一种鲜、干金钱白花蛇的分子鉴别方法与流程

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种鲜、干金钱白花蛇的分子鉴别方法。

背景技术：

鲜药的应用在中国传统医学上有着悠久的历史，是中医中药的重要组成部分。鲜药能最大限度的保留活性成分而发挥着独特的疗效，广受中国古代医家的青睐，在中医药古籍中记载着大量鲜药的应用，如《本草纲目》中就记载了1100多条应用鲜药的附方，为后人留下了宝贵的临床经验。现代化学及药理研究发现，鲜、干药在物质基础和药理活性上存在着差异，在这个基础上，一些鲜药制剂得到了开发。国内外均有鲜药制剂，国内的鲜药制剂的研究目前处于起步阶段，已经开发出来的鲜药制剂有金龙胶囊、金水鲜胶囊、鲜益母草胶囊等。鲜药制剂在得到开发的同时，其在质量控制方面还存在一定缺陷，其中之一就是投料中鲜、干药材的鉴别问题。

相对于鲜药，干药在储存、运输等方面更方便，且成本更低。可能存在着以鲜药入药为噱头，实际上以干药入药的现象。而且药材市场混乱，出现的伪品及混伪品众多，质量问题严重。目前，中药及中成药常用的质量控制方法主要有显微法、光谱法、色谱法等，然而这类方法主要应用于具有明确化学成分的植物药。与植物药相比，动物药化学成分差异大，基础研究薄弱，只有极少部分动物药具有专属性鉴别成分，导致此类质量控制方法往往缺乏专属性，质量标准相对比较落后，多以性状和杂质检查为主，鉴别方法往往缺乏专属性，含量测定项多缺乏或指标欠合理。综上现有技术的缺点是指标成分的专属性不高，不足以达到物种特异性鉴别，而且鲜、干药材，以及以鲜药投料的中成药与以干药投料的中成药的鉴别方面，暂无报道。如《中国药典》中收载的鲜地黄和鲜益母草；两者均无其它鉴别指标，没有单独就鲜药规定化学成分指标。查阅文献，亦无相关报道。

金龙胶囊是由鲜守宫、鲜蕲蛇、鲜金钱白花蛇为原料制成的中成药，用于癌症的辅助治疗，有人就鲜、干药入药向金龙胶囊生产厂家提出质疑，为回应质疑，保证临床疗效和用药安全，进一步提高产品的可信度，建立一种专属性强且适合鲜、干药材的鉴别方法是非常有必要的。

鲜金钱白花蛇来源于眼镜蛇科动物银环蛇bungarusmulticinctusblyth的幼体，作为金龙胶囊的主要成分，发挥着重要的作用。并且由于金钱白花蛇价格昂贵，在市场中常有伪品出现，如赤链蛇、黄链蛇、铅色水蛇、百花锦蛇等，严重影响用药安全。本发明运用荧光定量pcr法，测定了鲜、干金钱白花蛇药材中物种特异性片段的拷贝数差异，建立了同时确定金钱白花蛇真伪和鲜、干的方法和标准。

技术实现要素：

为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种鲜、干金钱白花蛇的分子鉴别方法。本发明提出的分子定量方法，可以通过特异片段拷贝数的差异鉴别鲜、干药。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种金钱白花蛇的分子鉴别方法，提取待测样品的基因组dna，用提取的基因组dna作为模板，利用特异引物和探针进行荧光定量pcr反应；若荧光定量pcr检测结果呈阳性反应，出现特异性的s形荧光扩增曲线且cq值为11.72-30.74的即为金钱白花蛇；若荧光定量pcr检测结果为阴性反应，未见特异性的荧光扩增曲线或出现荧光值增长且cq值大于30.74的即为混伪品或金钱白花蛇含量极低。

进一步地，所述荧光定量pcr反应的扩增体系为：dna模板2μl；上下游引物(即特异引物)各0.4μl，终浓度为200nmol/l；探针bmpro0.2ul，终浓度为100nmol/l；besterqpcrmastermix10μl；去离子水7μl，反应总体积为20μl。

进一步地，qpcr扩增程序为：95℃预变性120s；95℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。

进一步地，所述特异引物为：

引物bmforw：5’-atcggagcctgtctaagc-3’，seqidno：1

引物bmrev：5’-gttcaacctgtgccggca-3’，seqidno：2

所述探针为：

探针bmpro：5’-cgcatagagttaacccaacccggctcgc-3’，seqidno：3

探针bmpro由荧光基团和荧光淬灭基团修饰；其中，5’端修饰荧光基团6-fam，3’端修饰荧光淬灭基团bhq1。

一种鲜、干金钱白花蛇的分子鉴别方法，提取待测样品的基因组dna，用提取的基因组dna作为模板，利用特异引物和探针进行荧光定量pcr反应，根据荧光信号以确定样品为金钱白花蛇，计算金钱白花蛇的拷贝数，根据拷贝数的差异来鉴别鲜干金钱白花蛇。

进一步地，若拷贝数不少于3.31×10⁶copies/mg即为鲜金钱白花蛇。

进一步地，所测样品确定为金钱白花蛇，而非其他混伪品的方法为上述所述的金钱白花蛇的分子鉴别方法。

进一步地，所述金钱白花蛇的拷贝数的计算方法为：首先把已知拷贝数dna的量和相应pcr荧光cq值制成标准曲线，再把待测样品的cq值和该标准曲线比对，即得到金钱白花蛇的拷贝数。

进一步地，标准曲线的制作方法为：用特异引物扩增金钱白花蛇dna，pcr反应体积为20μl，体系内包含2×taqpluspcrmastermix10μl，上下游引物各0.5μl(终浓度250nmol/l)，去离子水7μl，dna模版2μl。pcr扩增程序为：94℃5min；94℃45s，50℃30s，72℃45s，共35个循环；72℃7min。所得片段经纯化后作为标准品并经测序鉴定，利用nanodrop2000超微量紫外分光光度计测定标准品dna浓度和纯度。用公式n(copies/μl)＝(6.02×10²³)×(ng/μl×10^-9)/(dnalength×660)计算拷贝数。将dna模版10倍比稀释作为标准品，进行荧光定量pcr扩增。标准品拷贝数的对数值(以10为底，即lgn)与相应cq值进行线性回归分析，以lgn为横坐标、cq值为纵坐标最终生成标准曲线。

进一步地，所述荧光定量pcr反应的扩增体系为：dna模板2μl；上下游引物(即特异引物)各0.4μl，终浓度为200nmol/l；探针bmpro0.2ul，终浓度为100nmol/l；besterqpcrmastermix10μl；去离子水7μl，反应总体积为20μl。

进一步地，qpcr扩增程序为：95℃预变性120s；95℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。

进一步地，所述特异引物为：

引物bmforw：5’-atcggagcctgtctaagc-3’，seqidno：1

引物bmrev：5’-gttcaacctgtgccggca-3’，seqidno：2

所述探针为：

探针bmpro：5’-cgcatagagttaacccaacccggctcgc-3’，seqidno：3

探针bmpro由荧光基团和荧光淬灭基团修饰；其中，5’端修饰荧光基团6-fam，3’端修饰荧光淬灭基团bhq1。

本发明的有益效果是：本发明所建立的荧光定量pcr方法，将样品拷贝数作为含量测定的指标之一，一方面可以特异性鉴别金钱白花蛇，另一方面可以作为鲜、干金钱白花蛇的鉴别的重要参考，并且建议将3.31×10⁶copies/mg的样品拷贝数浓度作为鲜、干金钱白花蛇的鉴别界限，对鲜药制剂的质量控制有一定的借鉴意义。

附图说明

图1为金钱白花蛇不同稀释度标准品的qpcr扩增曲线；

图2为金钱白花蛇的标准曲线；

图3为金钱白花蛇及其混伪品的qpcr扩增曲线；

图4为鲜、干金钱白花蛇的箱形图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。

实施例1材料

金钱白花蛇的常见混伪品标本共13份，分属3科13种，如表1所示。鲜、干金钱白花蛇药材样品各10份。

表1金钱白花蛇混伪品的样本信息表

实施例2dna提取方法

取酒精中保存的金钱白花蛇及常见混伪品标本肌肉组织约30mg，用纸巾吸干酒精后，用去离子水清洗两遍，再用纸巾吸干水分。用消毒过的剪刀将组织剪成碎块，用基因组dna提取试剂盒方法提取dna。

取冻干的鲜、干金钱白花蛇的肌肉组织约30mg，用消毒过的剪刀剪碎，用基因组dna提取试剂盒方法提取dna。

实施例3特异引物及探针的设计

测定金钱白花蛇及其混伪品的线粒体全基因组序列，用nvista进行比对分析，根据寻找出的差异区域，运用软件oligo6.0设计金钱白花蛇的特异引物及探针，如下：

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探针bmpro：5’-cgcatagagttaacccaacccggctcgc-3’，seqidno：3

探针bmpro由荧光基团和荧光淬灭基团修饰；其中，5’端修饰荧光基团6-fam，3’端修饰荧光淬灭基团bhq1。

实施例4荧光定量pcr扩增

荧光定量pcr扩增体系：dna模板2μl；上下游引物(即特异引物)各0.4μl(终浓度为200nmol/l)；探针bmpro0.2ul(终浓度为100nmol/l)；besterqpcrmastermix10μl；去离子水7μl，反应总体积为20μl。试剂配制完成后简短离心以消除八连管中的气泡，减少气泡对荧光信号收集的影响。实验在96实时荧光定量pcr仪上进行。qpcr扩增程序为：95℃预变性120s；95℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环，在每个循环延伸结束时采集荧光信号。实验中设置不添加任何物种dna模板(双蒸水替代)的空白对照组。

实施例5标准曲线与灵敏度

用设计的引物扩增金钱白花蛇dna。pcr反应体积为20μl，体系内包含2×taqpluspcrmastermix10μl，上下游引物各0.5μl(终浓度250nmol/l)，去离子水7μl，dna模版2μl。pcr扩增程序为：94℃5min；94℃45s，50℃30s，72℃45s(共35个循环)；72℃7min。所得片段经纯化后作为标准品并经测序鉴定，利用nanodrop2000超微量紫外分光光度计测定标准品dna浓度和纯度。用公式n(copies/μl)＝(6.02×10²³)×(ng/μl×10^-9)/(dnalength×660)计算拷贝数。将上述纯化后的dna模版10倍比稀释作为标准品，进行荧光定量pcr扩增。标准品拷贝数的对数值(以10为底，即lgn)与相应cq值进行线性回归分析，以lgn为横坐标、cq值为纵坐标最终生成标准曲线。根据所能检测到最小浓度的循环阈值，得到该方法的检测灵敏度。

nanodrop2000紫外分光光度计测得标准品的浓度为8.4ng/ul，计算得拷贝数为2.6×10¹⁰copies/μl。标准品梯度稀释后(2.6×10¹-2.6×10⁸copies/μl)进行荧光定量pcr反应，如图1所示，扩增曲线各稀释梯度间距均等，各标准品的复孔扩增正常，标准品稀释到10¹copies/μl时仍有扩增信号，平均cq值为35.5，具有高灵敏度。如图2所示，在10²-10⁸copies/μl线性范围内，标准曲线回归方程为y＝-3.672x+39.532(r2＝0.9991)，cq值和标准品拷贝数间呈良好的线性关系，线性范围是10²-10⁸copies/μl。

实施例6特异性、重复性和准确度

以金钱白花蛇及其混伪品dna为模板进行荧光定量pcr反应，考察所使用的引物及所设计的探针的特异性。金钱白花蛇及其混伪品的qpcr扩增曲线如图3所示，taqman荧光定量pcr检测方法对正品金钱白花蛇的检测结果呈阳性反应，出现特异性的s形荧光扩增曲线，cq值为12.69-16.91；正品金钱白花蛇均出现明显的s形荧光扩增曲线，cq值为12.69-16.91。蕲蛇、原矛头蝮蛇、舟山眼镜蛇、金环蛇、滑鼠蛇、玉斑锦蛇检测结果均为阴性反应，均未见特异性的荧光扩增曲线以及荧光值增长。

取6个不同浓度的标准品进行荧光定量pcr反应，在同一个试验中每个样品做3个复孔，计算试验内cq值rsd，分析组内差异，再以相同的标准品作为模版，在不同时间段进行3次独立重复试验，计算试验间cq值rsd，分析组间差异，以验证该方法的重复性。如表2所示，组内重复测定的rsd值在0.35％-2.26％之间，组间重复测定的rsd值在0.63％-1.64％之间，均在可接受的范围内，说明本研究建立的金钱白花蛇荧光定量pcr方法的稳定性良好。

表2金钱白花蛇taqman荧光定量pcr重复性试验(n＝3)

取理论浓度为2.89×10⁵copies/μl的标准品6次以上荧光定量pcr检测的cq值均值定为理论值，向空白基质提取液中加入等体积的标准品，采用空白加标回收法，进行荧光定量pcr扩增，计算回收率(待测值/理论值×100％)。如表3所示，6份理论浓度为2.89×10⁵copies/μl的标准品dna的回收率在95.05％-95.98％之间，均在定量检测方法可接受的回收率范围内，说明该检测方法准确度良好。

表3taqman荧光定量pcr法的回收率

实施例7鲜、干金钱白花蛇的鉴别

鲜、干金钱白花蛇各10批，取其肌肉组织，剁碎后真空冷冻干燥24h。取30mg冻干肌肉组织，精密称定，按实施例2方法提取样品的基因组dna作为模板。按实施例3方法设计的引物及实施例4方法的扩增方法进行qpcr扩增，根据得到的cq值，计算每个样品的拷贝数。

如表4、5所示，鲜金钱白花蛇拷贝数为1.90×10⁶copies/mg-2.16×10⁷copies/mg，干金钱白花蛇的拷贝数为3.29×10⁴copies/mg-2.76×10⁶copies/mg。由图4箱形图可知(省略了离群点2.16×10⁷copies/mg)，鲜金钱白花蛇的最低拷贝数为1.90×10⁶copies/mg，下四分位数为3.74×10⁶copies/mg；干金钱白花蛇的最高拷贝数为2.76×10⁶copies/mg，且为离群点。结合测定结果，将干金钱白花蛇最高拷贝数向上浮动20％，暂定鲜金钱白花蛇的拷贝数不得少于3.31×10⁶copies/mg。这个拷贝数浓度范围，涵盖了大于75％的鲜金钱白花蛇，且远超了干金钱白花蛇可达到的浓度，可作为鲜、干金钱白花蛇的鉴别指标之一。

表4鲜金钱白花蛇分子定量结果(n＝3)

表5干金钱白花蛇分子定量结果(n＝3)

因此，本申请所建立的荧光定量pcr方法可以作为鲜、干金钱白花蛇的鉴别的重要参考，将样品拷贝数作为含量测定的指标之一，并且建议鲜金钱白花蛇的拷贝数浓度应不低于3.31×10⁶copies/mg。本申请建立的方法可为鲜、干药的鉴别提供参考，对鲜药制剂的质量控制有一定的借鉴意义。

以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

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<110>南方医科大学

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