本申请涉及一种用于保护乳酸菌防冻的有效成分及所述有效成分的利用/应用。
背景技术：
：乳酸菌(lacticacidbacteria)也被称为乳酸杆菌或乳杆菌，它在哺乳类的肠道内栖息，防止杂菌引起的异常发酵，因此也是用作整肠剂的重要细菌。然而，为了发挥细菌的效果，需要摄入比以往从酸奶等食品中摄取的量更多的乳酸菌。因此，现在普遍采用仅将乳酸菌分离出来制成粉末或者胶囊形态来简便食用的方法。然而，如果将乳酸菌制成粉末或者胶囊形态，则存在以下局限，即在长期的流通过程中死亡的乳酸菌较多，从而无法发挥乳酸菌原本的生理活性功能。为了保持所述生理活性，采用涂覆明胶等方法(国际食品研究“foodresearchinternational”，尚帕涅(champagne)等人著，29，555-562(1996))，然而，当前需要开发一种能够进一步提高乳酸菌存活率及保存稳定性的方法。技术实现要素：解决的技术问题本申请提供一种乳酸菌防冻保护用组合物或乳酸菌防冻保护用培养基及利用该组合物或培养基的乳酸菌制剂的制造方法，其保护乳酸菌防止冻结，同时即使经过冷冻干燥制成粉末后，也能够赋予乳酸菌较高的稳定性，例如，能够赋予其热稳定性。此外，本申请提供一种能够通过促进乳酸菌生长来保持良好的乳酸菌生产效率的促进乳酸菌生长的方法及促进乳酸菌良好生长的乳酸菌培养基。解决方法为此，本申请的一个层面，提供一种包含半胱氨酸或半胱氨酸的盐作为有效成分的乳酸菌防冻保护用组合物。另外，本申请的另一方面，提供一种乳酸菌制剂的制造方法，该方法包括：将乳酸菌与所述乳酸菌防冻保护用组合物混合，并对所述混合物进行粉末化。另外，本申请的另一方面，提供一种包含半胱氨酸或半胱氨酸的盐作为有效成分的乳酸菌防冻保护用培养基。另外，本申请的另一方面，提供一种乳酸菌制剂的制造方法，该方法包括：将乳酸菌在所述培养基中进行培养，将培养的乳酸菌菌体进行回收，并对回收的乳酸菌菌体进行粉末化。另外，本申请的另一方面，提供一种含有乳酸菌及半胱氨酸或半胱氨酸的盐的乳酸菌制剂。另外，本申请可以提供一种包含半胱氨酸或半胱氨酸的盐作为有效成分的用于促进乳酸菌生长的培养基。另外，本申请可以提供一种促进乳酸菌生长的方法，该方法包括：在本申请的培养基，例如，在乳酸菌防冻保护用培养基及/或用于促进乳酸菌生长的培养基中培养乳酸菌。另外，本申请可以提供一种调节乳酸菌能量代谢的方法，该方法包括：在本申请的培养基，例如，在乳酸菌防冻保护用培养基及/或用于促进乳酸菌生长的培养基中培养乳酸菌。另外，本申请可以提供一种提升乳酸菌的热稳定性的方法，该方法包括：在本申请的培养基，例如，在乳酸菌防冻保护用培养基及/或用于促进乳酸菌生长的培养基中培养乳酸菌。有益效果本申请的活性成分即半胱氨酸或半胱氨酸的盐不仅能够保护乳酸菌防止冻结，而且即使经过冷冻干燥进行粉末化之后，也能够提升稳定性，以确保乳酸菌能够最大限度地保持活性。特别是，半胱氨酸或半胱氨酸的盐酸盐具有即使在高温物理环境下也能够使经过粉末化之后尚且存活但不再增殖的乳酸菌表现出优异稳定性的效果，因此，可以使存活的乳酸菌的流通或者保存/储存变得更加容易。另外，通过在本申请的培养基，例如，在乳酸菌防冻保护用培养基及/或用于促进乳酸菌生长的培养基中培养乳酸菌，能够大幅提高乳酸菌的生长量(growthyield)。另外，还能够显著提升乳酸菌的热稳定性。然而，本申请的效果并非仅限于上面提到的效果，本领域的技术人员通过以下介绍能够清楚理解尚未提及的其它效果。具体实施方式首先，将本申请中使用的术语进行定义。本申请中所称术语“乳酸菌”是对通过发酵糖类来获得能量并生成大量乳酸的细菌统称的术语，所述乳酸菌可以是从由乳杆菌属(lactobacillussp.)、双歧杆菌属(bifidobacteriumsp.)、链球菌属(streptococcussp.)、乳球菌属(lactococcussp.)、肠球菌属(enterococcussp.)、小球菌属(pediococcussp.)、明串珠菌属(leuconostocsp.)及魏斯氏菌属(weissellasp.)组成的组中选择的一种以上。具体地，可以是植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)、嗜酸乳酸杆菌(lactobacillusacidophilus)、两歧双歧杆菌(bifidobacteriumbifidum)、长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)、短双歧杆菌(bifidobacteriumbreve)、乳酸粪链球菌(streptococcusfaecalis)、乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)等，更具体地，包括但不特别限于韩国注册专利公报第1,178,217号中公开的植物乳杆菌cjlp243(lactobacillusplantarumcjlp243)、韩国注册专利公报第1,486,999中公开的植物乳杆菌cjlp133(lactobacillusplantarumcjlp133)、韩国注册专利公报第1,075,558号中公开的植物乳杆菌cjlp136(lactobacillusplantarumcjlp136)、韩国注册专利公报第1,255,050号中公开的植物乳杆菌cjlp55(lactobacillusplantarumcjlp55)、韩国注册专利公报第1,075,557号中公开的植物乳杆菌cjlp56(lactobacillusplantarumcjlp56)等。本申请中所称术语“防冻保护”是指为了保持乳酸菌的固有活性而进行冷冻干燥保存时保护乳酸菌组织不被冻结。本申请中所称术语“冷冻干燥(freezedrying)”是一种干燥方法，即通过急速降低容器的温度使想要干燥的材料冻结后，将容器内部的压力转换成真空，然后使材料中包含的固化溶剂直接升华为水蒸气。所述冷冻干燥作为一种最大限度地减少对热敏感物质的损伤并能够有效长期保存的方法，在防止污染、储存、运输、经济性方面比较实用。然而，所述冷冻干燥的冷冻温度可以是零下的温度，例如，可以是-40℃至-196℃(液氮沸点)、-50℃至-196℃、-70℃至-196℃，而在对乳酸菌进行冷冻干燥时，在其处理过程中，存在如下问题，即，会使乳酸菌的活性与存活率急剧降低，冷冻时会生成冰粒，同时会损伤乳酸菌细胞的膜结构。为了改善这一问题，将在冷冻干燥过程中一起添加以使在再水化过程中能够恢复乳酸菌的功能而不损伤或者杀灭乳酸菌的物质或组合物称为“防冻保护剂”或“防冻保护用组合物”，其通过赋予乳酸菌物理化学稳定性来起到提高存活率的作用。下面，将对本申请进行具体说明。本申请提供一种乳酸菌防冻保护用组合物。所述本申请的乳酸菌防冻保护用组合物包含半胱氨酸或半胱氨酸的盐作为有效成分。所述半胱氨酸作为含有带hs-ch2ch(nh2)-cooh结构的含硫α-氨基酸的一种，具有以下特征：其带有巯基(sulfhydryl)，因此与其它的半胱氨酸之间能够形成二硫键。所述半胱氨酸可以是l-半胱氨酸、d-半胱氨酸或l,d-半胱氨酸，具体地，可以是l-半胱氨酸。所述半胱氨酸的盐可以是所述半胱氨酸的任一种盐，例如，可以是盐酸盐、硫酸盐等。所述半胱氨酸或半胱氨酸的盐具有能够提高乳酸菌稳定性的作用，其不仅能够保护乳酸菌不被冻结，从而最大限度地减少冷冻引起的乳酸菌损伤或者死亡，而且即使冷冻干燥之后，也能够使乳酸菌保持其固有的活性。因此，所述半胱氨酸或半胱氨酸的盐不仅可用作乳酸菌防冻保护用组合物的有效成分，另一方面还可以用作提高干燥特别是冷冻干燥乳酸菌的稳定性的组合物的有效成分。所述半胱氨酸或半胱氨酸的盐在所述组合物总体100重量％中的含量为0.01重量％以上及/或10重量％以下，例如，可以在由从0.01重量％、0.05重量％及0.1重量％组成的组中选择的一个下限和从10重量％、7重量％、5重量％及3重量％组成的组中选择的一个上限的组合构成的含量范围内。例如，所述半胱氨酸或半胱氨酸的盐在所述组合物总体100重量％中的含量为0.05重量％至10重量％，具体地，其含量可以为0.05重量％至7重量％、0.05重量％至5重量％、0.05重量％至3重量％，或者具体地，其含量可以为0.1重量％至10重量％、0.1重量％至7重量％、0.1重量％至5重量％、0.1重量％至3重量％，且对于所述半胱氨酸或半胱氨酸的盐的含量，本领域普通技术人员可以根据乳酸菌的种类、大小、数量、冷冻干燥条件、组合物中含有的其它成分的种类或者含量等因素进行适当调整。本申请的乳酸菌防冻保护用组合物还可以包含防冻保护剂、多孔性支撑体或氮源等。所述防冻保护剂是指除了所述半胱氨酸或半胱氨酸的盐之外本申请所属
技术领域：
内常用的具有防冻保护功能的物质，可以采购使用市场上销售的产品，其种类不受特别限制。具体地，所述防冻保护剂包括糖类、氨基酸、肽类、明胶、甘油、糖醇、乳清、海藻酸、抗坏血酸、酵母提取物、脱脂乳等。例如，所述防冻保护剂可以使用糖类的一种即海藻糖(trehalose)。所述海藻糖作为在植物或者微生物等自然界广泛存在的一种含糖物，具有防冻保护剂的作用，其能够防止因冷冻干燥导致乳酸菌损伤或死亡，并且在再水化过程中有助于使其能够恢复原有功能。所述海藻糖在所述乳酸菌防冻保护用组合物总体100重量％中，其含量可以为10重量％至40重量％，例如，其含量可以为10重量％至30重量％，具体地，其含量可以为15重量％至25重量％，更具体地，其含量可以为17.5重量％至22.5重量％，但是，对于所述乳酸菌防冻保护用组合物中含有的活性成分的含量，本领域普通技术人员可以根据乳酸菌的种类、大小、数量、冷冻干燥条件、组合物中含有的其它成分的种类或者含量等因素进行适当调整。所述多孔性支撑体能够阻断外部水分及空气流入，赋予冷冻干燥的乳酸菌多孔性的特性，从而容易发生再水化作用。所述多孔性支撑体作为本申请所属
技术领域：
冷冻干燥时常用的多孔性支撑体，可以采购使用市场上销售的产品，其种类不受特别限制。具体地，所述多孔性支撑体可以是麦芽糊精、海藻酸盐、壳聚糖、淀粉、聚乙二醇、丙二醇、三醋精、乙酰柠檬酸三乙酯、柠檬酸三乙酯、甘油或其组合，更具体地，可以是麦芽糊精(maltodextrin)。所述麦芽糊精作为多孔性颗粒结构的白色粉末，是一种酸奶、调味汁、沙拉酱等普通食品中常用的食品添加剂，在乳酸菌冷冻干燥时也可以用作多孔性支撑体。所述麦芽糊精在乳酸菌防冻保护用组合物总体100重量％中的含量可以为0.1重量％至20重量％，例如，其含量可以为0.5重量％至15重量％，具体地，其含量可以为1重量％至10重量％，更具体地，其含量可以为2.5重量％至7.5重量％。所述氮源(n-source)是指一种用作乳酸菌氮能量源的物质，它具有防止后发酵引起的菌体损伤的作用。在将乳酸菌与防冻保护用组合物混合的情况下，在没有能量源的条件下存活的乳酸菌将生成有机酸，这会引起ph值下降，从而导致乳酸菌死亡。因此，氮能量源能够防止有机酸生成及由此引起的ph值下降，从而可以预防乳酸菌死亡。所述氮源作为在本申请所属
技术领域：
冷冻干燥时常用的氮源，可以采购使用市场上销售的产品，其种类不受特别限制。具体地，所述氮源包括脱脂奶粉、乳清蛋白、酵母提取物、麦芽提取物、牛肉提取物、酪蛋白水解物、麦芽提取物、胰蛋白胨、半胱氨酸、蛋白胨等，例如，所述蛋白胨可以是大豆蛋白胨、鱼蛋白胨、蛋白胨、酪蛋白胨、蛋白胨no.3等，具有代表性的可以是大豆蛋白胨。所述大豆蛋白胨在乳酸菌防冻保护用组合物总体100重量％中的含量为0.1重量％至20重量％，例如，其含量可以为0.5重量％至15重量％，具体地，其含量可以为1重量％至10重量％，更具体地，其含量可以为2.5重量％至7.5重量％。所述乳酸菌防冻保护用组合物可以采用涂层剂形态。即，所述乳酸菌防冻保护用组合物可以与乳酸菌与混合涂布在乳酸菌的表面，由此可以保护乳酸菌免受外部环境的影响，提高保存稳定性，但是并非特别限定于此。接下来，将介绍利用所述乳酸菌防冻保护用组合物制造的乳酸菌制剂。本申请提供一种乳酸菌防冻保护用培养基。在一方面，本申请的培养基可以是用于促进乳酸菌生长的培养基。在一方面，本申请的培养基可以是用于提升乳酸菌的热稳定性的培养基。在一方面，所述乳酸菌防冻保护用培养基可以是用于促进乳酸菌生长及提升热稳定性的培养基。所述培养基是指为培养乳酸菌所需营养物质的混合物，其供应以乳酸菌的生存及生长必不可少的物质为主的营养物质及生长因子等。本申请的培养基包含半胱氨酸或半胱氨酸的盐作为有效成分。所述半胱氨酸作为具有hs-ch2ch(nh2)-cooh结构的含硫α-氨基酸的一种，具有以下特征：其带有巯基(sulfhydryl)，因此与其它的半胱氨酸之间能够形成二硫键。所述半胱氨酸可以是l-半胱氨酸、d-半胱氨酸或l,d-半胱氨酸，具体地，可以是l-半胱氨酸。所述半胱氨酸的盐可以是所述半胱氨酸的任一种盐，例如，可以是盐酸盐、硫酸盐等。所述半胱氨酸或半胱氨酸的盐具有能够提升乳酸菌稳定性的作用，不仅能够保护乳酸菌不被冻结，从而最大限度地减少冷冻引起的乳酸菌损伤或者死亡，而且即使冷冻干燥之后，也能够使乳酸菌保持其固有的活性。另外，所述半胱氨酸或半胱氨酸的盐具有能够提高乳酸菌稳定性的作用，不仅在培养乳酸菌时能够大幅增加乳酸菌的产量，而且能够使这种方式培养的乳酸菌保持其固有的活性。因此，所述半胱氨酸或半胱氨酸的盐不仅可用作乳酸菌防冻保护用培养基的有效成分，另一方面还可以用作提高干燥特别是冷冻干燥乳酸菌的稳定性的培养基、促进乳酸菌的生长的培养基和提升在这种培养基中培养的乳酸菌稳定性的组合物以及提升乳酸菌热稳定性的培养基的有效成分。所述半胱氨酸或半胱氨酸的盐在所述培养基总体100重量％中的含量为0.05重量％至10重量％，具体地，其含量可以为0.05重量％至7重量％、0.05重量％至5重量％、0.05重量％至3重量％，或者具体地，其含量可以为0.1重量％至10重量％、0.1重量％至7重量％、0.1重量％至5重量％、0.1重量％至3重量％。对于所述半胱氨酸或半胱氨酸的盐的含量，本领域普通技术人员可以根据乳酸菌的种类、大小、数量、冷冻干燥条件、培养基中含有的其它成分的种类或者含量等因素进行适当调整。本申请的培养基除了上述有效成分之外，通常还可以包括培养基中含有的营养成分，例如，还可以包括碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸及/或维生素等。所述碳源可以包括诸如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨糖醇等碳水化合物；诸如丙酮酸、乳酸、柠檬酸等有机酸；诸如谷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸等氨基酸等。另外，可以使用淀粉水解物、糖蜜、黑带糖蜜、米糠、木薯、甘蔗渣及玉米浆等天然有机营养源，具体地，可以使用诸如葡萄糖及经过杀菌的预处理糖蜜(即，转化成还原糖的糖蜜)等碳水化合物。且可以使用适量的其它多种碳源而不受特别限制。这些碳源既可以单独使用，也可以将2种以上组合使用，但不限于此。所述氮源可以使用诸如氨气、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等无机氮源；诸如谷氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺等氨基酸、蛋白胨、nz-胺、肉类提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼类或其分解产物、脱脂大豆糕或其分解产物等有机氮源。这些氮源既可以单独使用，也可以将2种以上组合使用，但不限于此。所述磷源包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或与之对应的含钠盐等。无机化合物可以使用氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等，此外，还可以包括氨基酸、维生素及/或适当的前体等。这些构成成分或前体可以分批式或连续式添加到培养基中，但不限于此。另外，所述培养基可以通过添加诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨气、磷酸、硫酸等化合物来调整培养基的ph值，且可以通过使用诸如脂肪酸聚乙二醇酯等消泡剂来抑制培养过程中生成气泡。另外，为了保持培养过程中的需氧状态，可以向培养基内注入氧气或含氧气体，或者为了保持厌氧及微需氧状态，可以不注入任何气体或者可以注入氮气、氢气或二氧化碳气体，但不限于此。本申请的用意促进乳酸菌生长的培养基还可以包含乳酸菌促生长辅助剂，所述乳酸菌促生长辅助剂作为除了所述半胱氨酸或其盐之外的其它促进乳酸菌生长的有效成分，其可以与所述半胱氨酸或其盐同时包含在其中，从而能够使促进乳酸菌生长的效果及/或改善乳酸菌稳定性的效果更加优秀。具体地，所述乳酸菌促生长辅助剂包含从由辅酶q10、维生素c、维生素e及维生素b2组成的组中选择的至少一种，所述乳酸菌促生长辅助剂并非仅限于此，例如，在所述培养基总体100重量％中其含量可以为0.01重量％至30重量％，例如，其含量可以为0.1至25重量％、0.1至20重量％、0.1至15重量％、1至10重量％。更具体地，所述半胱氨酸或其盐及所述乳酸菌促生长辅助剂的混合重量比为1:3至3:1，例如，其混合重量比可以为1:2至2:1、1:1.5至1.5:1或1:1。所述培养基可以为固态或液态。接下来，将介绍利用所述培养基制造的乳酸菌制剂。本申请提供一种乳酸菌制剂的制造方法，具体地,提供一种具有热稳定性的乳酸菌制剂的制造方法。本申请的乳酸菌制剂制造方法，包括：通过将乳酸菌与含有半胱氨酸或半胱氨酸的盐的组合物混合来制备混合物，以及将所述混合物经过冷冻干燥进行粉末化。在一方面，含有所述半胱氨酸或半胱氨酸的盐的组合物可以使用本申请的乳酸菌防冻保护用组合物。在另一方面，含有所述半胱氨酸或半胱氨酸的盐的组合物可以使用本申请的培养基，例如，可以使用乳酸菌防冻保护用培养基。下面，将对本申请的乳酸菌制剂制造方法进行说明。首先，将乳酸菌与含有半胱氨酸或半胱氨酸的盐的组合物(例如，所述乳酸菌防冻保护用组合物)混合。所述乳酸菌与所述乳酸菌防冻保护用组合物按照重量标准可以以1:0.1至1:5的比例，具体地，可以以1:0.5至1:4的比例，更具体地，可以以1:1至1:3的比例混合。所述混合比例能够有效保护乳酸菌不被冻结，并且能够有效地进行粉末化。对于所述乳酸菌与所述乳酸菌防冻保护用组合物的混合时机，具体地，对于乳酸菌的培养步骤中投放半胱氨酸或半胱氨酸的盐的时机，可以在乳酸菌制剂制造方法的整个工序中的乳酸菌的培养步骤任何一个环节都可以投放，对此没有限制，例如，可以在培养乳酸菌之前、乳酸菌的生长诱导期(lagphase)、指数生长期(exponentialphase)及停滞期(stationaryphase)中至少任意一个步骤投放。例如，在与所述乳酸菌防冻保护用组合物混合之前，可以使用常规装置与方法充分培养所述乳酸菌，然后再通过常规方法进行回收。所述培养是指使所述乳酸菌在适当调整的环境条件下生长。所述培养过程可以根据本申请所属
技术领域：
公知的适当培养基与培养条件来进行。对于这种培养过程，本领域普通技术人员可以根据选择的菌株适当调整。例如，所述乳酸菌可以以分批式、连续式、流加式等形态进行培养。所述乳酸菌的培养温度可以为20℃至50℃，具体地，培养温度可以为30℃至40℃的温度。所述乳酸菌的培养时间可以为1小时至100小时，具体地，可以培养5小时至50小时。在对所述乳酸菌的菌体进行回收的步骤中，可以根据所述乳酸菌的培养形态利用本申请所属
技术领域：
公知的适当方法从培养基中回收目标菌体。例如，可以将离心分离、过滤、利用结晶蛋白沉淀剂进行处理(盐析法)、萃取、超声波粉碎、超滤、透析法、分子筛色谱法(凝胶过滤)、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等各种色谱法、hplc及其方法进行组合使用。所述回收步骤可以包含额外的提炼工序，并且可以利用本申请所属
技术领域：
公知的适当方法将回收的乳酸菌的菌体进一步提炼。然后，将乳酸菌与乳酸菌防冻保护用组合物的混合物经过冷冻干燥进行粉末化。将所述乳酸菌与乳酸菌防冻保护用组合物的混合物进行粉末化的过程可以通过现有食品领域常规的冷冻干燥完成。所述冷冻干燥可以在-70℃至30℃，具体地，可以在-70℃至-40℃的温度条件下完成。所述冷冻干燥可以通过以下过程完成，即在冷却3小时至48小时，具体地，冷却6小时至36小时，更具体地，冷却12小时至24小时的条件下进行冷冻之后，在冷冻干燥器中进行解冻除去水分。如上所述，将乳酸菌与本申请的乳酸菌防冻保护用组合物混合后，经过冷冻干燥进行粉末化，由此可以制造出稳定性提升且最大限度保持乳酸菌活性的乳酸菌制剂。在一方面，所述乳酸菌制剂的制造方法，还可以包括以下步骤：通过将乳酸菌与所述乳酸菌防冻保护用组合物混合来制备混合物，并且在将所述混合物进行冷冻干燥之前利用混合物对乳酸菌的菌体进行培养。所述本申请的乳酸菌制剂制造方法，可以包括以下步骤：将乳酸菌与所述乳酸菌防冻保护用组合物混合，利用该混合物培养乳酸菌的菌体，将培养的乳酸菌的菌体回收，以及将回收的乳酸菌的菌体进行粉末化。所述培养是指使所述乳酸菌在适当调整的环境条件下生长。所述培养过程可以在本申请所属
技术领域：
公知的适当培养条件下完成。对于该培养过程，本领域普通技术人员可以根据选择的菌株进行适当调整。例如，所述乳酸菌可以按照分批式、连续式、流加式等形态在20℃至50℃，具体地，在30℃至40℃的温度条件下进行培养。培养时间可以为1小时至100小时，具体地，可以培养5小时至50小时。然后，将培养的乳酸菌的菌体进行回收。在对所述乳酸菌的菌体进行回收的步骤中，可以根据所述乳酸菌的培养形态利用本申请所属
技术领域：
公知的适当方法从培养基中回收目标菌体。例如，可以将离心分离、过滤、利用结晶蛋白沉淀剂进行处理(盐析法)、萃取、超声波粉碎、超滤、透析法、分子筛色谱法(凝胶过滤)、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等各种色谱法、hplc及其方法进行组合使用。所述回收步骤可以包含额外的提炼工序，并且可以利用本申请所属
技术领域：
公知的适当方法将回收的乳酸菌的菌体进一步提炼。所述回收的乳酸菌的菌体可以在没有半胱氨酸或半胱氨酸的盐的情况下与含有防冻保护剂、多孔性支撑体或氮源等的组合物混合。对于所述防冻保护剂、多孔性支撑体及氮源的说明与以上针对乳酸菌防冻保护用组合物说明的内容相同。最后，将所述回收的乳酸菌的菌体进行粉末化。将所述回收的乳酸菌的菌体进行粉末化的过程可以通过现有食品领域中常规的制粉方法完成，例如，可以通过将所述回收的乳酸菌的菌体经过冷冻干燥来完成。所述冷冻干燥可以通过以下过程完成，即可以在-70℃至30℃，具体地，在-70℃至-40℃的温度环境下冷却3小时至48小时，具体地，冷却6小时至36小时，更具体地，在冷却12小时至24小时的条件下进行冷冻之后，在冷冻干燥器中进行解冻除去水分。如上所述，将乳酸菌在与乳酸菌防冻保护用组合物的混合物中进行培养并将从中回收的乳酸菌的菌体粉末化，由此可以制造出稳定性提高且最大限度保持乳酸菌活性的乳酸菌制剂。在所述乳酸菌制剂的制造方法中，含有半胱氨酸或半胱氨酸的盐的组合物是一种含有半胱氨酸或半胱氨酸的盐的培养基，例如，在利用所述乳酸菌防冻保护用培养基的情况下，对于上述制造方法来说，就是一种利用“乳酸菌防冻保护用组合物”的制造方法，具体情况如上所述。下面，将对根据本申请的乳酸菌制剂的制造方法制造的乳酸菌制剂的稳定性进行说明。本申请的另一方面提供一种促进乳酸菌生长的方法、对乳酸菌的能量代谢进行调节的方法以及提升乳酸菌热稳定性的方法。本申请的促进乳酸菌生长的方法、对乳酸菌的能量代谢进行调节的方法以及提升乳酸菌热稳定性的方法，包括以下步骤：将乳酸菌在所述培养基，例如，在本申请的用于促进乳酸菌生长的培养基中进行培养及/或与所述乳酸菌防冻保护用组合物混合，并在该混合物中进行培养。具体的方法可以采用与所述乳酸菌制剂的制造方法相同的方法执行。在这种情况下，在包含半胱氨酸或半胱氨酸的盐的培养基，例如，在用于促进乳酸菌生长的培养基中及/或利用乳酸菌防冻保护用组合物培养的所述乳酸菌可以通过“呼吸”产生能量进行生长，但其能量产生机制并非仅限于此。通常，为了培养兼性厌氧性乳酸菌，将培养条件变更为最大限度减少氧气暴露的条件，例如，变更为兼性厌氧性条件，例如，可以进行发酵槽的氧/氮置换等，但是在利用含有本申请半胱氨酸或半胱氨酸的盐的培养基的情况下，可以在不变更其它培养条件的情况下，通过所述培养基赋予乳酸菌能够清除活性氧的环境，从而能够良好地促进乳酸菌生长。另外，向培养槽内适当地注入空气，例如，注入灭菌空气，可以调节乳酸菌的促生长作用。根据本申请经过促生长的乳酸菌能够获得提升的稳定性，从而可以使乳酸菌的数量长期保持在较高水平。下面，将对根据本申请的乳酸菌制剂制造方法制造的乳酸菌制剂的稳定性进行说明。本申请提供一种乳酸菌制剂，具体地，提供一种具有热稳定性的乳酸菌制剂。本申请的所述乳酸菌制剂包含乳酸菌及半胱氨酸或半胱氨酸的盐。所述半胱氨酸作为具有hs-ch2ch(nh2)-cooh结构的含硫α-氨基酸的一种，具有以下特征：其带有巯基(sulfhydryl)，因此与其它的半胱氨酸之间能够形成二硫键。所述半胱氨酸可以是l-半胱氨酸、d-半胱氨酸或l,d-半胱氨酸，具体地，可以是l-半胱氨酸。所述半胱氨酸的盐可以是所述半胱氨酸的任一种盐，具体地，可以是盐酸盐、硫酸盐等。所述乳酸菌制剂可以是颗粒、粉末、散剂、颗粒剂、浸剂、乳剂、流变剂、锭剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、软膏、栓剂、注射液、吸入剂、气雾剂、混悬剂、糖浆剂、乳液、软质胶囊、硬质胶囊、酏剂(elixirs)、片剂(troches)、糖锭(lozenge)等形态，具体地，可以是冷冻干燥的粉末形态。利用所述半胱氨酸或半胱氨酸的盐能够保护乳酸菌不被冻结，从而不仅能够最大限度地减少乳酸菌的损伤或者死亡，而且即使制成粉末形态之后，也能够使乳酸菌保持其固有的活性。例如，本申请的所述乳酸菌制剂在40℃条件下保存4周后，与保存初期相比，乳酸菌的存活率能够达到45％以上，具体地，能够达到50％以上、50.5％以上、51％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上或77％以上。在一方面，在40℃条件下保存3周后，与保存初期相比，乳酸菌的存活率能够达到45％以上，具体地，能够达到50％以上、51％以上、52％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上或81％以上。在一方面，在40℃条件下保存2周后，与保存初期相比，乳酸菌的存活率能够达到55％以上，具体地，能够达到60％以上、62％以上、64％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上或91％以上。所述保存初期可以是保存第0天或临保存前时刻。另外，在利用所述半胱氨酸或半胱氨酸的盐对乳酸菌进行培养时能够促进乳酸菌的生长。例如，将所述乳酸菌在半胱氨酸或半胱氨酸的盐存在的条件下在37℃环境下进行培养，当将培养液稀释20倍时，利用光谱仪测定的o.d(光密度；opticaldensity)值在7小时后能够达到0.5以上，具体地，能够达到0.7以上、0.9以上、1.0以上或1.2以上。在一方面，8小时以后，上述值能够达到0.6以上、0.8以上、1.0以上、1.2以或1.3以上。在一方面，9小时以后，上述值能够达到0.7以上、0.8以上、0.9以上、1.0以上、1.2以上、1.3以上或1.4以上。在一方面，10小时以后，上述值能够达到0.8以上、1.0以上、1.2以上、1.4以上或1.5以上。在一方面，11小时以后，上述值能够达到1.0以上、1.1以上、1.2以上、1.3以上、1.4以上或1.5以上。例如，将所述乳酸菌在半胱氨酸或半胱氨酸的盐存在的条件下在37℃环境下进行培养时，活细胞计数(cfu/ml)在7小时后其值能够达到1.5x10^9以上、2.0x10^9以上、2.5x10^9以上、3.0x10^9以上、3.5x10^9以上、4.0x10^9以上、5.0x10^9以上或5.5x10^9以上。在一方面，8小时后其值能够达到2.5x10^9以上、3.0x10^9以上、3.5x10^9以上、4.0x10^9以上、5.0x10^9以上、5.5x10^9以上、6.0x10^9以上、6.5x10^9以上、7.0x10^9以上、7.5x10^9以上、8.0x10^9以上、8.5x10^9以上或9.0x10^9以上。在一方面，9小时后其值能够达到3.0x10^9以上、5.0x10^9以上、7.0x10^9以上、9.0x10^9以上或9.5x10^9以上。在一方面，10小时后其值能够达到4.0x10^9以上、5.0x10^9以上、7.0x10^9以上、9.0x10^9以上、9.5x10^9以上、1.0x10^10以上或1.2x10^10以上。在一方面，11小时后其值能够达到5.0x10^9以上、7.0x10^9以上、9.0x10^9以上、9.5x10^9以上、1.0x10^10以上或1.2x10^10以上，但并非仅限于此。下面，将根据实施例对本申请进行详细说明。但是，下述实施例只是为了对本申请进行具体示例说明，本申请的内容并非仅限于以下实施例。[实施例1]将植物乳杆菌cjlp133菌株利用mrs液体培养基(difco,usa)在37℃条件下培养18至24小时后，再利用离心机分离上清液，只回收乳酸菌。将所述回收的乳酸菌的菌体与根据下述表1所示含量将半胱氨酸盐酸盐、海藻糖、麦芽糊精、大豆蛋白胨及水经过混合及灭菌处理制造的乳酸菌防冻保护用组合物按照1:2的重量比进行混合。[表1]将所述混合物混悬后，转移盛放到冷冻干燥托盘中，在速冻条件(-40℃以下)下放置12至24小时左右，然后，在冷冻干燥器中进行解冻，去除水分，从而获得用所述表1中的组合物涂布的乳酸菌粉末。[实施例2]利用含有0.1重量％半胱氨酸盐酸盐的mrs液体培养基(difco,usa)，将韩国注册专利公报第1,486,999号中公开的植物乳杆菌cjlp133菌株在37℃条件下培养18至24小时后，再利用离心机分离上清液，只回收乳酸菌。将所述回收的乳酸菌的菌体与根据下述表2所示含量将海藻糖、麦芽糊精、大豆蛋白胨及水经过混合及灭菌处理制造的乳酸菌防冻保护用组合物按照1:2的重量比混合。[表2]成分含量(重量％)海藻糖20麦芽糊精5大豆蛋白胨5水剩余部分总计100将所述混合物混悬后，转移盛放到冷冻干燥托盘中，在速冻条件(-40℃以下)下放置12至24小时左右，然后，在冷冻干燥器中进行解冻，去除水分，从而获得用所述表2中的组合物涂布的乳酸菌粉末。[实施例3]将植物乳杆菌cjlp133菌株放入含有0.1％半胱氨酸盐酸盐的mrs液体培养基(difco,usa)中在37℃条件下培养11小时。含有半胱氨酸盐酸盐的mrs培养基成分如表3所示，在培养过程中下降的ph值通过氨水自动供给系统进行设定，使得将ph值中和至5.95。[表3][比较例1]将植物乳杆菌cjlp133菌株利用mrs液体培养基(difco,usa)在37℃条件下培养18至24小时后，再利用离心机分离上清液，只回收乳酸菌。将所述回收的乳酸菌的菌体与根据所述表2所示含量将海藻糖、麦芽糊精、大豆蛋白胨及水经过混合及灭菌处理制造的乳酸菌防冻保护用组合物按照1:2的重量比进行混合。使所述混合物混悬后，转移盛放到冷冻干燥托盘中，在速冻条件(-40℃以下)下放置12至24小时左右，然后，在冷冻干燥器中进行解冻，去除水分，从而获得用所述表2中的组合物涂布的乳酸菌粉末。[比较例2]将植物乳杆菌cjlp133菌株放入不含0.1％半胱氨酸盐酸盐的mrs液体培养基(difco,usa)中在37℃条件下培养11小时。mrs培养基成分如表4所示，在培养过程中下降的ph值通过氨水自动供给系统进行设定，使得将ph值中和至5.95。[表4][实验例1]根据有无半胱氨酸盐酸盐评价乳酸菌粉末的高温稳定性为了对使用半胱氨酸盐酸盐的乳酸菌粉末的高温稳定性进行评价，对所述实施例1-1、实施例2及比较例1所示严格条件下的存活率进行了分析。经过冷冻干燥处理的乳酸菌粉末随着存储温度及存储时间的变化其活性逐渐降低。通过，对活性产生影响的因素包括温度、氧气、水分等。经过冷冻干燥处理的乳酸菌粉末的吸湿性非常强，在存储初期环境中的水分含量就大幅减少。为了提高流通过程中的耐储性，可以采用在包装材料中使用脱氧剂或者用于除湿的多种方法，但是最终根据乳酸菌粉末本身稳定性程度不同，存储时间会呈现出很大的差异。因此，为了缓解原料特性引起的吸湿性，将样品分别用铝袋单独包装进行保存，在40℃条件下保存4周后，对严格条件下的存活率进行了分析。具体地，将所述实施例1-1、实施例2及比较例1中制造的乳酸菌粉末样品取一定量装入铝袋包装内单独包装并进行密封，然后将样品分别放入40℃的恒温箱(incubator)中保存4周。经过规定的时间之后，将实验组样品放入食盐缓冲液(salinebuffer)中按照1:100的倍率进行稀释，装入无菌袋内后进行均质化处理。将用食盐缓冲液连续稀释的样品涂抹在mrs琼脂平板(agarplate)上。接着，回收平板，并在37℃的有氧条件下静置培养24小时后进行计数，其结果如表5所示。在下述表5中记载的数字表示与初期乳酸菌对比的存活率(％)。[表5]适用严格条件随着时间的推移对乳酸菌的活性进行了测定，结果表明，在利用含有半胱氨酸盐酸盐的防冻保护用组合物的实施例1-1或者利用含有半胱氨酸盐酸盐的培养基的实施例2的情况下，与不含半胱氨酸盐酸盐的比较例1相比，乳酸菌的存活率要高出很多。[实验例2]根据半胱氨酸盐酸盐的含量评价乳酸菌粉末的高温稳定性为了根据使用半胱氨酸盐酸盐的乳酸菌粉末的半胱氨酸盐酸盐含量对高温稳定性进行评价，对实施例1-1至实施例1-4中制造的乳酸菌粉末在严格条件下的存活率进行了分析。按照与所述实验例1相同的方法适用严格条件随着时间的推移对乳酸菌的活性进行了测定，其结果如表6所示。下述表6中记载的数字也表示与初期乳酸菌对比的存活率(％)。[表6][实验例3]根据乳酸菌的培养基内有无半胱氨酸盐酸盐评价高浓度培养(o.d.值)乳酸菌培养根据《食品添加剂公典》中规定的o.d.值(光密度；opticaldensity)测定法利用光谱仪(spectrophotometer,nanophotometer,implen)在600nm处将乳酸菌培养液稀释20倍进行测定。[表7]从上述表7中可以确认，在含有半胱氨酸盐酸盐的培养基中培养的实施例3相比于在不含半胱氨酸盐酸盐的培养基中培养的比较例2，乳酸菌的培养速度显著升高。通过这一结果可以确认，半胱氨酸盐酸盐促进乳酸菌生长的能力非常优秀。[实验例4]根据乳酸菌的培养基内有无半胱氨酸盐酸盐评价高浓度培养(活细胞计数测定)将乳酸菌培养液用灭菌生理盐水稀释后涂抹在mrs寒天平板培养基上，使得形成30至300个菌落，然后在37℃条件下培养24小时。对培养后出现的菌落数进行清点，按照每ml活细胞计数进行计算。[表8]cfu/ml比较例2实施例30小时007小时1.2x10^95.9x10^98小时2.0x10^99.2x10^99小时2.8x10^91.0x10^1010小时3.3x10^91.2x10^1011小时4.2x10^91.2x10^10从上表中可以确认，在含有半胱氨酸盐酸盐的培养基中培养的实施例1相比于在不含半胱氨酸盐酸盐的培养基中培养的比较例1，乳酸菌的活细胞计数显著升高。通过这一结果可以确认，半胱氨酸盐酸盐促进乳酸菌生长的能力非常优秀。以上对本申请的理想实施例进行了举例说明，但是本申请的范围并非仅限于上述特定实施例，本领域普通技术人员在本申请的权利要求书中记载的范畴内可以进行适当变更。当前第1页12