30℃。中等严格条件是当所述温度在tm以下20℃时,并且高严格条件是当所述温度在tm以下10℃时。高严格杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。但是,核酸可以在序列上悖离并且仍然编码基本上相同的多肽,原因在于遗传密码简并性。因而,有时候可能需要中等严格杂交条件以鉴定此类核酸分子。

“tm”是在定义的离子强度和ph时的温度,在所述温度下50%的靶序列在所述温度与完美匹配的探针杂交。tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如,较长的序列在较高的温度下特异性杂交。最大杂交速率从低于tm约16℃直至32℃获得。杂交溶液中一价阳离子的存在降低两条核酸链之间的静电排斥作用,因而促进杂交分子形成;这种作用对于高达0.4m的钠浓度是显而易见的(对于更高浓度,可以忽略这种作用)。甲酰胺降低dna-dna和dna-rna双链体的解链温度,每百分数甲酰胺降低0.6-0.7℃,并且添加50%甲酰胺允许在30-45℃进行杂交,虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并且对于大的探针来说,每%碱基错配tm下降约1℃取决于杂交分子的类型,tm可以使用以下等式计算:

dna-dna杂交分子(meinkoth和wahl,anal.biochem.,138:267-284,1984):

tm=81.5℃+16.6xlog[na+]a+0.41x%[g/cb]–500x[lc]-1–0.61x%甲酰胺

dna-rna或rna-rna杂交分子:

tm=79.8℃+18.5(log10[na+]a)+0.58(%g/cb)+11.8(%g/cb)2-820/lc

寡dna杂交体或寡rnad杂交体:

对少于20个核苷酸而言:tm=2(ln)

对于20-35个核苷酸:tm=22+1.46(ln)

a或对于其他一价阳离子,而仅在0.01-0.4m范围内是精确的。

b仅对于%gc在30%至75%范围内是精确的。

cl=双链体的长度(以碱基对计)。

doligo,寡核苷酸;ln,引物的有效长度=2×(g/c数)+(a/t数)。

可以使用许多已知技术中任意一种技术控制非特异性结合,例如将膜以含有蛋白质的溶液封闭、添加异源rna、异源dna和sds至杂交缓冲液,并且用rna酶处理。对于非相关的探针,可以通过改变以下条件之一进行一系列杂交:(i)渐进地降低复性温度(例如从68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50%至0%)。技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格条件的多种参数。

除了杂交条件之外,杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交所致的背景,样品用稀的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度:盐浓度越低并且洗涤温度越高,则洗涤的严格性越高。洗涤状态一般在杂交严格性上或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常,用于核酸杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。

例如,用于长度大于50个核苷酸的dna杂交分子的常见高严格杂交条件包括在65℃于1×ssc中或在42℃于1×ssc和50%甲酰胺中杂交,随后在65℃于0.3×ssc中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的dna杂交分子的中等严格杂交条件的实例包括在50℃于4×ssc或在40℃于6×ssc和50%甲酰胺中杂交,随后在50℃于2×ssc中洗涤。杂交分子的长度是杂交用核酸的预期长度。当杂交序列已知的核酸时,可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区域而确定杂交体长度。1×ssc是0.15mnacl和15mm柠檬酸钠;杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5xdenhardt试剂、0.5-1.0%sds、100μg/ml变性的片段化鲑精dna、0.5%焦磷酸钠。高严格性条件的另一个示例是在65℃于包含0.1sds和任选地5xdenhardt试剂、100μg/ml变性片段化鲑精dna、0.5%焦磷酸钠的0.1xssc中杂交,随后在65℃于0.3xssc中的洗涤。

出于定义严格性水平的目的,可以参考sambrook等(2001)molecularcloning:alaboratorymanua,第3版,coldspringharborlaboratorypress,csh,newyork或参考currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,n.y.(1989和年度更新版)。

杂交过程可以完全在溶液中进行,即两种互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖凝胶(sepharose)珠或任何其他树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生,通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其它二级结构。

通过初始杂交步骤,后续一个至几个洗涤步骤,进行常见杂交实验。用于这些步骤的溶液可以含有防止分析序列降解和/或防止探针的非特异性背景结合的额外组分,如edta、sds、片段化精子dna或相似试剂,这些组分是本领域技术人员已知(sambrook等人(2001)molecularcloning:alaboratorymanual,第3版,coldspringharborlaboratorypress,csh,newyork或currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,n.y.(1989和年度更新版))。

例如通过随机引发标记方法产生杂交实验的常见探针,所述方法最初由feinberg和vogelstein开发(anal.biochem.,132(1),6-13(1983);anal.biochem.,137(1),266-7(1984)并基于全部可能六核苷酸的混合物与待标记dna的杂交。标记的探针产物实际上将是一组具有可变长度、一般长度在100-1000个核苷酸大小范围内的片段,最高片段浓度一般约为200至400bp。最终作为杂交实验的探针使用的探针片段的实际大小范围例如也可以受以下影响:所用标记方法的参数、已产生的探针的后续纯化(例如琼脂糖凝胶)和用于标记的所用模板dna的大小(标记前,可以例如使用4bp切割酶(例如haeiii)限制性消化大模板)。

“重组”(或转基因)对于细胞或生物而言意指细胞或生物含有通过基因技术引入的异源多核苷酸,并且对于多核苷酸而言包括通过基因技术/重组dna技术产生的全部那些构建体,其中

(a)多核苷酸或其部分的序列,或

(b)与多核苷酸有效连接的一个或多个基因控制序列,例如启动子,或

(c)a)和b)两者

不位于它们的野生型遗传环境或已经被修饰。

应当进一步指出,术语“分离的核酸”或“分离的多肽”在一些情况下可以分别视为同义于“重组核酸”或“重组多肽”,并且分别指不位于其天然遗传环境或细胞环境和/或已经通过重组方法修饰过的核酸或多肽。分离的核酸序列或分离的核酸分子是这样一种核酸序列或分子,它不处于其天然环境或不处于其天然核酸邻居关系中,然而它与其他核酸序列或核酸分子物理地和功能地连接并且作为核酸构建体、载体序列或染色体的部分存在。一般,通过实验室条件下从细胞分离rna并且使其转化成副本dna(cdna)获得分离的核酸。

术语“控制”多肽或“控制”多核苷酸,例如用于鉴定可以在本发明方法中使用的多肽的测定法中,在本文中定义成影响多核苷酸表达(包括但不限于,编码多肽的多核苷酸表达)的全部序列。每个控制序列可以相对于该多核苷酸是天然或外来的或彼此是天然或外来的。这类控制序列包括但不限于前导序列、多聚腺苷化序列、前肽序列、启动子、5’-utr、核糖体结合位点(rbs、sd序列)、3’-utr、信号肽序列和转录终止子。至少,控制序列包括启动子和转录起始与终止信号。

对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子(或失效对照植物)是t0转化体的后代并且因分离而丢失转基因。此外,将对照植物在与本发明植物的培育条件相同的培育条件下培育,即在本发明植物附近并与之同时培育。如本文中所用的“对照植物”不仅指完整植物,也指植物部分,包括种子和种子部分。

“有效连接”意指所述组件处于允许它们以其意图方式发挥功能的关系。例如,与编码序列有效连接的调节序列以这样的方式连接,从而在与所述调控序列相容的条件下实现该编码序列的表达。

基因编辑或基因组编辑是一种基因工程,其中将dna插入、替换或从基因组移除并且可以通过以下方式实现所述基因工程:使用由以下组成的多种技术,如“基因改组”或“定向进化”,其由反复dna改组,随后进行适当筛选和/或选择组成,以产生编码具有修饰的生物学活性的蛋白质的变体核酸或其部分(castle等人(2004)science304(5674):1151-4;美国专利5,811,238和6,395,547),或借助“t-dna活化”标签法(hayashi等人,science(1992)1350-1353),其中所产生的转基因生物因接近于已引入启动子的基因的受调节表达而显示显性表型,或借助“tilling”(基因组中定向引入局部损害),并且指可用来生成和/或鉴定核酸的诱变技术,所述核酸编码具有修饰的表达和/或活性的蛋白质。tilling还允许选择携带这类突变变体的生物。本领域熟知用于tilling的方法(mccallum等人,(2000)natbiotechnol18:455-457;经stemple(2004)natrevgenet5(2):145-50综述)。另一项技术使用人工工程化的核酸酶如锌指核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(talens)、crispr/cas系统和工程化大范围核酸酶(meganucleases)如再工程化的归巢核酸内切酶(esvelt,km.;wang,hh.(2013),molsystbiol9(1):641;tan,ws.等人(2012),advgenet80:37–97;puchta,h.;fauser,f.(2013),int.j.dev.biol57:629–637)。

可以使用分子生物学中已知的多种技术,修饰dna和它们编码的蛋白质以产生具有新特性或改变特性的变体蛋白或酶。例如,随机pcr诱变,参见,例如,rice(1992)proc.natl.acad.sci.usa89:5467-5471;或者组合式多盒诱变,参见,例如,crameri(1995)biotechniques18:194-196。

备选地,核酸,例如,基因可以在随机或“随意”片段化后重装配,参见,例如,美国专利号6,291,242;6,287,862;6,287,861;5,955,358;5,830,721;5,824,514;5,811,238;5,605,793。

备选地,通过以下方法引入修饰、添加或缺失:易错pcr、改组、位点定向诱变、组装pcr、有性pcr诱变、体内诱变(噬菌体辅助连续进化、体内连续进化)、盒诱变、递归式整体诱变、指数式整体诱变、位点特异性诱变、基因再组装、基因位点饱和诱变(gssm)、合成性连接再组装(slr)、重组、递归式序列重组、硫代磷酸酯修饰的dna诱变、含尿嘧啶的模板诱变、缺口双链体诱变、点错配修复诱变、修复缺陷型宿主菌株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制-选择诱变、限制-纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体创建、和/或这些方法和其他方法的组合。

备选地,“基因位点饱和诱变”或“gssm”包括一种使用简并寡核苷酸引物向多核苷酸引入点突变的方法,如美国专利号6,171,820和6,764,835中详述。

备选地,合成性连接再组装(slr)包括将寡核苷酸结构单元非随意地连接在一起的方法(例如,如美国专利号6,537,776中公开)。

备选地,定制的多位点组合组装(“tmsca”)是一种通过在单一反应中使用至少两个致突变性非重叠寡核苷酸引物,产生在多个位点具有各种突变的不同组合的多个后代多核苷酸的方法。(如pct公开号wo2009/018449中所述)。

术语“底物特异性”反映可以由酶催化转化的底物的范围。

“酶特性”包括但不限于催化活性本身、底物/辅因子特异性、产物特异性、在时间过程期间稳定性增加、热稳定性、ph稳定性、化学稳定性和储存条件下稳定性改进。

“酶活性”意指酶产生的至少一种催化效果。在一个实施方案中,酶活性表述为单位/毫克酶(比活性)或每分钟每分子酶转化的底物分子数(分子活性)。酶活性可以依据酶的实际功能规定,例如通过催化肽键水解切割来实现蛋白酶解活性的蛋白酶、通过水解切割酯键来实现脂肪分解活性的脂肪酶等。

术语“重组生物”指这样的真核生物(酵母、真菌、藻类、植物、动物)或原核微生物(例如,细菌),所述生物已经如此以遗传方式改变、修饰或工程化,从而如与衍生所述生物的野生型生物相比,它显示出改变、修饰或不同的基因型。优选地,“重组生物”包含外源核酸。“重组生物”、“基因修饰生物”和“转基因生物”是在本文中可互换地使用。外源核酸可以位于染色体外的dna片段(如质粒)上或可以整合在生物的染色体dna中。在重组真核生物的情况下,将其理解为意指所用的核酸不存在于所述生物的基因组中或源自其中,或存在于所述生物的基因组中,但是不在所述生物的基因组中其天然基因座处,可能在一个或多个内源和/或外源控制元件的控制下表达该核酸。

宿主细胞可以是选自细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、藻类细胞或蓝细菌细胞、非人类动物或哺乳动物细胞或植物细胞的任何细胞。技术人员非常了解必须在所述基因构建体上存在以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。

如本文所用的术语“植物”指光合性、真核多细胞生物。植物涵盖绿藻(绿藻门(chlorophyta))、红藻(红藻门(rhodophyta))、灰藻门(glaucophyta)、藓类植物和地钱类(苔藓植物)、无种子维管植物(木贼类、石松类、蕨)和种子植物(被子植物和裸子植物)。术语“植物”涵盖完整植物、植物祖先及后代和植物部分,包括种子、枝条、茎、叶、根、花和组织及器官,其中前述每一者包含目的基因/核酸。术语“植物”也涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉、小孢子和繁殖体,再次地其中前述每一者包含目的基因/核酸。

如本文所用的术语“植物部分”涵盖种子、苗、茎、叶、根、花、和组织和器官、植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚胎、分生组织区、配子体、孢子体、花粉、小孢子和繁殖体。

“繁殖体”是植物的能够发育成完整植物的任何种类的器官、组织或细胞。繁殖体可以基于营养性繁殖(也称作营养繁殖、营养增殖或营养性克隆)或有性繁殖。繁殖体可以因此是种子或非繁殖器官的部分,如茎或叶。具体地,就禾本科(poaceae)而言,合适的繁殖体也可以是茎的切片,即,茎插枝。

术语“增加”、“改进”或“增强”是可互换的并且在本申请的含义下应当指与如本文中定义的对照植物相比产量相关性状(如但不限于更多产量和/或生长)至少3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%、优选地至少15%或20%、更优选地25%、30%、35%或40%增加。

术语”表达”或“基因表达”包括一个特定基因或多个特定基因或特定基因构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指某个基因或多个基因或基因构建体转录成结构性rna(rrna、trna)或mrna,所述mrna随后翻译成或不翻译成蛋白质。该过程包括dna的转录和所得mrna产物的加工。然而,如本文所用的术语“表达”还可以包括其中形成多肽的mrna分子翻译过程。因此,术语“表达”可以包括单独的转录过程、单独的翻译过程或合并的这两个过程。

如本文中所用的术语“增加的表达”、“增强的表达”或“过量表达”意指相对于野生型初始表达水平为额外的任何形式表达(其也可以是不存在表达或不可测量的表达)。本文中对“增加的表达”、“增强的表达”或“过量表达”的提及意指相对于对照植物而言基因表达增加,和/或只要提及多肽、增加的多肽水平和/或增加的多肽活性即可。与对照植物相比,表达、多肽水平或多肽活性的增加以增加的优选顺序是至少5%、10%、20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、85%、90%、或100%或甚至更多。

用于增加基因或基因产物的表达的方法是本领域内充分记录过的,并且包括例如由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以引入在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般在上游)中引入充当启动子或增强子元件的分离的核酸,从而增加编码目的多肽的核酸表达。例如,可以通过突变、缺失和/或置换在体内改变内源性启动子(参见kmiec,us5,565,350;zarling等,wo9322443),或可以将分离的启动子相对于本说明书的基因以恰当方向及距离引入植物细胞,从而控制该基因的表达。

如果需要多肽表达,则通常希望在多核苷酸编码区的3'末端包括多聚腺苷酸化区。

内含子序列也可以添加至5'非翻译区(utr)或部分编码性序列的编码序列上,以增加在胞浆内积累的成熟信使的量。已经显示在植物表达构建体和动物表达构建体的转录单位中纳入可剪接内含子在mrna水平和蛋白质水平均增加基因表达直至1000倍(buchman和berg(1988)mol.cellbiol.8:4395-4405;callis等人(1987)genesdev1:1183-1200)。此类内含子增强基因表达的作用一般在所述内含子置于转录单位的5'末端附近时最强烈。玉米内含子adh1-s内含子1、2和6、bronze-1内含子的用途是本领域已知的。对于一般信息,参见:themaizehandbook(玉米手册),第116章,编者freeling和walbot,springer,n.y.(1994)。

为了获得多肽的增加表达或过量表达,最常见地,使编码这种多肽的核酸按有义方向伴随多聚腺苷化信号的情况下过量表达。除了适于以预期表达模式驱动表达的启动子之外,可以使用内含子或其他增强性元件。

如本文所用的术语“载体”包含任何种类适合于携带外来多核苷酸序列用于转移至另一个细胞或用于给定细胞内部稳定表达或瞬时表达的构建体。如本文所用的术语“载体”涵盖任何种类的克隆载体,如但不限于质粒、噬菌粒、病毒载体(例如,噬菌体)、噬菌体、杆状病毒、粘粒、fosmid、人工染色体、或和任何其他对具体目的宿主特异的载体。还包括低拷贝数目载体或高拷贝数载体。外来多核苷酸序列通常包含在本文中可以称作“目的基因”的编码性序列。取决于源头或目的宿主细胞的种类,目的基因可以包含内含子和外显子。

载体因此是能够在宿主细胞中复制并且用于向宿主细胞或宿主生物引入目的多核苷酸序列的-在所含遗传元件的排列中部分或完全人造的-多核苷酸序列(如但不限于质粒或病毒多核苷酸序列)。载体可以是构建体或可以包含至少一个构建体,载体一般包含至少一个表达盒。如本文所用的载体可以提供区段供其在转化入宿主细胞或宿主细胞细胞器时转录和翻译。这类额外的区段可以包括调节性核苷酸序列、一个或多个为其在特定细胞类型中维持和/或复制必备的复制起点、一个或多个可选标志物、多聚腺苷化信号、用于插入外来编码性序列的合适位点如多克隆位点等。一个示例是需要载体在细菌细胞中维持为游离型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)的情况。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和cole1。载体可以在不整合至宿主细胞基因组中的情况下复制,例如作为细菌宿主细胞中的质粒,或它可以将其部分或全部dna整合入宿主细胞的基因组并且因此导致其dna的复制和表达。技术人员非常了解必须在所述基因构建体上存在以便成功转化、选择和增殖含有目的基因的宿主细胞的遗传元件。

外来核酸可以借助克隆引入载体。克隆可以意味着,通过用合适手段和方法(例如,限制性酶)例如在多克隆位点内部切割载体和用适宜手段(如,例如,限制性酶)切割包含编码性序列的外来核酸,在各个核酸内部产生了能够实现所述外来核酸和载体受控融合的合适构造物。

一旦向载体引入,包含编码性序列的外来核酸可以适合向宿主细胞或宿主细胞细胞器引入(转化、转导、转染等)。可以选择克隆载体以便运输入想要的宿主细胞或宿主细胞细胞器。可以选择克隆载体以便在宿主细胞或宿主细胞细胞器中表达外来多核苷酸序列。表达适应性通常要求调节性核苷酸序列与外来多核苷酸序列有效连接,从而外来多核苷酸序列在宿主细胞或宿主细胞细胞器中的表达是可能的。这种载体可以称作表达载体。

表达载体通常衍生自酵母或细菌基因组序列或质粒多核苷酸序列、病毒多核苷酸序列、或人工多核苷酸序列、或可以含有其两者或更多者的元件。如已经阐述,载体可以包含一个或多个“复制起点”,所述复制起点通常指示在此引发复制的特定核苷酸序列。通常,复制起点结合识别、解开和开始拷贝多核苷酸序列的蛋白质复合体。可以针对不同宿主细胞或宿主细胞细胞器选择不同复制起点。本领域技术人员熟悉这种选择。

为检测核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因生物或植物,使用标记基因(或报道基因)是有利的。因此,载体可以任选地包含选择标记基因。

术语“终止子”包括这样的控制序列,其是位于转录单位末端的dna序列,所述dna序列发出将初级转录物3'加工和多聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以从天然基因、从多种其他植物基因或从t-dna衍生。待添加的终止子可以衍生自例如胭脂碱合酶基因或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一种植物基因或较不优选地来自任何其他真核基因。

如本文所用的“构建体”、“遗传构建体”或“表达盒”(可互换地使用)是一种dna分子,其由至少一个待表达的与如本文所述的一个或多个控制序列(至少与启动子)有效连接的目的序列组成。一般,表达盒包含三种元件:启动子序列、可读框和3'非翻译区,所述非翻译区在真核生物中通常含有多聚腺苷化位点。额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。也可以将内含子序列添加至5'非翻译区(utr)或于编码序列中,以增加胞质溶胶中积累的成熟信使的量。技术人员非常了解必须在表达盒中存在以便成功表达的遗传元件。优选地,至少dna部分或形成表达盒的遗传元件的排列是人工的。表达盒可以是载体的部分或可以整合入宿主细胞的基因组并且随其宿主细胞的基因组一起复制。表达盒能够增加或减少目的dna和/或蛋白质的表达。

术语“功能连接”或“有效连接”意指所述组件处于允许它们以其意图方式发挥功能的关系。例如,与编码序列有效连接的调节序列以这样的方式连接,从而在与所述调控序列相容的条件下实现该编码序列的表达。此外,相对于调节元件,将理解为意指调节元件(例如启动子)与待表达的核酸序列并且根据需要与其他调节元件(例如,终止子)以如此方式依次排列,从而每种调节元件可以履行其意图功能以允许、调节、促进或另外影响所述核酸序列的表达。取决于所述核酸序列的排列,表达可以产生有义或反义rna。优选的排列是这些排列,其中待表达的核酸序列重组地位于充当启动子的序列之后,从而这两个序列相互共价地连接。在优选的排列中,待转录的核酸序列以如此方式位于启动子之后,其中转录起点与rna的所需开端相同。功能性连接和表达构建体可以借助如(例如,在maniatist,fritschef和sambrookj(1989)molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,coldspringharborlaboratory,coldspringharbor(ny);silhavy等人(1984)experimentswithgenefusions,coldspringharborlaboratory,coldspringharbor(ny);ausubel等人(1987)currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingassoc.andwileyinterscience;gelvin等人(编著)(1990)plantmolecularbiologymanual;kluweracademicpublisher,dordrecht,thenetherlands;r.d.d.croy的plantmolecularbiologylabfax(1993),biosscientificpublicationsltd(uk)和blackwellscientificpublications(uk)出版)所述的惯用重组技术和克隆技术产生。然而,其他序列,例如充当带限制性酶特定切割位点的接头或充当信号肽的序列,也可以位于这两个序列之间。序列的插入也可以导致融合蛋白表达。优选地,由调节性区域例如启动子和待表达核酸序列的连接组成的表达构建体可以按载体整合的形式存在并且被插入植物基因组,例如通过转化法做到。

如本文中所提及的术语“引入”或“转化”包括将外源性多核苷酸转移入宿主细胞,无论用于转化的方法是什么。即,如本文所用的术语“转化”无关于载体、穿梭系统或宿主细胞,并且它不仅涉及如本领域已知的多核苷酸转化转移方法(参见,例如,sambrook,j.等人(1989)molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny),而且它涵盖任何其他种类的多核苷酸转移方法,如,但不限于转导或转染。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚胎发生)的植物组织可以用基因构建体转化并且可以从中再生完整植物。所选的具体组织根据可用于并且最适于正在进行转化的具体物种的克隆性增殖系统而变化。可以将多核苷酸瞬时或稳定地引入宿主细胞中并且可以例如作为质粒维持为非整合。“稳定转化”可以意指转化的细胞或细胞器将包含外来编码性序列的核酸传递给下一代细胞或细胞器。通常,稳定转化因包含外来编码性序列的核酸整合入染色体或作为附加体(独立的核dna片段)整合所致。

“瞬时转化”可以意指一旦被转化,则细胞或细胞器就持续某个时间–大多在一个世代内表达外来核酸序列。通常,瞬时转化因包含外来编码性序列的核酸未整合入染色体或未作为附加体整合所致。

备选地,它可以整合入宿主基因组。所得的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化的植物。

转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(krens,f.a.等人,(1982)nature296,72-74;negrutiui等人,(1987)plantmolbiol8:363-373);原生质体电穿孔法(shillitor.d.等人,(1985)bio/technol3,1099-1102);微量注入植物材料法(crosswaya等人,(1986)mol.gengenet202:179-185);dna涂布粒子或rna涂布粒子轰击法(kleintm等人,(1987)nature327:70)、(非整合性)病毒感染法等。包括转基因作物植物在内的转基因植物优选通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是植物中(inplanta)转化法。为此目的,例如有可能将农杆菌作用于植物种子、作用于完好植株上或至少在上花原基上或有可能用农杆菌接种植物分生组织。用于农杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的熟知方法,如以下文献中描述的那些方法:欧洲专利申请ep1198985a1、aldemita和hodges(planta199:612-617,1996);chan等人(plantmolbiol22(3):491-506,1993)、hiei等人(plantj6(2):271-282,1994)。在玉米转化的情况下,优选的方法如ishida等人(nat.biotechnol14(6):745-50,1996)或frame等人(plantphysiol129(1):13-22,2002)描述。所述方法例如还在b.jenes等人,techniquesforgene,引自:transgenicplants,第1卷,engineeringandutilization,编者s.d.kung和r.wu,academicpress(1993)128-143和potrykusannu.rev.plantphysiol.plantmolec.biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌的载体,例如pbin19(bevan等人,nucl.acidsres.12(1984)8711)。用这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于植物转化。借助根癌农杆菌转化植物例如由和willmitzer在nucl.acidres.(1988)16,9877中描述或尤其从f.f.white,vectorsforgenetransferinhigherplants;引自transgenicplants,第1卷,engineeringandutilization,s.d.kung和r.wu编著,academicpress,1993,第15-38页中获知。

使用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为组织培养用外植体并且根据babic等人(1998,plantcellrep17:183-188)进行转化。商业栽培品种westar(agriculturecanada)是用于转化的标准品种,不过也可以使用其他品种。

术语“调节元件”、“控制序列”和“启动子”均在本文中可相互交换地使用并且在广泛含义上意指能够实现与之连接的序列表达的调节性核酸序列。“调节元件”或“调节性核苷酸序列”在本文中可以意指向宿主细胞或细胞器中转化已经发生时驱动核酸序列表达的核酸小片。调节性核苷酸序列可以包括各自具有功能或目的并且处于其他元件的特定排列或分组内部的任何核苷酸序列和该排列内部的序列。调节性核苷酸序列的示例包括但不限于转录控制元件如启动子、增强子和终止元件。调节性核苷酸序列可以相对于待表达的核苷酸序列是天然的(即来自相同基因)或外来的(即来自不同基因)。

术语“启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别及结合rna聚合酶和其他蛋白质,因而指导有效连接的核酸转录的核酸调控序列。“启动子”在本文中还可以包含能够驱动编码性序列转录的任何核酸序列。特别地,如本文所用的术语“启动子”可以指临近于起始密码子存在的通常称作基因5'调节区域的多核苷酸序列。在启动子区引发一个或多个编码性序列的转录。术语启动子还可以包括在启动基因转录方面有功能的启动子片段。启动子也可以称作“转录起始位点”(tss)。

前述术语还包括从经典真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的tata框、具有或没有ccaat框序列)衍生的转录调节序列并且相应于发育性刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式而改变基因表达的额外调节元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。

例如,如本领域已知和如本文所用的增强子通常是短dna区段(例如50-1500bp)可以被增加编码性序列将出现转录的可能性的蛋白质如转录因子结合。

本术语中还包括典型的原核基因的转录调节序列,在此情况下,它可以包括-35框序列和/或-10框转录调节序列。术语“调节元件”也涵盖赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的合成性融合分子或衍生物。可以在不干扰功能或活性的情况下,通过一个或多个核苷酸置换、插入和/或缺失来调节启动子,而且还可能通过修饰其序列增加活性。

其他元件可以是包含核酸序列小片的“转录终止元件”,所述核酸序列小片标示基因的末端并通过在mrna内部提供启动mrna从转录复合体释放的信号,介导转录性终止。原核生物中的转录性终止通常由rho依赖性或rho非依赖性终止子引发。在真核生物中,转录终止通常因与rna聚合酶ii缔合的蛋白质识别终止而发生。

“植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调节元件。因此,植物启动子不需要是植物来源的,而可以源自病毒或微生物。为了在植物中表达,如本文中所述,待表达的核酸分子必须有效连接于或包含合适的启动子,其中所述启动子在正确时间点并以所需的空间表达模式表达基因。

功能上等同的启动子具有与原初启动子基本上相同的强度和表达模式。为了鉴定功能等同的启动子,可以例如通过以下方式分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式:将启动子与报道基因有效连接并分析报道基因在植物多种组织的表达水平和模式。合适的熟知报道基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性,分析启动子活性。启动子强度和/或表达模式可以随后与参考启动子(如本文所述方法中使用的一种启动子)的启动子强度和/或表达模式比较。备选地,可以使用本领域已知的方法,如northern印迹法及放射自显影图密度计分析法、定量实时pcr或rt-pcr(heid等人,1996genomemethods6:986-994),通过定量mrna水平或通过将本文所述的方法中所用的核酸的mrna水平与持家基因(如18srrna)的mrna水平比较,分析启动子强度。

组成型启动子

“组成型启动子”指在生长和发育的大部分、但不必全部阶段期间,并且在大多数环境条件下,在至少一个细胞、组织或器官中有转录活性的启动子。

“遍在启动子”在生物的基本上全部组织或细胞中有活性。“发育调节性启动子”在某些发育阶段期间或在经历发育变化的植物的部分中有活性。诱导型启动子

“诱导型启动子”在相应于化学品(综述参见gatz1997,annu.rev.plantphysiol.plantmol.biol.,48:89-108)、环境刺激或物理刺激时具有受诱导或增加的转录启动作用,或可以是“胁迫诱导性的”,即当植物暴露于多种胁迫条件时受到激活,或是“病原体诱导的”,即当植物暴露于多种病原体时受到激活。器官特异性/组织特异性启动子

“器官特异性”或“组织特异性启动子”是能够优先在某些器官或组织如叶、根、种子组织等内启动转录的启动子。例如,“根特异性启动子”是在植物根中优势地具有转录活性的启动子,在植物的任何其它部分内基本上无活性,尽管在植物的这些其它部分内允许任何泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异的”。“种子特异性启动子”主要在种子组织中有转录活性,但不必排他性地在种子组织中有转录活性(在泄露表达的情况下)。种子特异性启动子可以在种子发育期间和/或萌发期间有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉/胚特异性的。qingqu和takaiwa(plantbiotechnol.j.2,113-125,2004)中给出种子特异性启动子的示例。如本文中所定义的“绿色组织特异性启动子”是在绿色组织中优势地具有转录活性的启动子,在植物的任何其它部分内基本上无活性,尽管在该植物的这些其他部分内仍允许任何泄露表达。

组织特异性启动子的另一个示例是分生组织特异性启动子,其在分生组织中优势地具有转录活性,在植物的任何其它部分内基本上无活性,尽管在该植物的这些其他部分中仍允许任意泄露表达。

“内含子”是真核基因内部非编码性dna的一部分,其从rna加工期间生成成熟和有功能mrna或其他类型rna的基因初级转录物中移除。

通常,如本文所用的术语“过量表达”包含多核苷酸过量表达(例如,在转录水平)和多肽过量表达(例如,在翻译水平)。在这种情况下,多核苷酸的表达水平可以由本领域普通技术人员借助本领域已知的方法容易地评估,例如,通过定量rt-pcr(qrt-pcr)、rna印迹(用于评估已表达mrna水平的量)、斑点印迹、微阵列等(参见,例如,sambrook,参见上述引文;currentprotocolsinmolecularbiology,2012年5月9日更新,印制国际标准连续出版物号(printissn):1934-3639,在线国际标准连续出版物号(onlineissn):1934-3647)。优选地,通过qrt-pcr测量已表达多核苷酸的量。

可以例如通过过量表达相应的pdct实现本发明方法中所用多肽的活性增加。

在这种情况下,多肽的表达水平可以由本领域普通技术人员借助本领域已知的方法容易地评估,例如,通过蛋白质印迹法、elisa、eia、ria等(参见,例如,sambrook,参见上述引文;currentprotocolsinmolecularbiology,2012年5月9日更新,印制国际标准连续出版物号(printissn):1934-3639,在线国际标准连续出版物号(onlineissn):1934-3647)。优选地,通过蛋白质印迹法测量已表达多肽的量。

若本文中未另外规定,则如若采用,认为缩写和命名是该领域的标准并且在专业期刊(如本文援引的那些)中常用的。

因此,本发明涉及以下项:

产生植物、其部分、植物细胞和/或植物种子油的方法,其中与对照相比,ala和la合计水平(ala加la水平)低于c18、c20和c22pufa合计水平,包括与对照相比,在植物、其部分、植物细胞和/或植物种子增加一种或多种pdct的活性[例如通过增加表达],其中所述pdct选自:

(a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、39、41、43和/或45具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct19的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct1活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:35、37和/或47;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct19的片段,其具有pdct1活性;

并且,任选地,分离种子油。

根据本发明的方法,pdct可以例如作为转基因在异源启动子的控制下表达。

此外,本发明的方法涉及一种在能够产生dpa、dha和/或epa并且表达δ-6延伸酶的植物、其部分、植物细胞和/或植物种子中增加dpa、dha和/或epa水平的方法,包括向植物、其部分、植物细胞和/或植物种子提供一种或多种pdct的增加活性或表达,所述pdct选自:

(a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct19的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct1活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:35、37和/或47;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct1的片段,其具有pdct1活性;

此外,本发明涉及一种在能够生产pufa和表达δ-6去饱和酶的植物、植物细胞、植物种子和/或其部分中增加δ-6去饱和酶转化效率的方法,包括与对照相比,在植物、植物细胞、植物种子和/或其部分中增加一种或多种pdct的活性[例如通过增加其表达实施],所述pdct选自:

(a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct19的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct1活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:35、37和/或47;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct1的片段,其具有pdct1活性。

此外,本发明方法中所用的δ-6去饱和酶例如是酰基coa依赖性δ-6去饱和酶。

此外,本发明的方法涉及一种在植物、植物种子、植物细胞或其部分中改善eta、优选地sda、eta、gla、hgla、epa、dha和/或dpa产生的方法,所述方法包括提供能够生产sda、eta、gla、hgla、epa、dha和/或dpa的植物、植物细胞、植物种子或其部分,包括增加一种或多种pdct的活性[或表达],所述pdct选自:

(a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct19的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct1活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:35、37和/或47;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct19的片段,其具有pdct19活性。

此外,本发明的方法涉及一种在油料作物植物中产生vlcpufa的方法,所述方法包括提供能够产生所需vlcpufa的第一油料作物植物变种,

提供具有一种或多种pdct的增加活性的第二油料作物植物变种,所述pdct选自:

a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct19的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct1活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:35、37和/或47;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct19的片段,其具有pdct19活性;

使第一和第二油料作物植物变种杂交,

任选地,测量衍生自杂交的第一代或后代细胞、种子、植物或其部分中的pdct19表达率,

任选地,测量衍生自杂交的第一代或后代细胞、种子、植物或其部分中的总pufa水平,

任选地,重复步骤2至5,

种植并培育植物,并且

从衍生自杂交的第一代或后代植物的种子分离包含vlcpufa的油。

根据本发明,“衍生自杂交”意指用来产生油的植物的世代不限于该世代,只要向植物、植物细胞或植物种子引入的特征因第一和第二油料植物变种杂交的产生即可。例如,任何世代的植物在其pufa产生方面得益于这种方法的结果,例如得益于pdct19活性增加。

例如,在本发明的方法中,植物、植物种子或植物细胞表达至少一种磷脂依赖性去饱和酶,优选地所述去饱和酶选自δ4-、δ5-、δ6-、ω-3-去饱和酶和δ12去饱和酶。

例如,在本发明的方法中,植物、植物种子或植物细胞表达至少一种磷脂依赖性去饱和酶和至少一种乙酰-coa依赖性去饱和酶,优选地所述去饱和酶选自δ4-、δ5-、δ6-、ω-3-去饱和酶和δ12去饱和酶。

例如,在本发明的方法中,植物、植物种子或植物细胞表达至少一种δ6延伸酶和/或至少一种δ6-去饱和酶。

此外,本发明涉及一种在能够产生gla、hgla、sda和/或eta的植物、植物细胞或部分种子或其部分中产生包含脂肪酸gla、hgla、sda和/或eta、优选地gla、hgla、sda和eta、甚至更优选地总pufa的组合物的方法,包括向植物、植物细胞或种子提供一种或多种pdct的增加活性或表达,所述pdct选自:

(a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct19的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct19活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:35、37和/或47;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct19的片段,其具有pdct19活性;

并且,任选地,分离包含所需脂肪酸的组合物。

例如,与pdct活性没有增加的对照相比,sda、eta、gla、hgla、epa、dha和/或dpa,更优选地总pufa的量增加。

此外,本发明涉及一种在能够产生sda、eta、gla、hgla、epa、dha和/或dpa的植物、植物细胞种子和/或其部分中增加酸类sda、eta、gla、hgla、epa、dha和/或dpa、甚至更优选地总pufa的水平的方法,包括向植物、植物细胞、种子或其部分提供一种或多种pdct的增加活性或表达,所述pdct选自:

(a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct19的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct19活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、39、41、43和/或45;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct19的片段,其具有pdct19活性;并且,任选地,分离包含所需脂肪酸的组合物。

其中植物、植物种子或植物细胞表达至少一种磷脂依赖性或酰基coa依赖性去饱和酶,优选地选自δ4-、δ5-、δ6-和δ12去饱和酶和/或至少一种选自δ5-、δ5δ6-和δ6延伸酶的磷脂依赖性延伸酶。

因此,例如,与对照(例如不显示pdgt19活性增加的植物、植物细胞或植物种子)相比,总pufa水平增加。

因此,本发明还涉及相比c18、c20和c22脂肪酸水平包含更少ala和la(w/w)的植物原料油,以及包含这种油的植物种子,例如油籽作物种子,和例如从源自如本文所述的芸苔属物种或亚麻荠属物种的种子衍生或获得的原料油。

此外,根据本文所述方法产生的原料油可以例如是从衍生自亚麻荠或芸苔属物种(brassicasp.)的植物或植物细胞分离的油组合物,所述植物或植物细胞表达δ6去饱和酶并且具有与对照相比降低至少10%、优选地20、30、40或50%更多的ala和la水平。

本发明的方法涉及一种能够产生eta的植物、植物细胞、或部分种子或其部分中改进脂肪酸gla产生、优选地增加总pufa的方法,所述方法包括

提供能够产生酸的植物、种子、或植物细胞,其包含

编码至少一种d12去饱和酶的至少一种核酸序列

编码至少一种ω3去饱和酶的至少一种核酸序列,

编码δ6-去饱和酶活性的至少一种核酸序列,

b)编码δ-6延伸酶活性的至少一种核酸序列,

c)编码δ-5去饱和酶活性的至少一种核酸序列,

d)编码δ-5延伸酶活性的至少一种核酸序列,和

e)编码δ-4去饱和酶活性的至少一种核酸序列,并且

其中植物具有一种或多种pdct的增加活性,所述pdct选自:

a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct1,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct1的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct1活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct1,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:35、37和/或47;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct1的片段,其具有pdct1活性;和

任选地,分离包含所需脂肪酸的组合物。

并且其中至少一种去饱和酶是pc依赖性的,

并且;任选地,分离包含epa、dpa和/或dha的脂肪酸组合物。

本发明方法中所用的植物或植物细胞优选地还能够产生c20和/或c22fa、尤其dha、epa和dpa。

本发明还提供一种如所述那样的方法,其中ala和la的水平与对照相比降低至少10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%或更多和/或其中ala与对照相比降低至少10%、20%、30%、40%、50%或更多。

此外,根据本发明的方法,例如,可以表达以下pdct之一:亚麻荠pdctc1和/或亚麻荠pdctc19。

例如在本发明的方法中,一种或多种pdct的活性可以增加,例如,如所述pdct选自:

a)与seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、40、42、44和/或46具有至少80%序列同一性的pdct1;

(b)由多核苷酸编码的pdct1,所述多核苷酸与seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、39、41、43和/或45具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct1,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、40、42、44和/或46的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、40、42、44和/或4636、38和/或48的pdct1的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct1活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct1,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、39、41、43和/或45;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct1的片段,其具有pdct1活性;并且,任选地,分离包含所需脂肪酸的组合物。

选自以下的一种或多种pdct:

(a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct19的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct19活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:35、37和/或47;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct19的片段,其具有pdct19活性。

此外,在一个实施方案中,在本发明的方法中,如本文定义的pdct3和或pdct5减少。例如,如果本发明方法中所用的植物是欧洲油菜,则以下pdct之一的活性降低:欧洲油菜pdct5a和/或欧洲油菜pdct3a。

本发明的方法还包括步骤:任选地分离作为原料油产生的脂肪酸组合物。任选地,将原料油作为脂肪酸组合物配制到食物或饲料中。

此外,本发明的方法例如还包括在植物、植物细胞或种子中表达又一pdct,其中所述pdct选自

(a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct19的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct19活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:35、37和/或47;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct19的片段,其具有pdct19活性。

和其中所述pdct19在异源启动子控制下表达。

此外,本发明的方法例如还包括:植物、植物细胞、植物种子或部分具有一种或多种pdct的降低活性,所述pdct选自:

(a)与seqidno:18、20、22、24、26、28、30、32、50、52、54、56、58和/或60具有至少80%序列同一性的pdct3和/或pdct5;

(b)由多核苷酸编码的pdct3和/或pdct5,所述多核苷酸与seqidno:17、19、21、23、27、29、31、49、51、53、55和/或57具有至少80%序列同一性;

(c)由一种或多种多核苷酸编码的pdct3和/或pdct5,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:18、20、22、24、26、28、30、32、50、52、54、56、58和/或60的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:18、20、22、24、26、28、30、32、50、52、54、56、58和/或60的pdct3和/或pdct5的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct3和/或pdct5活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct3和/或pdct5,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:17、19、21、23、27、29、31、49、51、53、55和/或57;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct3和/或pdct5的片段,其具有pdct3和/或pdct5活性。

例如,在本发明的方法中,可以通过从头表达或过量表达pdct1,实现增加的pdct1活性。此外,例如,当过量表达或从头表达图6b中所示的pdct1时,多于一种pdct1的活性增加。此外,例如,当过量表达或从头表达图6c中所示的pdct1时,多于一种pdct1的活性增加。根据本发明的方法,例如,还可以表达或过量表达如图6b中所示的pdct1和如图6c中所示的一种,以实现该方法的预期效果。

例如,在本发明的方法中,可以通过从头表达或过量表达pdct19,实现增加的pdct19活性。此外,例如,当过量表达或从头表达图6d中所示的pdct1时,多于一种pdct19的活性增加。根据本发明的方法,例如,还可以表达或过量表达如图6b中所示的pdct1和如图6c中所示的一种连同图6d中所示的pdct,以实现该方法的预期效果。

优选地,过量表达与目标生物(例如其中活性应当增加的生物)对应的基因。

例如,如图6d中所示的来自欧洲油菜的pdct3在本发明的方法中在欧洲油菜内其活性减少。例如,如图6f中所示的来自芥菜的pdct5在本发明的方法中在芥菜内其活性减少。

因此,本发明还涉及一种分离的、合成的或重组的多核苷酸,其包含

(a)与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性的核酸序列,其中核酸编码具有pdct19活性的多肽;

(b)编码与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的多肽的核酸序列,其中多肽具有pdct19活性;

(c)(a)或(b)的片段,其中片段编码具有pdct19活性的多肽;或

(d)与(a)至(c)中任一者完全互补的核酸序列。

此外,本发明还涉及一种分离的、合成的或重组的多核苷酸,其包含本发明的多核苷酸并且还包含:

(a)与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性的核酸序列,其中核酸编码具有pdct19活性的多肽;

(b)编码与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的多肽的核酸序列,其中多肽具有pdct19活性;

(c)(a)或(b)的片段,其中片段编码具有pdct19活性的多肽;或

(d)与(a)至(c)中任一者完全互补的核酸序列。

此外,本发明还涉及一种分离的、合成的或重组的多肽,其包含pdct的氨基酸序列,其中所述pdct选自:

(a)与seqidno:36、38和/或48具有至少80%序列同一性的pdct19;

(b)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸与seqidno:35、37和/或47具有至少80%序列同一性;

(c)由多核苷酸编码的pdct19,所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码seqidno:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交;

(d)seqidno:36、38和/或48的pdct19的变体,其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有pdct1活性;

(e)由多核苷酸编码的pdct1,所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于seqidno:35、37和/或47;和

(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的pdct19的片段,其具有pdct19活性。

此外,本发明的核酸构建体可以与一种或多种指导目的蛋白在细胞中、优选地在植物细胞中表达的异源控制序列有效连接。

例如,本发明还涉及优选地用于植物细胞中、优选地种子中表达的或包含于宿主细胞中、优选地在农杆菌、细菌细胞、植物细胞或种子细胞中的核酸构建体,所述核酸构建体例如衍生自油料作物,例如欧洲油菜、芥菜、埃塞俄比亚芥或亚麻荠、

因此,本发明涉及当替换内源调节元件时,增加内源pdct(包括本发明多肽)表达的替代调节元件。

此外,本发明涉及一种载体,所述载体包含本发明的多核苷酸或本发明的核酸构建体。例如,本发明的载体是质粒、表达载体、粘粒、fosmid或人工染色体。例如,本发明的载体包含选择标记、多聚腺苷化信号、多克隆位点、复制起点、启动子和/或终止信号。

此外,本发明涉及一种宿主细胞,所述宿主细胞包含本发明的多核苷酸、本发明的核酸构建体或本发明的载体。例如,宿主细胞经本发明的多核苷酸、本发明的核酸构建体或本发明权利要求的载体转化。此外,宿主细胞例如选自农杆菌、酵母、细菌、藻类或植物细胞。此外,宿主细胞例如稳定表达所述多核苷酸或载体。

另外,本发明涉及包含本发明多核苷酸或本发明核酸构建体、和宿主细胞、优选地本发明宿主细胞,例如农杆菌、酵母或植物种子细胞的组合物,其中核酸构建体是包含于宿主细胞中。

因此,本发明还涉及一种产生本发明多肽或本发明多核苷酸方法,所述方法包括步骤

(a)提供宿主细胞、优选地本发明的宿主细胞,例如农杆菌、酵母或植物种子细胞,所述宿主细胞包含编码本发明多肽或本发明多核苷酸的多核苷酸;

(b)在导致本发明多肽或本发明多核苷酸于步骤(a)的宿主细胞中产生的条件下培育步骤(a)的宿主细胞;并且

(b)任选地,回收本发明的多肽或本发明的多核苷酸。

此外,本发明涉及一种在能够产生gla的相对于对照植物具有增加的磷脂依赖性去饱和酶转化率的植物、植物细胞、或部分种子或其部分中,产生sda、eta、gla、hgla、epa、dha和/或dpa的量增加、优选地sda、eta、gla、hgla、epa、dha和/或dpa的组合增加、甚至更优选地总pufa增加的转基因植物、植物细胞、植物种子、其部分或其油,所述方法包括:

(i)在植物、或其部分、或植物细胞或植物种子中引入并且表达编码本发明多肽的核酸;并且

(ii)在促进低于c18、c20和c22pufa水平的ala加la水平和/或δ6去饱和酶转化率相对于对照植物而言增加的条件下培育所述植物细胞或植物。

根据本发明的方法,该方法例如包括以下步骤:

(i)在植物细胞或植物中将控制如权利要求29中定义的多肽或编码所述多肽的内源核酸分子表达的调节元件替换为增加如权利要求29中定义的多肽或编码所述多肽的核酸分子表达的替代调节元件;并且

(ii)在促进低于c18、c20和c22pufa水平的ala加la水平和/或相对于对照增加的δ6去饱和酶转化率的条件下培育所述植物细胞或植物。

因此,本发明还涉及通过本发明方法可获得的转基因植物、或其部分、或植物细胞、或植物种子。例如,相对于对照或亲本植物,转基因植物或其部分、或植物细胞、或植物种子或植物油具有在能够产生gla的植物、植物细胞或部分种子或其部分中增加的gla、hgla、sda和/或eta的量、甚至更优选地总pufa的量和/或增加的磷脂依赖性去饱和酶转化率,其因如本发明方法中所用的pdct19的活性增加导致,优选地因编码本发明pdct的核酸表达增加导致。本发明的转基因植物、或其部分、或植物细胞、或植物种子例如是包含本发明表达构建体的转基因植物、或其部分、或植物细胞、或植物种子,并且例如是油料作物种子植物,例如亚麻荠种子或芸苔属物种(brassicasp.)种子,或如本文所述那样。

通过本发明方法可获得转基因植物、或其部分、或植物细胞、或植物种子,其中所述植物、植物部分或植物细胞包含重组核酸,所述重组核酸编码如对本发明方法的用途所述那样的pdct多肽;本发明的多核苷酸或核酸分子;本发明的多肽;本发明的载体;本发明的表达构建体或替代调节元件,所述替代调节元件控制如本发明方法中使用的多肽表达;例如,如本发明的多核苷酸或编码该多肽的核酸分子。

本发明还涉及包含c18至c22脂肪酸的植物、植物细胞、植物种子或其部分,例如油籽作物种子或细胞、或植物油,例如从植物、植物种子、植物细胞或其部分获得或包含于其中的原料油,其中ala和la水平低于c18至c22脂肪酸的水平。

因此,本发明涉及植物,或其部分、植物种子、植物细胞或植物油,其中ala和la水平优选地低于sda;eta、gla、hgla、epa、dha和dpa的水平。

此外,本发明涉及用重组核酸转化的植物、植物部分或植物细胞,所述重组核酸编码本发明的pdct多肽、本发明的多核苷酸、本发明的核酸构建体或本发明的载体或控制本发明多肽或编码本发明多肽的核酸分子表达的替代元件。例如,本发明的转基因植物或从其衍生的转基因植物细胞属油料作物植物、优选地欧洲油菜、芥菜、埃塞俄比亚芥或亚麻荠植物

此外,本发明涉及本发明植物的可收获部分,例如所述可收获部分是种子。

此外,本发明涉及包含重组核酸的细胞的转基因花粉粒或任何其他生殖细胞/单倍体衍生物,所述重组核酸编码本发明的pdct多肽、本发明的多核苷酸、本发明的核酸构建体或本发明的载体。

另外,本发明涉及包含本发明多肽的蛋白质制备物,其中蛋白质制备物包含冻干的组合物/制剂和/或额外的酶或化合物。

此外,本发明涉及来自芸苔属物种或亚麻荠属物种的原料油,其包含降低的ala水平。

此外,本发明涉及来自芸苔属物种或亚麻荠属物种的原料油,其具有低于c18、c20和c22pufa水平的ala加la水平。

例如,原料油是种子油。例如,原料油从本发明的种子或植物获得并且不作进一步加工,或者获得原料油的最少步骤包括获得种子和破碎、溶剂提取、或使用其他物理手段(例如离心)从剩余的固形物(即粗粉)分离油。

此外,本发明涉及与具有pdct19活性的本发明多肽或其片段特异性结合的抗体或抗体片段。

此外,本发明涉及从植物的可收获部分、优选地从种子植物衍生或产生的产物,其中

植物包含编码本发明pdct多肽的重组核酸、本发明的多核苷酸、本发明的核酸构建体或本发明的载体或本发明的根据本发明方法产生的多肽或;或

(a)的产物,其中产物是含有自植物产生的组合物的干燥颗粒、纸浆颗粒、压制的茎秆、粗粉、粉末或纤维;或

(a)的产物,其中产物包含自所述植物产生的油、脂肪、脂肪酸、糖或淀粉、树汁、汁液、糖蜜、糖浆、粗糠或蛋白质。

此外,本发明涉及一种表达本发明多核苷酸的方法,所述方法包括:

(a)通过向宿主细胞引入核酸构建体,提供包含本发明任一项的异源核酸构建体的宿主细胞;

(b)在导致多核苷酸表达的条件下培育步骤(a)的重组宿主细胞;并且

(c)任选地,回收由多核苷酸编码的目的蛋白。

另外,本发明描述了本发明pdct多肽、本发明多核苷酸、本发明核酸构建体或本发明载体或本发明多肽或根据本发明方法产生的多肽或本发明方法的用途,用于产生包含epa、dha和epa并且具有低于c18、c20和c22pufa水平的ala加la水平的植物、细胞、种子、种子油或植物油。

此外,本发明是包含epa、dha和epa并且具有低于c18、c20和c22pufa水平的ala加la水平的粗粉。

优选地,植物、种子油或粗粉中ala+la水平ala比总pufa水平低10%、20%、30%、40%、或50%或更多。

另外,本发明涉及一种饲料或食物,其包含本发明的植物油或从本发明种子产生的粗粉。

此外,本发明涉及本发明的饲料或食物组合物或本发明方法的产物,其不包含衍生自动物的油。优选地,饲料或食物组合物不包含任何鱼油或鱼脂肪。

因此,本发明的方法例如涉及一种其中dpa、dha和/或epa水平增加的植物、植物种子、植物原料油、植物种子油、植物细胞、粗粉。

附图:

图1pdct蛋白质序列比对

图注:at:拟南芥,bn:欧洲油菜,bc:埃塞俄比亚芥,cs:亚麻荠,gm:大豆(glycinemax),lu:亚麻(linumusitatissimum),rc:蓖麻(ricinuscommunis),ta:普通小麦(triticumaestivum),zm:玉蜀黍(zeamays)。

*其他研究中展示的活性

**基于ncbi数据库的blast检索同源性选择的蛋白质,活性未展示

颜色设置:不相似、略微相似:深灰色;保守:浅灰色;相似区块:中等灰色;相同:白色

图2亚麻荠序列n端区域的比对。亚麻荠蛋白质中的全部差异均处于这个区域中。

颜色设置:不相似、略微相似:深灰色;保守:浅灰色;相似区块:中等灰色;相同:白色

图3基于pdct蛋白质序列的进化系统树。

图注:at:拟南芥,bn:欧洲油菜,bc:埃塞俄比亚芥,cs:亚麻荠,gm:大豆(glycinemax),lu:亚麻(linumusitatissimum),rc:蓖麻(ricinuscommunis),ta:普通小麦(triticumaestivum),zm:玉蜀黍(zeamays)。

*其他研究中展示的活性

**基于ncbi数据库的blast检索同源性选择的蛋白质,活性未展示

图4.转基因拟南芥属植物中脂肪酸合成途径的途径和基因。

图5.pdct的作用(修改自lu等人,2009)

图6基于表5的pdct蛋白质序列的进化系统树

图7描述计算途径步骤转化效率的公式。s:途径步骤的底物。

p:途径步骤的产物。产物总是在这个途径步骤处转化过程的直接产物和经过这个途径步骤旨在形成的全部下游产物的总和。例如,dha(22:6n-3)的确拥有因油酸(18:1n-9)发生δ-12-去饱和成为亚油酸(18:2n-6)所致的双键。

图8.

表5的pcdt序列的needle矩阵

图9.

去饱和酶的转化率效率。

实施例

实施例1:材料和方法:

基因的克隆:

使用superscriptiii,逆转录来自欧洲油菜、埃塞俄比亚芥和亚麻荠幼根组织的rna。用于克隆cdna的引物基于来自ncbi序列数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因组序列信息并且基因的命名遵循这些数据库中的信息。校正酶phusion用来克隆cdna,将所述cdna转化入pyes2.1,之后测序。七个源自染色体1a、1c、2c、3a、3c、5a和5c的pdct样基因克隆自欧洲油菜。七个源自染色体1b、1c、2b、3b、3c、5b和5c的基因克隆自埃塞俄比亚芥。三个源自染色体1、15和19的基因克隆自亚麻荠。表1中给出cdna和翻译产物的序列。

序列分析:

全部克隆在转化之前均测序。使用软件程序vectornti,构建蛋白质比对结果和进化系统树。

构建转化载体和拟南芥属植物转化:

因为来自埃塞俄比亚芥和欧洲油菜的c基因组基因是相同或几乎相同,仅来自埃塞俄比亚芥的c亚基因组衍生的pdct基因用于进一步实验中。将pdct基因克隆入puc-19napin-b载体,以添加油菜籽蛋白启动子和osc终止子,如wu等人(2005)中所述。通过限制性酶消化取下包含启动子和终止子的基因并连接至携带破囊壶菌属物种(thraustocytriumsp.)δ6延伸酶(序列id:kh273553.1)和畸雌腐霉(p.irregulare)δ6去饱和酶(序列id:af419296.1)的puc19-abc。通过限制性酶消化从载体取出这三个基因并连接入植物双元载体psun2-asc。在转化之前,通过限制酶切消化法分析全部载体。对照包括空载体和仅含畸雌腐霉d6去饱和酶和pse(tc)延伸酶的载体。使用chaofulu友好提供的拟南芥rod1(at3g15820)突变株系(lu等人2009)作为拟南芥宿主植物。这个突变体具有g至a突变,所述突变在拟南芥rod1基因编码的磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(pdct)酶中产生提前终止密码子(lu等人2009)。通过测序检验四株植物,表明全部植物均对相关突变为纯合,并且从这些植物采集种子并用于转化。将植物双元载体转化入根癌农杆菌菌株gv3101-pmp90。将宿主植物培育直至抽薹阶段并且使用“花浸染法”转化(clough和bent,1998)。基本上,将携带每种载体的根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)培育至对数生长中期阶段、离心并在含有0.05%silwetl-77的5%蔗糖溶液中悬浮至od6000.8并且将植物浸没于这种溶液中2-3分钟,同时温和搅拌。在成熟后,对种子灭菌并使其在含有50mg/l卡那霉素以选择转基因植物的1/2xms选择性培养基上萌发。将阳性植物移栽入土壤并培育至成熟。

gc分析:

来自阳性t1植物的二十粒t2种子用来提取脂肪酸。将种子置于洁净的玻璃管中,向每只管添加2ml3m甲醇hcl,将封端的管在80℃温育4小时。温育后,将样品冷却至室温,随后向每份样品添加1ml0.9%nacl和2ml己烷并且涡旋混合。随后将样品离心并且移出己烷(顶)层并添加至洁净的玻璃管。使样品在氮气下蒸发直至干燥。向管添加80μl己烷并短暂涡旋混合以重悬脂肪酸。随后将溶液移至含有gc插入物的收集小瓶,并且进行gc分析(表2)。

通过在选择性培养基上萌发50-100粒种子测试转基因的分离,并且测试拟合3:1假设(表3)。以3:1比率分离(与构建体在单个基因座处的表达一致)的转基因植物的籽苗后代用于进一步分析。如上文所述那样对来自每个基因的3-5个株系中的20粒种子实施gc分析,并且确定脂肪酸分布(表4)。

实施例2:结果:

这项研究中克隆的19个pdct基因的氨基酸序列落入5个不同的组(图1、图2和图3)。这些组由以下者组成:欧洲油菜和埃塞俄比亚芥的染色体1衍生序列、欧洲油菜和埃塞俄比亚芥的染色体2序列、埃塞俄比亚芥和欧洲油菜的染色体3序列、欧洲油菜和埃塞俄比亚芥的染色体5基因和三个亚麻荠序列(图2)。埃塞俄比亚芥和欧洲油菜的c亚基因组衍生基因的氨基酸翻译相同或几乎相同,不过cdna序列中存在差异(图1、表1)。大部分的氨基酸序列差异出现在翻译产物的n端区域中,而保守氨基酸区段遍及中间区域和c端区域存在(图1)。组1序列比该区域内其余序列短约42个氨基酸。三个亚麻荠序列之间的差异出现在前60个氨基酸内部(图1、图2)。

在具有畸雌腐霉δ6-去饱和酶和破囊壶菌δ6-延伸酶的拟南芥rod1突变体中共表达来自欧洲油菜的四个亚基因组apdct基因、来自埃塞俄比亚芥的四个亚基因组b和四个亚基因组c基因和来自亚麻荠的全部三个pdct基因。拟南芥rod1突变体和野生型拟南芥株系(具有活性的内源pdct基因)也用畸雌腐霉δ6-去饱和酶和破囊壶菌δ6-延伸酶转化,并且未转化的野生型和rod突变系用于比较。

如图4中所示,δ6-去饱和酶和δ6-延伸酶的表达将导致拟南芥种子中产生异质性脂肪酸γ-亚麻酸(gla;18:2δ11,14)、硬脂艾杜糖酸(sda;18:3δ6,9,12,15)、二-高γ-亚麻酸(dgla;20:3δ8,11,14)和二十碳四烯酸(eta;20:4δ8.11,14,17)。如图5中所示,有活性的pdct基因将导致oa(18:1δ9)水平下降和la(18:2δ6,9)、ala(18:3δ6,9,15)和/或gla的水平增加。

已经显示拟南芥rod1基因中突变的存在增加种子油中的18:1百分数(lu等人,2009)。这项研究中所用的未转化的rod1突变体内的18:1百分数平均为30.42%,而未转化的野生型株系的种子油含有15.334%的18:1。来自携带组1和组2染色体衍生pdct基因的拟南芥株系的种子油具有范围从25.72-31.12%的平均18:1水平(表2)。这与仅用δ6-去饱和酶和δ6-延伸酶转化的rod突变系中的水平相当(平均30.732%)。但是,携带亚基因组3a、3b和3c衍生基因的种子中的水平为14.959-15.871%。在携带染色体5衍生pdct基因的种子中的水平为11.994-16.696%,并且在携带亚麻荠基因的种子中的那些水平为13.288-14.050%。因此,尽管欧洲油菜染色体3衍生基因和染色体5衍生基因和三个亚麻荠基因能够代偿拟南芥pdct基因中的突变,但染色体1衍生基因和2衍生基因似乎已经很少影响或不影响18:1水平。这表明,染色体1衍生基因和2衍生基因可以具有与拟南芥pdct基因不同的功能和/或对不同底物的作用。

来自一系列物种(包括普通小麦、拟南芥、玉蜀黍、蓖麻、大豆和亚麻)的pdct样翻译产物的比对显示,高度保守性氨基酸置换遍及欧洲油菜染色体1衍生蛋白质和染色体2衍生蛋白质出现。使用编号基于拟南芥rod1序列的比对显示在图1中、欧洲油菜染色体1衍生的酶显示保守区域中的以下变化:位置102:m至t;在104-105之间:插入e,和225:h至q。除保守区域中的这些变化之外,多个差异出现在蛋白质的较不保守的n端区域内。

在分别来自埃塞俄比亚芥和欧洲油菜的染色体2b衍生蛋白质和染色体2c衍生蛋白质情况下,在保守区域检出较大数目的置换。使用基于拟南芥rod1序列编号的氨基酸残基编号,检出以下置换:98:v/l至f;101:f至v;102:m至v;106:y至s;141:l/v至g;149-150:fv至lg;158:l/v至a;176:m至v;186:s/a至c;192:p至s;211:l至y;和230:m/v至t。值得注意地,位置230处的这种苏氨酸置换还出现在大部分的染色体1组蛋白质中;位置106处的m至t置换亦是如此。

在未转化的拟南芥野生型株系中,与rod1突变体植物相比,18:1减少由18:2增加代偿(野生型中的27.545%,而rod突变体中14.323%,表2),不过还出现ala轻微增加(16.066%vs.14.323%)。携带延伸酶和去饱和酶基因外加染色体-1或2pdct基因的转基因系具有8.314%-12.165%的la水平,而携带染色体3衍生和染色体5衍生pdct基因的株系具有18.149%-20.142%的水平。携带亚麻荠基因的株系具有11.324%(染色体1衍生pdct)、19.912%(c15)和8.635%(c19)的18:2水平。在携带亚麻荠c1基因(7.771%)和c19基因(7.656%)的株系中,ala水平也比较低,而含有c15基因的株系具有最高的平均ala含量(14.826%)。但是,在携带δ6-去饱和酶和δ6-延伸酶连同pdct基因的株系中,在pdct基因存在下产生的额外18:2可以不仅用来产生ala,而且还可以用于合成gla、dgla、sda和eta(图4)。这些脂肪酸的总水平在携带c1(25.225%)和c19(24.379%)pdct基因的株系中最高,并且这两个株系还具有最高水平的gla加hgla(分别是22.183%和21.094%)。携带亚麻荠c15基因的株系的脂肪酸特征与组5和组3染色体更相像,在于总ala加sda加eta(16%)显著高于总gla加hgla(8.767%)。仅在c1株系和c19株系中,gla加hgla的总水平高于ala加sda加eta的总水平(表2)。因此,不仅多种pdct的确显示总效率差异,而且似乎还在基因之间有不同底物偏好性。亚麻荠c1蛋白和c19蛋白与c15蛋白差异仅在于蛋白质n端区域内有限数目的氨基酸(图2)。位置3在c15中是缬氨酸,而在c1和c19中为丙氨酸。位置4在c15中是丙氨酸,而相似的氨基酸残基丝氨酸和苏氨酸分别在c1和c19中的位置4处。c1和c19中位置20处的保守组氨酸由c15中的天冬酰胺替换,c1和c19中位置35至36处的脯氨酸-缬氨酸残基替换为c15中的精氨酸-异亮氨酸,并且位置41处的苏氨酸替换为c15中的赖氨酸。最后,c15在位置63具有氨基酸(甘氨酸)插入。这些差异指示pdct酶的n端区域在决定酶活性方面的重要性。

潜在地,失活一种或多种亚麻荠pdct酶可以调节pdct活性水平,并且还可能在增加特定脂肪酸水平方面或在推动脂肪酸指向ω3或ω6途径方面有益的。由于欧洲油菜和埃塞俄比亚芥各自具有四个有活性的pdct基因,故应当可能通过组合有活性基因和无活性基因实现pdct活性水平范围。避免快速转移到dag上可以允许通过植物lpcat酶的逆反应向酰基辅酶a池更高效转移。已经显示lpcat的逆反应在植物中编辑pc时发挥重要作用,并且植物lpcat还显示脂肪酸选择性(lager等人,2013)。这可能对产生vlc-pufa有特别意义,其中脂肪酸快速移动至dag池并随后移动至tag可能不合乎需要。

为了确保转基因株系之间活性的差异不反映pdct基因拷贝数的差异,检测了t2植物的分离比率(表3),并且来自契合3:1分离比率的株系的t3种子用于gc分析。结果看上去高度像来自t2代的那些结果(表4)。携带染色体组1或组2衍生pdct基因的株系中的18:1水平是31.26%-31.41%,而组3和组5株系中的水平为12.17%-14.59%。携带亚麻荠基因的株系中的水平是12.89%至14.60%。携带组1和组2染色体基因的株系中的la水平是6.58%-10.06%,而携带染色体3衍生基因或染色体5衍生基因的株系组中的水平是15.58%-23.54%。携带c1、c15和c19pdct基因的株系中的水平分别是11.53%、21.49%和7.50%。再次,c1和c19株系中的la低水平归因于这些株系中gla加dgla水平极高(c1中20.85%和c19中23.11%)。

实施例3:来自不成熟种子的不同脂质类别中的脂肪酸平均组成(%)

对不成熟长角果(来自去饱和酶转基因和延伸酶转基因纯合的植物)进行薄层色谱(tlc)分析,以测量不同脂质池中的脂肪酸特征,即,磷脂酰胆碱(pc)、二酰甘油(dag)和三酰甘油(tag)。简而言之,通过快速冷冻和研磨绿色长角果,随后转移大约500mg研磨的样品至含3ml氯仿:甲醇:甲酸(10:10:1,v/v/v)的离心管中并且在-20℃储存过夜,从不成熟长角果提取总脂质。离心后,收集上清液,并且用1.1ml氯仿:甲醇:水(5:5:1,v/v/v)再提取沉淀物。将提取物合并并且用1.5ml0.2mh3po4/1mkcl洗涤。使氯仿相中的脂质干透并再溶解于0.2ml氯仿中。在预展开和干燥tlc平板后,使样品在己烷/二乙醚/乙酸(70:30:1)中展开。分离tag和dag并用3m甲醇hcl直接甲基化。从平板收集极性脂质,提取并重悬于氯仿中,随后在氯仿/甲醇/乙酸/水(60:30:3:1)中再展开以分离pc。通过喷洒樱草灵溶液并暴露于紫外线,使条带可视化。从tlc平板刮下适宜的二氧化硅条带,并用2ml3m甲醇hcl在-80℃处理,随后通过gc加以分析。全部脂肪酸数据展示为相对%并且在表7中显示。表7显示来自采用d6(pi)去饱和酶+tcd6延伸酶转化的拟南芥的不成熟种子的不同脂质类别中的脂肪酸平均组成(%)。

表7中的数据可以用来理解多个pdct基因怎样影响脂肪酸在不同脂质池之间运输。例如,当表达亚麻荠c19基因时,18:1不蓄积于待转移至tag的dag中,而移动至pc并且从那里,充当其他基因的底物,导致tag中18:1减少。反过来在有活性亚麻荠c19编码的pdct存在下,gla似乎从pc高效移动至dag和tag,而在pdct基因不存在的情况下产生的少量gla主要留存于pc池中。

表5

表7.来自不成熟种子的不同脂质类别中的脂肪酸平均组成(%)

ckwt:具有d6(pi)去饱和酶+tcd6延伸酶的wt拟南芥;wt:未转化的野生型拟南芥;rodmut:未转化的拟南芥rod突变体;ckmutan:具有d6(pi)去饱和酶+tcd6延伸酶的拟南芥rod突变体

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