一种杀虫蛋白及其核酸、制备方法和应用与流程

文档序号：20874485发布日期：2020-05-26 16:17阅读：305来源：国知局

本发明为于2016年9月21日提交的发明名称为一种杀虫蛋白及其核酸、制备方法和应用，申请号为201610836625.0的专利申请的分案。

本发明涉及杀虫蛋白领域。

背景技术：

鞘翅目害虫在我国农业生产中的危害逐年加重，且造成了严重的经济损失，因此，急需发掘更多的对鞘翅目害虫具有毒杀作用的菌株及基因。目前，从苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis)中发现了一些的cry蛋白对鞘翅目害虫具有杀虫活性。然而，为了丰富生物防治的种类，特别是蛋白对鞘翅目害虫防治的种类，以期获得具有不同杀虫机理的生物防治材料，来应对因长期使用某单一药剂可能产生的抗药性。因此，仍然有必要寻找新的具有优良活性的新型杀虫蛋白。

技术实现要素：

本发明之一提供了一种不同于现有技术的新型的杀虫蛋白，其氨基酸序列为如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示的至少一种。根据本发明的发现，这些蛋白质具有一致的杀虫谱，例如它们均对大猿叶甲、小猿叶甲、黄曲条跳甲、榆蓝叶甲和马铃薯甲虫等鞘翅目害虫具有良好的杀虫活性，特别是氨基酸序列如seqidno.4所示的蛋白的杀虫效果尤为突出。

在一个具体实施方式中，所述杀虫蛋白为氨基酸序列如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示的至少一种的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且与氨基酸序列如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示的蛋白中的至少一种具有相同功能的蛋白。

发明人在研究过程中，对其中对鞘翅目害虫杀虫活性突出的蛋白(如seqidno.4所示)进行了一系列的截短，以期提高该序列的活性。最后，经实验证实，氨基酸序列如seqidno.7所示的截短蛋白获得了较野生型序列(如seqidno.4所示)更优的杀虫效果。因此，在一个优选的具体实施方式中，所述杀虫蛋白的氨基酸序列如seqidno.7所示。

本发明之二提供了一种能够翻译为本发明之一的杀虫蛋白的核酸。

在一个具体实施方式中，能够翻译为如seqidno.1所示的氨基酸序列的核酸的序列如seqidno.8所示，能够翻译为如seqidno.2所示的氨基酸序列的核酸的序列如seqidno.9所示，能够翻译为如seqidno.3所示的氨基酸序列的核酸的序列如seqidno.10所示，能够翻译为如seqidno.4所示的氨基酸序列的核酸的序列如seqidno.11所示，能够翻译为如seqidno.5所示的氨基酸序列的核酸的序列如seqidno.12所示，能够翻译为如seqidno.6所示的氨基酸序列的核酸的序列如seqidno.13所示，能够翻译为如seqidno.7所示的氨基酸序列的核酸的序列如seqidno.14所示。

本发明之三提供了一种制备杀虫晶体蛋白的方法，其包括如下步骤：在活体生物中表达本发明之一的杀虫蛋白；特别是在含有本发明之二的核酸的活体生物中表达本发明之一的杀虫蛋白。本领域的技术人员熟知每一个三联体密码相对应于一种氨基酸编码，而一种氨基酸则有可能相对应于多个三联体密码，因此，在氨基酸序列一定的情况下，可以存在与其对应的多种dna序列。

在一个具体实施方式中，所述活体生物在16-20℃下表达所述杀虫蛋白。

在一个具体实施方式中，所述活体生物为微生物，进一步地，所述微生物为野生微生物和/或遗传工程微生物。

在一个具体实施方式中，所述活体生物为芽胞杆菌(bacillus)、假单胞菌(pseudomonas)、肠杆菌(escherichia)和酵母(saccharomyces)中的至少一种。

在一个优选的具体实施方式中，所述芽胞杆菌为苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis)、枯草芽胞杆菌(bacilllussubtilis)、萎缩芽胞杆菌(bacillusatrophaeus)和蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)中的至少一种；所述假单胞菌包括荧光假单胞杆菌(pseudomonasfluorescens)；所述肠杆菌包括大肠杆菌(escherichiacoli)。

在一个具体实施方式中，在所述活体生物中表达所述杀虫蛋白后，还包括从所述活体生物中纯化所述杀虫蛋白的步骤。其中纯化的方式可通过本领域技术人员所知晓的常规方法实现。

本发明之四提供了本发明之一的杀虫蛋白在防治有害生物中的应用。

在一个具体实施方式中，本发明之四中所述有害生物为昆虫中的至少一种。

在一个具体实施方式中，本发明之四中所述有害生物为鞘翅目昆虫中的至少一种。

在一个具体实施方式中，本发明之四中所述有害生物为大猿叶甲(colaphellusbowringiibaly)、小猿叶甲(phaedonbrassicaebaly)、黄曲条跳甲(phyllotretastriolata)、榆蓝叶甲(pyrrhaltaaenescens)和马铃薯甲虫(leplinotarsadecernlineata)中的至少一种。

本发明之五提供了本发明之二的核酸在构建防治有害生物的转基因植物中的应用。通过构建所述转基因植物，本发明之一的杀虫蛋白能够在所述转基因植物中表达，或者进一步地在所述转基因植物中的特定组织中表达，在有害生物为害该转基因植物时，由于食用表达所述杀虫蛋白的植株，而被毒杀或者被抑制生长，从而达到防治有害生物的目的。

在一个具体实施方式中，为核酸在构建防治鞘翅目昆虫中的至少一种的转基因植物中的应用。

在一个具体实施方式中，为核酸在构建防治大猿叶甲(colaphellusbowringiibaly)、小猿叶甲(phaedonbrassicaebaly)、黄曲条跳甲(phyllotretastriolata)、榆蓝叶甲(pyrrhaltaaenescens)和马铃薯甲虫(leplinotarsadecernlineata)中的至少一种的转基因植物中的应用。

附图说明

图1为在可溶组分(上清)中目标基因表达产物的sds-page分析。其中，lm：低分子量蛋白参照；1：rosetta-pet21b(阴性对照)；2：rosettaip1；3：rosetta-ip1；4：rosetta-ip1；5：rosetta-ip1；6：rosetta-ip1；7：rosetta-ip1。

图2为不可溶组分(沉淀)中目标基因表达产物的sds-page分析。其中，lm：低分子量蛋白参照；1：rosetta-pet21b(阴性对照)；2：rosettaip1；3：rosetta-ip1；4：rosetta-ip1；5：rosetta-ip1；6：rosetta-ip1；7：rosetta-ip1。

图3为截短基因表达情况的sds-page分析。其中，lm：低分子量蛋白参照；1：rosetta-pet21b可溶组分(阴性对照)；2：rosetta-ip4s的可溶组分；6：rosetta-ip4s的不可溶组分。忽略其他泳道的蛋白条带。

具体实施方式

以下通过优选的实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不构成对本发明的限制。

1)液体lb：胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，nacl1％，ph7.0，15磅灭菌15min。用于培养大肠杆菌。

2)固体lb：在液体lb培养基中加1.3％琼脂，15磅灭菌15min。用于培养大肠杆菌。

3)抗生素：氨苄青霉素水溶液100mg/ml，用时稀释500倍-20℃保存。其中peb质粒载体具有氨苄青霉素抗性。

蛋白电泳检测及定量分析

将诱导表达的大肠杆菌菌体经过常规的超声波处理之后分离为上清和沉淀两部分，并根据实际需要，分别对上清样品和沉淀样品或者单独的上清样品或沉淀样品进行蛋白电泳。其中目标蛋白可能含有以可溶形式(存在于超声破碎后的样品的上清中)和/或不溶形式(存在于超声破碎后的样品的沉淀中)被表达。因此，需要指出的是上清样品指的是经过超声波处理后离心得到的液体；而沉淀样品指的是经过超声波处理后离心的沉淀部分用缓冲液(例如tris缓冲液)悬浮后的样品，该沉淀部分中含有的蛋白在经过重悬、煮沸等一系列处理后，也可以成为可溶样品，从而可以将其用于蛋白电泳分析。

蛋白检测分析：

120v预电泳约10-20min，取样品40μl，加入10μl5×加样缓冲液，混匀，煮沸5-10min，12000rpm离心5min以去除不溶成分，取10μl样品上样。80v恒压电泳至样品浓缩呈直线，150v恒压电泳至指示的溴酚蓝到达凝胶底部。脱色：电泳后取出凝胶，电泳后取出凝胶并用蒸馏水冲洗，加入50ml溶液i(50％乙醇，10％乙酸，40％超纯水)，微波炉中加热30s，60rpm振荡10min。

染色：倒掉溶液i后加入含有溶液iii(0.25％r250的95％乙醇溶液)的溶液ii(7.5％乙酸，5％乙醇，87.5％超纯水)(每50ml溶液ii加200μl溶液iii)微波炉加热30s，60rpm振荡15min以上。倒掉溶液ii，加入无菌水，凝胶成像系统照相保存。

观察结果，根据蛋白条带着色程度比较目的蛋白表达情况，用凝胶成像系统照相保存。

蛋白定量分析：

制备以下5种不同浓度梯度的bsa：0.8μg/μl、0.4μg/μl、0.2μg/μl、0.1μg/μl、0.05μg/μl，同时分别将目标蛋白进行梯度稀释，使其终浓度介于0.8-0.05μg/μl，目标蛋白和5种不同浓度的bsa上样量均为10μl，进行蛋白电泳定量分析。其中sds聚丙烯酰氨凝胶为8％的分离胶和4％的浓缩胶。

1.ip1(seqidno.8)、ip2(seqidno.9)、ip3(seqidno.10)、ip4(seqidno.11)、ip5(seqidno.12)和ip6(seqidno.13)基因的克隆

1.1引物：

设计了三对引物，分别为：ip-af(seqidno.15)：gatggatggtttttagctagattctggat，ip-ar(seqidno.16)：gctctataatatggattagctccat；ip-bf(seqidno.17)：acgcgtcgacatgaaatacaagttttcaaaagtc，ip-br(seqidno.18)：ccgctcgaggattttattttattaatttccact；ip-cf(seqidno.19)：acgcgtcgacatgaaaaatagattttcaaaagtg，ip-cr(seqidno.20)：ccgctcgagctacaatttaaagttttcacttaat。其中引物序列中加横线的部分为引入的酶切位点，即sali酶切位点：gtcgac，以及xhoi酶切位点：ctcgag。

1.2对实验室已保存的255株标准菌株进行基因组提取：

(1)将新鲜的单株菌种样品接种到lb固体培养基上，在30℃恒温箱中培养至菌体裂解80％以上；

(2)刮取固体培养基上的菌体至1.5mlep管中，加入si溶液(1mmol/ledta，10mmol/ltris-hcl，1mol/l蔗糖，1μlrnase溶液，ph7.0)150μl和100mg石英砂，组织破碎仪上震荡1min；

(3)加入sii溶液(4％sds)200μl，充分混匀；

(4)加入siii溶液(1mol/lnaac，5mol/l异硫氰酸胍，ph4.8)400μl，充分混匀，12000g，离心10min；

(5)取上清液加入等体积异丙醇，-20℃静置20min；

(6)12000g，离心10min，弃上清，70％乙醇清洗沉淀，晾干后加入100μl超纯水或te缓冲液溶解；

(7)取少量(例如5-20μl或100-500ng)利用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测提取的bt基因组的质量和浓度，其余部分-20℃保存备用。

1.3基因检测、克隆和表达

利用引物对ip-af和ip-ar，分别以根据1.1.2的方法提取的本实验室保存的255株标准菌株(部分菌株来源于美国的芽胞杆菌遗传资源中心，bacillusgeneticstockcenter，简称bgsc)基因组为模板进行常规的pcr检测。

将检测到的pcr产物进行基因序列测定。利用vectornti软件对测序结果进行聚类比对分析；然后根据聚类分析结果，选取标准菌株bgscno.4a4、bgscno.4a5、bgscno.6a25、bgscno.4k9、bt851的基因组分别作为模板，利用引物对ip-bf和ip-br，以及引物对ip-cf和ip-cr对该五株菌进行扩增。并将扩增的产物经过双酶切和dna琼脂糖凝胶回收连接到利用与pcr产物相同的酶酶切过的pet-21b质粒片段上，然后将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，进行重组质粒的提取和测序鉴定，获得了重组质粒pet-ip1(含有seqidno.8所示的序列)、pet-ip2(含有seqidno.9所示的序列)、pet-ip3(含有seqidno.10所示的序列)、pet-ip4(含有seqidno.11所示的序列)、pet-ip5(含有seqidno.12所示的序列)和pet-ip6(含有seqidno.13所示的序列)。并进一步将这6种重组质粒分别转入到大肠杆菌表达菌株rosetta(de3)感受态细胞中，对鉴定正确的阳性转化子在16℃-20℃的低温下利用常规用量的iptg进行蛋白诱导表达。

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分别对目标蛋白的可溶形式和不可溶形式进行检测。结果见图1和图2。根据表达结果发现，ip6主要表达可溶组分，而其他五种蛋白，即ip1、ip2、ip3、ip4和ip5，主要表达不可溶组分。

其中，ip1蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，ip2蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示，ip3蛋白的氨基酸序列如seqidno.3所示，ip4蛋白的氨基酸序列如seqidno.4所示，ip5蛋白的氨基酸序列如seqidno.5所示，ip6蛋白的氨基酸序列如seqidno.6所示。

1.4ip4的截短与表达

设计了引物对：ip4s-f(seqidno.21)：acgcgtcgacgcagaagccaaatcaccagattt；并引入了sali酶切位点：gtcgac；ip4s-r(seqidno.22)：ccgctcgagcaatttaaagttttcacttaat，并引入了xhoi酶切位点：ctcgag。

以提纯的pet-ip1质粒为模板，利用如上引物对进行pcr扩增。然后以1.1.3相同的程序和载体进行截短序列克隆的表达与蛋白检测。

其中获得的含有截短序列ip4s(序列如seqidno.14所示，其对应的氨基酸序列如seqidno.7所示)的重组质粒命名为pet-ip4s。

并进一步将该重组质粒转入到大肠杆菌表达菌株rosetta(de3)感受态细胞中，对鉴定正确的阳性转化子在16℃-20℃的低温下利用常规用量的iptg进行蛋白诱导表达。

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分别对目标蛋白的可溶形式和不可溶形式进行检测。结果见图3。根据表达结果发现，ip4s可表达可溶组分和不可溶组分。

2.蛋白的纯化

(1)镍亲和层析柱的制备

1)使用20％乙醇清洗空柱子，将柱料chelatingsepharosefastflow(ge)摇匀后，取2ml加入亲和层析柱子(20ml)；

2)向柱子内加入5倍柱体积的超纯水进行冲洗；

3)向柱子内加入2倍柱体积的1mol/lniso4，放置20min使ni离子与柱料充分结合；

4)向柱子内加入10倍柱体积的超纯水进行冲洗，洗掉未与柱料结合的ni离子，防止其与蛋白结合；

5)向柱子内加入5倍柱体积的结合缓冲液(bindingbuffer)，平衡柱料。

(2)蛋白样品的上柱

1)对超声波处理后获得的蛋白样品进行预处理：4℃，10000g离心20min，并将上清转入新的50ml离心管；

2)将处理好的蛋白样品(步骤1)中的上清)分多次加入柱子即反复上样3-4次，使蛋白样品充分挂柱；

3)向柱子内加入5倍柱体积的结合缓冲液，洗去杂蛋白；

4)向柱子内加入3倍柱体积的洗脱缓冲液，洗脱目的蛋白，可通过sds-page分析洗脱下来的蛋白；

5)向柱子内加入超纯水清洗柱子，之后用20％乙醇清洗，并于20％乙醇中4℃长期保存。

(3)透析袋的处理

剪透析袋约10cm，放入到含有2％(w/v)nahco3的500ml的1mmol/ledta·2na液中，煮沸10min；用超纯水将透析袋彻底清洗干净，再用500ml的1mmol/ledta·2na煮沸10min；冷却后，置于50％乙醇中，放于4℃保存；在使用前，用超纯水将透析袋里外进行彻底清洗。

(4)纯化蛋白的透析

将镍柱纯化后的蛋白装入处理好的透析袋，用夹子封紧，放入2l预冷透析液20mmol/ltris-hcl(ph8.0)，置于磁力搅拌机上使之旋转透析，每3h更换一次透析液，透析三次后换新的透析液，4℃过夜透析，获得纯化后的蛋白。

可以利用sds-page电泳对纯化的蛋白进行分析或者定量。

3.生物活性测定

将经过1.1.5纯化的7种蛋白分别定量后，针对大猿叶甲(colaphellusbowringiibaly)、小猿叶甲(phaedonbrassicaebaly)、黄曲条跳甲(phyllotretastriolata)、榆蓝叶甲(pyrrhaltaaenescens)和马铃薯甲虫(leplinotarsadecernlineata)的初孵幼虫分别进行生物活性测定，以清水作为空白对照。其中大猿叶甲、小猿叶甲用小油菜叶片进行生物活性测定，黄曲条跳甲用白萝卜进行生物活性测定，榆蓝叶甲用榆树叶片进行生物活性测定，马铃薯甲虫用马铃薯叶片进行生物活性测定。

操作步骤如下：

(1)选取鲜嫩一致的叶片或白萝卜片(根据试虫选择合适的食物)，用清水洗净，晾干，剪成一次性平皿(直径＝6cm)大小；

(2)将叶片或白萝卜片在配制好的一定量蛋白样品(加入洗涤剂，终浓度0.1％)中浸泡30s；

(3)在实验台上铺一层保鲜膜，蘸有样品的叶片或白萝卜片置于保鲜膜上，室温晾干；

(4)将叶片或白萝卜片分别放于培养皿中，培养皿(直径＝9cm)中垫入无菌水喷湿的滤纸(需用锡箔纸包装灭菌)；

(5)用毛笔轻轻接入初孵幼虫，每个叶片或白萝卜片接幼虫30头，每个处理做三次重复，接完虫后以2层吸水纸严格密封，并用橡皮筋固定，防止幼虫爬出；

(6)放置25℃生化培养箱中，光周期为16h：8h，湿度50％左右，每天观察叶片或白萝卜片是否腐烂或干枯，是否有水蒸气凝结，并在生化培养箱内适时适量增加水分，保持箱内湿度；

(7)48h后分别调查死、活虫数，计算死亡率、存活率、校正死亡率和lc50。

其中，对试虫进行lc50测定之前，首先经过初筛初步确定杀虫的浓度范围，然后再测定一系列的浓度梯度下的杀虫活性，进而计算出lc50。在某一特定浓度下的死亡率和校正死亡率计算公式如下：

根据生测数据采用spss(v13.0)软件计算致死中浓度(lc50)。结果见表1。

表1

从表1可以看出，本发明的杀虫蛋白对大猿叶甲、小猿叶甲、黄曲条跳甲、榆蓝叶甲和马铃薯甲虫均表现出了杀虫活性，特别是ip4和其截短蛋白ip4s对这几种鞘翅目的害虫表现尤为突出。

序列表

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>一种杀虫蛋白及其核酸、制备方法和应用

<130>lha2060046d

<160>22

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>364

<212>prt

<213>苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis)

<400>1

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