一种与肝癌诊断相关的血清外泌体miRNA标志物及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种与肝癌诊断相关的血清外泌体mirna标志物及其应用。

背景技术：

肝细胞性肝癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是全球范围内发病率第六的恶性肿瘤，居癌症相关死亡原因的第三位。目前，外科手术切除仍然是治疗hcc最有效的治疗手段，但hcc的高转移率及高复发率严重制约了hcc患者的远期疗效。同时，临床上常用的hcc特异性诊断指标不够敏感，又因肝脏具有强大的代偿能力，当患者出现症状就诊时多已处于癌症中、晚期，能够获得根治性手术者不足10％。因此，阐释hcc发生发展的具体机制、探究临床治疗靶点及寻找可靠的hcc切除预后指标是目前急需解决的问题。

肿瘤的生长，尽管主体是肿瘤细胞本身的无限制增殖，但肿瘤细胞与邻近细胞之间的交互作用越来越受到关注。近年来，肿瘤细胞释放的外泌体在肿瘤生长过程中的重要作用逐渐被认知，外泌体在运送生物活性物质至受体细胞的过程中，囊泡内物质免于被细胞间隙的酶类水解，保证了生物学活性物质传输的有效性。因此，外泌体在阐释肿瘤发生发展、转移及治疗选择方面提供了良好的靶点，其在肿瘤发展过程中发挥至关重要的作用。

外泌体囊泡发挥作用主要依靠外泌体的生物活性物质，包括蛋白、mrna、非编码rna、dna片段等，其中，mirnas作为外泌体内非编码rna中表达量最高的核酸物质，其表达异常促进了肿瘤的发生发展。研究表明，mirna能够调控人类三分之一基因的表达，一个mirna也能够同时调控几百个基因的表达。因此，单个mirnas的异常表达也有可能使正常细胞转化成肿瘤细胞。目前越来越多的证据表明，失衡的外泌体mirnas是肿瘤细胞与受体细胞的重要联系。因此，亟需开发一种外泌体mirnas为hcc临床诊断、治疗及预后判断提供新的理论依据。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种与肝癌诊断相关的血清外泌体mirna标志物及其应用。

为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：本发明提供了一种与肝癌诊断相关的血清外泌体mirna标志物，所述标志物为has-mirna-21-5p。

本发明还提供了上述has-mirna-21-5p在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。

本发明还提供了标志物has-mirna-21-5p的特异性扩增引物，所述特异性扩增引物为：正向引物has-mirna-21-5p-f和反向引物has-mirna-21-5p-r，所述正向引物has-mirna-21-5p-f的核苷酸序列为seqidno.17，所述反向引物has-mirna-21-5p-r的核苷酸序列为seqidno.18。

本发明还提供了上述特异性扩增引物has-mirna-21-5p-f/has-mirna-21-5p-r在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种肝癌诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血清外泌体mirna中has-mirna-21-5p的表达量。

进一步地，所述试剂盒包含标志物has-mirna-21-5p的特异性扩增引物has-mirna-21-5p-f和has-mirna-21-5p-r。

进一步地，所述试剂盒还包括pcr技术常用的试剂。

本发明还提供了has-mirna-21-5p模拟物在制备肝癌动物模型中的应用，所述has-mirna-21-5p模拟物的核苷酸序列为seqidno.1。

本发明还提供了has-mirna-21-5p抑制物在制备治疗肝癌产品中的应用，所述has-mirna-21-5p抑制物的上游序列为seqidno.2，所述has-mirna-21-5p抑制物的下游序列为seqidno.3。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1)本发明首次发现血清外泌体中的has-mirna-21-5p可作为肝癌诊断的生物标记物，具有检测方便、伤害小的特点，并且定量准确，可以提高hcc诊断的灵敏性和特异性；

2)has-mirna-21-5p外泌体取自血清，可避免侵入性诊断，易于提取，需要血清量少，减少检测者血液抽取量；

3)本发明还制备肝癌诊断试剂盒，该试剂盒包含特异性扩增引物has-mirna-21-5p-f和has-mirna-21-5p-r及qrt-pcr技术常用的其他试剂，通过检测检测者血清中外泌体has-mirna-21-5p的表达量，即可在早期进行快速、辅助诊断，为临床医生进一步深入检查或快速准确掌握患者的疾病状态提供依据，帮助医生及时采取防治方案，延缓和阻止疾病进展；

4)has-mirna-21-5p抑制物通过抑制外泌体中的has-mirna-21-5p表达能够抑制移植瘤的生长，为制备肝癌治疗产品奠定了基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同来源外泌体鉴定结果，其中，a为不同细胞来源外泌体的透射电子显微镜成像图，b为随机不同视野下各细胞来源外泌体直径，c为随机不同视野下各细胞来源外泌体数量，d为westernblot法鉴定外泌体标记物cd63、cd81、cd9表达水平(***p<0.001)。

图2为本发明实施例1中cck-8实验检测has-mirna-21-5p刺激后的细胞增殖水平，其中，a为cck-8实验检测不同时间点下has-mirna-21-5p对hscs细胞增殖水平的影响；b为cck-8实验检测has-mirna-21-5p对hscs增殖水平的影响(**p<0.01,***p<0.001)。

图3为本发明实施例2的肝癌细胞迁移效果图。

图4为本发明实施例3的皮下移植瘤生长状态图(**p<0.01,***p<0.001)。

图5为本发明实施例4的不同细胞来源外泌体刺激后的hscs合成促血管生成因子的能力检测结果(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。

图6为本发明实施例5的肝癌组和对照组提取的血清外泌体鉴定结果，其中a为肝癌组(hcc)和对照组(normal)的外泌体的透射电子显微镜成像图，b为随机不同视野下肝癌组(hcc)和对照组(normal)的血清外泌体直径，c为随机不同视野下肝癌组(hcc)和对照组(normal)的血清外泌体数量，d为westernblot法鉴定肝癌组(hcc)和对照组(normal)的血清外泌体标记物cd63、cd81、cd9表达水平(***p<0.001)。

图7为本发明实施例5的肝癌组和对照组血清外泌体中has-mirna-21-5p的相对表达量结果(**p<0.01)。

具体实施方式

为了使本领域技术领域人员更好地理解本发明的技术方案，下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，取平均值；使用t检验方法统计所得数据，p值小于0.05且变化倍数大于2倍认为具有统计学意义；

以下实施例中，各英文缩写的含义为：lm3-exo：hcclm3细胞系培养上清中分泌的外泌体；97h-exo：mhcc97h细胞系培养上清中分泌的外泌体；lo2-exo：lo2细胞系培养上清中分泌的外泌体；lm3：hcclm3细胞系；97h：mhcc97h细胞系；has-mirna-21-5pmimic：has-mirna-21-5p模拟物；mirna-mimic-nc：has-mirna-21-5p模拟物阴性对照；has-mirna-21-5pinhibitor：has-mirna-21-5p抑制物；lm3-exo-mir-21：抑制has-mirna-21-5p表达的hcclm3的外泌体；97h-exo-mir-21：抑制has-mirna-21-5p表达的mhcc97h的外泌体；

实施例1：外泌体中的has-mirna-21-5p促进肝癌细胞增殖

1.1)细胞来源：人肝癌细胞系hcclm3(人高转移肝癌细胞)购自中国科学院细胞库(目录号：tchu94)，mhcc97h(人高转移肝癌细胞)细胞购自复旦大学肝癌研究所(上海，中国)，人正常肝细胞lo2、人肝星状细胞(hscs)购自复旦大学肝癌研究所(上海，中国)；

1.2)肝癌细胞系中外泌体提取和鉴定

1.2.1)培养人肝癌细胞系hcclm3、mhcc97h以及人肝细胞lo2：人肝癌细胞系hcclm3和mhcc97h用含10％胎牛血清的高糖dmem培养基(含青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)于37℃、5％co2细胞培养箱中培养及传代；人肝细胞lo2用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基(含青霉素100u/ml，链霉素100u/ml)于37℃、5％co2细胞培养箱中培养及传代；

1.2.2)提取hcclm3、mhcc97h和lo2的血清外泌体，具体步骤为：

1.2.2.1)吸取1.2.1)中hcclm3、mhcc97h、lo2培养基各10ml；

1.2.2.2)使用0.22μm规格的微孔膜滤器分别过滤上述培养基，收集滤液，去除细胞及细菌；

1.2.2.3)4℃下300g×10min离心，收集上清，去除细胞；

1.2.2.4)4℃下2000g×10min离心，收集上清，去除死细胞；

1.2.2.5)4℃下10000g×30min离心，收集上清，去除细胞碎片；

1.2.2.6)4℃下100000g×70min离心，收集沉淀，即为外泌体；

1.2.3)透射电镜检测外泌体：

1.2.3.1)取部分步骤1.2.2.6)中提取的外泌体沉淀用100μl的pbs溶液重悬；

1.2.3.2)利用2.5％戊二醛固定液(电镜专用)进行固定；

1.2.3.3)样品制备后切成0.12μm后，用0.2％的柠檬酸铅和1％的醋酸双氧铀染色；

1.2.3.4)采用jem-2000exii电子显微镜(jeol，东京，日本)观察切片，hcclm3、mhcc97h和lo2细胞来源的外泌体透射电子显微镜成像结果，如图1(a)所示；

1.2.3.5)计算不同视野下外泌体直径及外泌体个数：

随机不同视野下外泌体直径：在jem-2000exii电子显微镜下随机选取三个视野，计算hcclm3、mhcc97h和lo2细胞来源的外泌体的平均直径，如图1(b)所示，从hcclm3和mhcc97h细胞中提取的外泌体均小于从lo2细胞中提取的外泌体；

随机不同视野下外泌体数量：在jem-2000exii电子显微镜下随机选取三个视野，计算hcclm3、mhcc97h和lo2细胞来源的外泌体的数量，如图1(c)所示，hcclm3和mhcc97h细胞系培养上清中分泌的外泌体数量均显著多于lo2细胞系培养上清中分泌的外泌体(p<0.001)；

1.2.4)外泌体标记物cd63、cd81、cd9表达鉴定：

1.2.4.1)外泌体蛋白提取：

a、实验前先将裂解液融化混匀后置于冰上(如有沉淀析出，可37℃加热至溶解)；

b、取部分步骤1.2.2)中提取外泌体沉淀用100μl的pbs溶液重悬，获得外泌体样本，再将外泌体样本与裂解液按体积比1：1的比例添加混匀并置于冰上裂解10min；

c、4℃下12000g×5min离心后提取上清，即为外泌体蛋白，-80℃保存；

1.2.4.2)westernblot检测外泌体标记物cd63、cd81、cd9：

1.2.4.2.1)步骤1.2.4.1)提取的hcclm3、mhcc97h、lo2的外泌体蛋白用1×western上样缓冲液煮沸；

1.2.4.2.2)用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法将等量的蛋白质电转移到聚偏氟乙烯膜上；

1.2.4.2.3)在tbs-t中用5％bsa封闭后，在4℃下用一级抗体(cd63、cd81、cd9)将膜孵育过夜；

1.2.4.2.4)以辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg或辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠igg为二级抗体，用tanon凝胶成像系统成像免疫反应带。

以上所用的外泌体鉴定试剂来自exosomeidentificationkitforwesternblot外泌体鉴定试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司，产品编号：41203es05)，cd81抗体(货号：ab109201)和cd9抗体(货号：ab92726)均购自abcam；

如图1(d)所示，鉴定结果显示cd63、cd81、cd9均为阳性，表明步骤1.2.2)中从hcclm3、mhcc97h、lo2细胞血清中提取的物质均为外泌体。

1.3)cck-8实验检测不同时间点下cclm3外泌体和mhcc97h外泌体对人肝星状细胞(hscs细胞系)增殖水平的影响

1.3.1)hscs细胞系用含10％胎牛血清的高糖dmem培养基(含青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)于37℃、5％co2细胞培养箱中培养及传代；

1.3.2)制备2ml密度为4*10⁴个/ml的hscs细胞悬液，然后以100μlhscs细胞悬液/孔加入96孔板中，共接种20个孔；

1.3.3)向上述加有hscs细胞悬液的孔中加入pbs缓冲液(阴性对照)、hcclm3、mhcc97h和lo2的外泌体，各5个孔，每孔100μl，其中，hcclm3、mhcc97h和lo2的外泌体为步骤1.2.2)获得的外泌体经鉴定后剩余沉淀加100μl的pbs重悬后液体；

1.3.4)37℃、5％co2细胞培养箱孵育；

1.3.5)cck-8细胞增殖实验，具体步骤为：

1.3.5.1)分别向步骤1.3.4)中孵育6h、12h、24h的各孔中加入10μl的cck-8检测溶液；

1.3.5.2)37℃、5％co2细胞培养箱下孵育1～4小时；

1.3.5.3)读数前在摇床上温柔混匀，酶标仪在460nm波长处检测每孔的吸光度；

如图2(a)所示的cck-8实验检测不同时间点下外泌体对hscs细胞系增殖水平的影响，发现相较于阴性对照(pbs)和lo2外泌体(lo2-exo)，cclm3外泌体(lm3-exo)和mhcc97h外泌体(97h-exo)能够促进肝星状细胞(hscs细胞系)增殖。

1.4)cck-8实验检测不同时间点下has-mirna-21-5p模拟物(has-mirna-21-5pmimic)对肝星状细胞(hscs细胞系)增殖水平的影响

1.4.1)材料来源：has-mirna-21-5p模拟物(has-mirna-21-5pmimic)和has-mirna-21-5p模拟物阴性对照(mirna-mimic-nc)均购自广州锐博生物科技公司；

has-mirna-21-5pmimic的序列为：5’-aucgaauagucugacuacaacu-3’(seqidno.1)；

1.4.2)采用has-mirna-21-5pmimic和mirna-mimic-nc转染hscs细胞，具体步骤为：

1.4.2.1)hscs细胞系在含有10％胎牛血清的高糖dmem培养基(含青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)中于37℃、5％co2细胞培养箱中培养及传代；

1.4.2.2)制备2ml密度为4*10⁴个/ml的hscs细胞悬液，然后以100μlhscs细胞悬液/孔加入96孔板中，共接种10个孔；

1.4.2.3)向上述加有hscs细胞悬液的孔中加入has-mirna-21-5pmimic和mirna-mimic-nc，各5个孔，每孔100μl，滴度为10^7tu/ml；

1.4.2.4)37℃、5％co2细胞培养箱孵育；

1.4.3)cck-8细胞增殖实验，具体步骤为：

1.4.3.1)分别向步骤1.4.2)孵育6h、12h、24h的has-mirna-21-5pmimic和mirna-mimic-nc转染hscs细胞各孔中加入10μl的cck-8检测溶液；

1.4.3.2)37℃、5％co2细胞培养箱下孵育1～4小时；

1.4.3.3)读数前在摇床上温柔混匀，酶标仪在460nm波长处检测每孔的吸光度；

如图2(b)所示的cck-8实验检测不同时间点下has-mirna-21-5p模拟物hscs2细胞系增殖水平的影响，发现相较于阴性对照mirna-mimic-nc，has-mirna-21-5pmimic组能够促进肝星状细胞(hscs细胞系)增殖，说明外泌体中的has-mirna-21-5p能促进肝癌细胞增殖。

实施例2：外泌体中的has-mirna-21-5p促进肝癌细胞迁移

2.1)参照步骤1.4.2)的转染步骤，采用has-mirna-21-5pmimic和阴性对照mirna-mimic-nc转染hscs细胞；

2.2)制备细胞悬液：收集转染后的hscs细胞，用无血清dmem高糖培养基制成1.0x10⁶个/ml的细胞悬液；

2.3)划痕：细胞贴壁后，沿预先标记好的线划痕，划痕的过程中选用200μl枪头沿标记线笔直的划下，制造多条相互平行的划痕，力度以刮落细胞而不在培养板上留痕为准；然后用pbs漂洗2遍，去除漂浮细胞；再用不含fbs的dmem高糖培养基于37℃、5％co2孵育箱继续孵育培养24h；

2.4)结果观察：于倒置显微镜下观察细胞的划痕修复过程，每组于步骤2.3)中孵育培养0h、24h拍摄图片，比较hscs细胞划痕修复速度；

由图3可见，转染has-mirna-21-5pmimic能够促进hscs细胞的修复，说明has-mirna-21-5p能促进肝癌细胞的迁移。

实施例3：肝癌细胞外泌体has-mirna-21-5p促进皮下移植瘤生长

3.1)材料来源：has-mirna-21-5p抑制物(has-mirna-21-5pinhibitor)购自广州锐博生物科技公司；

has-mirna-21-5pinhibitor的序列为：上游序列has-mirna-21-5pinhibitor-f：5’-uagcuuaucagacugauguuga-3’(seqidno.2)、下游序列has-mirna-21-5pinhibitor-r：5’-aucgaauagucugacuacaacu-3’(seqidno.3)；

3.2)制备抑制has-mirna-21-5p表达的hcclm3、mhcc97h细胞：

3.2.1)hcclm3、mhcc97h细胞用含10％胎牛血清的高糖dmem培养基(含青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)于37℃、5％co2细胞培养箱中培养及传代；

3.2.2)分别制备2ml密度为4*10^4个/ml的hcclm3和mhcc97h细胞悬液，以100μl细胞悬液/孔加入96孔板中，每个接种10个孔；

3.2.3)每孔加入has-mirna-21-5pinhibitor，滴度为10^7tu/ml；

3.2.4)于37℃5％co2培养箱孵育12h后获得抑制has-mirna-21-5p表达的hcclm3和抑制has-mirna-21-5p表达的mhcc97h细胞；

3.3)参照步骤1.2.2)制备hcclm3细胞、mhcc97h细胞、lo2细胞、抑制has-mirna-21-5p表达的hcclm3细胞及抑制has-mirna-21-5p表达的mhcc97h细胞的外泌体，然后用pbs重悬至200μl；

3.4)肿瘤种植：

3.4.1)将3周龄裸鼠分别于右侧腋腹壁皮下接种200μlpbs缓冲液(空白对照)、hcclm3外泌体、mhcc97h外泌体、lo2外泌体、抑制has-mirna-21-5p表达的hcclm3外泌体、抑制has-mirna-21-5p表达的mhcc97h外泌体悬液；

3.4.2)4周后处死小鼠，获取移植瘤组织，测量肿瘤大小、计算表面结节个数；

如图4(a)所示，在pbs(空白对照，ctr)、hcclm3外泌体(lm3-exo)、lo2外泌体(lo2-exo)、抑制has-mirna-21-5p表达的hcclm3的外泌体(lm3-exo-mir-21)接种裸鼠后，相较于ctr组和lo2-exo组，lm3-exo组能促进肿瘤的生长、刺激后的肿瘤表现出更多的肿瘤结节，而lm3-exo-mir-21组则肿瘤体积减小，肿瘤结节数减少；

如图4(b)所示，在pbs(空白对照，ctr)、mhcc97h外泌体(97h-exo)、lo2外泌体(lo2-exo)、抑制has-mirna-21-5p表达的mhcc97h的外泌体(97h-exo-mir-21)接种裸鼠后，相较于ctr组和lo2-exo组，97h-exo组能促进肿瘤的生长、刺激后的肿瘤表现出更多的肿瘤结节，而97h-exo-mir-21组则肿瘤体积减小，肿瘤结节数减少。

以上图4(a)～4(b)结果表明，肝癌细胞外泌体中的has-mirna-21-5p能够促进皮下移植瘤生长，has-mirna-21-5p抑制物通过抑制外泌体中的has-mirna-21-5p表达能够抑制移植瘤的生长。

实施例4：不同细胞来源外泌体刺激后的肝星状细胞(hscs)合成促血管生成因子的能力

4.1)hscs细胞系用含10％胎牛血清的高糖dmem培养基(含青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)于37℃、5％co2细胞培养箱中培养及传代，以10^5个/ml的密度接种至6孔板中；

4.2)参照步骤1.2.2)制备hcclm3外泌体、mhcc97h外泌体、lo2外泌体、抑制has-mirna-21-5p表达的hcclm3外泌体、抑制has-mirna-21-5p表达的mhcc97h外泌体；

4.3)将上述五种外泌体分别以100μl/孔的量分别加入其中5个孔的hscs细胞中，剩余1孔中加入100μldepc缓冲液，作为对照组(ctr)；

4.4)在上述五种不同处理的细胞每孔加入1mltrizol，加入同等体积氯仿，剧烈振荡20s后常温静置10min，4℃下12000g离心15min，吸取上层水相并加入等体积异丙醇，4℃下12000g离心10min，弃除上清，加入1ml预冷的75％酒精再于4℃下7500g离心5min，弃除上清，常温放置10min，干燥rna沉淀，再加入20μldepc水溶解rna，55-60℃放置10min后，紫外分光光度计定量总rna；

4.5)使用rtmastermix(perfectrealtime)(takara，货号：drr036a)对肝癌组和对照组的rna进行反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作为：使用紫外分光光度计定量各总rna样品浓度，然后在冰上按下列组分配置rt反应液(20μl)：rtmastermix(forrealtime)4μl，totalrna1μg，加rnasefreedh2o至20μl；轻柔混匀后放入pcr仪中进行反转录反应，反转录反应条件如下：37℃15min，85℃5sec，反转录后得到cdna样品；

4.6)采用chamq^tmqpcrmastermix(withoutrox)(南京诺唯赞生物科技有限公司，codeno.:q321-02)进行qrt-pcr扩增，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

定量反应体系(20μl)：2×chamqsybrqpcrmastermix10μl、正向引物(10μm)0.4μl、反向引物(10μm)0.4μl、cdna5μl、ddh2o4.2μl；

其中，正向引物和反向引物为vegf-α、mmp-2、mmp-9、bfgf、tgfβ定量引物，内参为gapdh，各引物的序列见表1，其中vegf-α的上下游引物分别如seqidno.4和seqidno.5所示，mmp-2的上下游引物分别如seqidno.6和seqidno.7所示，mmp-9的上下游引物分别如seqidno.8和seqidno.9所示，bfgf的上下游引物分别如seqidno.10和seqidno.11所示，tgfβ的上下游引物分别如seqidno.12和seqidno.13所示，内参gapdh的上下游引物分别如seqidno.14(gapdh-f)和seqidno.15(gapdh-r)所示；

表1序列表

定量反应程序为：预变性：a.95℃30s；循环反应：b.95℃10s，c.60℃30s，b-c循环40次；溶解曲线：d.95℃15s，e：60℃60，f：95℃15s；

数据处理：根据rt-qpcr数据，通过2^-(△△ct)法分析肝癌组和对照组血清外泌体中has-mirna-21-5p表达量；

结果与分析：由图5所示定量结果可见，hcclm3(lm3-exo)、mhcc97h(97h-exo)的外泌体相较于对照组(ctr)和lo2(lo2-exo)外泌体刺激后的hscs细胞内合成促血管生成因子(vegf-α、mmp-2、mmp-9、bfgf及tgfβ)的能力增强，干扰hcclm3(lm3-exo-mir-21)、mhcc97h(97h-exo-mir-21)外泌体中has-mirna-21-5p的表达能够抑制hscs的促血管生成因子的合成能力，说明肝癌外泌体通过has-mirna-21-5p促进hscs的促血管生成能力。

实施例5：人血清外泌体has-mirna-21-5p可作为肝癌诊断的生物标记物

5.1)研究对象与分组

实验血液样品均收集于南京鼓楼医院肝胆外科，取材时间为2014年～2016年，血液样品的使用都告知了样品来源本人并取得了南京鼓楼医院伦理委员会的批准，选择43例确诊肝癌患者(经病理证实患有肝癌，无其他全身性重大疾病)的血液样品，作为肝癌组，选择43例健康人(经检测无其他全身性重大疾病)的血液样品，作为对照组，上述两组共86例血液样品保存在-80℃冰箱；基于实施例1～4验证的has-mirna-21-5p具有促进肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞迁移、促进皮下移植瘤生长的功能，我们将肝癌组和对照组的血液样品作为qrt-pcr检测has-mirna-21-5p表达的实验对象。

5.2)血清外泌体的提取与鉴定

5.2.1)提取血清外泌体，包括以下步骤：

5.2.1.1)肝癌组和对照组的血液样品分别收集在1.5mlep管中，并使其在37℃下凝结1小时，期间不进行抗凝处理；

5.2.1.2)将ep放入提前预冷的离心机中，4℃下2000g离心10min，获得血清；

5.2.1.3)收集ep上层血清，4℃下3000g离心10min，纯化血清；

5.2.1.4)收集血清后，以1：1比例加入无菌pbs溶液稀释，并在4℃下10000g离心30min，弃上清，以去除大分子蛋白质；

5.2.1.5)收集沉淀，加入10mlpbs缓冲液清洗，充分吹打混匀，并经0.22μm规格的微孔膜滤器过滤，在4℃下100000g离心70min；

5.2.1.6)收集沉淀，再次加入10mlpbs溶液清洗，在4℃下100000g离心70min，获得外泌体沉淀；

5.2.2)血清外泌体的鉴定：

5.2.2.1)透射电镜检测外泌体：

5.2.2.1.1)取部分步骤5.2.1)中提取的外泌体沉淀用100μl的pbs溶液重悬；

5.2.2.1.2)利用电镜固定液(2.5％戊二醛)进行固定；

5.2.2.1.3)样品制备后切成0.12μm后，用0.2％的柠檬酸铅和1％的醋酸双氧铀染色；

5.2.2.1.4)采用jem-2000exii电子显微镜(jeol，东京，日本)观察，如图6(a)所示；

5.2.2.1.5)计算不同视野下外泌体直径及外泌体个数：

随机不同视野下外泌体直径：在jem-2000exii电子显微镜下随机选取三个视野，计算外泌体的平均直径，如图6(b)所示，肝癌组(hcc)的血清外泌体尺寸小于健康人(normal)的血清外泌体；

随机不同视野下外泌体数量：在jem-2000exii电子显微镜下随机选取三个视野，计算外泌体的数量，如图6(c)所示，肝癌组(hcc)的血清外泌体数量显著多于健康人(normal)的血清外泌体(p<0.001)；

5.2.2.2)外泌体标记物cd63、cd81、cd9表达鉴定：

5.2.2.2.1)外泌体蛋白提取：

a、实验前先将裂解液融化混匀后置于冰上(如有沉淀析出，可37℃加热至溶解)；

b、取部分步骤5.2.1)中提取的外泌体沉淀用100μl的pbs溶液重悬，获得外泌体样本，再将外泌体样本与裂解液按体积比1：1的比例添加混匀并置于冰上裂解10min；

c、4℃下12000g×5min离心后提取上清，即为外泌体蛋白，-80℃保存；

5.2.2.2.2)westernblot检测外泌体标记物cd63、cd81、cd9鉴定：将步骤5.2.2.2.1)提取的肝癌组和对照组的外泌体蛋白用1×western上样缓冲液煮沸，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法将等量的蛋白质电转移到聚偏氟乙烯膜上，在tbs-t中用5％bsa封闭后，在4℃下用一级抗体(抗cd63的兔多抗或抗cd81的兔多抗或抗cd9的兔多抗)将膜孵育过夜，以辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg或辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠igg为二级抗体，用tanon凝胶成像系统成像免疫反应带；

以上所用的外泌体鉴定试剂来自exosomeidentificationkitforwesternblot外泌体鉴定试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司，产品编号：41203es05)，cd81抗体(货号：ab109201)和cd9抗体(货号：ab92726)均购自abcam；

westernblot检测结果如图6(d)所示，肝癌组(hcc)和对照组(normal)的各个血清样本得到的外泌体cd63、cd81、cd9均阳性，表明步骤5.2.1)提取的物质为外泌体。

5.3)外泌体总rna的抽提

对步骤2.1.6)提取的肝癌组和对照组外泌体沉淀进行总rna提取，具体操作如下：

5.3.1)取步骤5.2.1)中提取的肝癌组和对照组外泌体经鉴定后剩余沉淀用100μl的pbs溶液溶解，再加入1mltrizol；

5.3.2)加入同等体积的氯仿，剧烈振荡20s后常温静置10min；

5.3.3)4℃下12000g离心15min，然后吸取上层水相置于新ep管中并加入等体积异丙醇，4℃下12000g离心10min，弃除上清；

5.3.4)加入1ml预冷的75％酒精在4℃下7500g离心5min，弃除上清，常温放置10min；

5.3.5)干燥rna沉淀，加入适量depc水溶解rna沉淀，并于-80℃条件下保存或至于冰上马上进行逆转录；

5.4)合成has-mirna-21-5p的qrt-pcr引物

根据has-mirna-21-5p的核苷酸序列(seqidno.16)设计其qrt-pcr扩增引物has-mirna-21-5p-f和has-mirna-21-5p-r，并由上海生工生物工程有限公司合成，经过多次调试和验证，最终确定引物序列如下：

has-mirna-21-5p：5'-tgtcgggtagcttatcagactgatgttgactgttgaatctcatggcaacaccagtcgatgggctgtctgaca-3'(seqidno.16)

正向引物has-mirna-21-5p-f：5'-ttttgtttttgctggtcttag-3'(seqidno.17)；

反向引物has-mirna-21-5p-r：5'-agcagacagtcaggcaggat-3'(seqidno.18)；

内参基因u6的引物序列为：

正向引物u6-f：5'-gcttcggcagcacatatactaaaat-3'(seqidno.19)；

反向引物u6-r：5'-cgcttcacgaatttgcgtgtcat-3'(seqidno.20)；

5.5)逆转录合成cdna样品

使用mastermix(perfectrealtime)(takara，货号：drr036a)对肝癌组和对照组的rna进行反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

使用紫外分光光度计定量各总rna样品浓度，然后在冰上按下列组分配置rt反应液(20μl)：5×rtmastermix(forrealtime)4μl，totalrna1μg，加rnasefreedh2o至20μl；轻柔混匀后放入pcr仪中进行反转录反应，反转录反应条件如下：37℃15min，85℃5sec，反转录后得到cdna样品；

5.6)qrt-pcr检测has-mirna-21-5p表达量：

采用chamq^tmqpcrmastermix(withoutrox)(南京诺唯赞生物科技有限公司，codeno.:q321-02)进行rt-qpcr扩增，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

定量反应体系(20μl)：2×chamqsybrqpcrmastermix10μl、正向引物(10μm)0.4μl、反向引物(10μm)0.4μl、cdna5μl、ddh2o4.2μl；

其中，正向引物和反向下游引物为has-mirna-21-5p-f/has-mirna-21-5p-r或u6-f/u6-r；

定量反应程序为：预变性：a.95℃30s；循环反应：b.95℃10s，c.60℃30s，b-c循环40次；溶解曲线：d.95℃15s，e：60℃60，f：s95℃15s；

数据处理：根据rt-qpcr数据，通过2^-(△△ct)法分析肝癌组和对照组血清外泌体中has-mirna-21-5p表达量；

结果与分析：由图7所示定量结果可见，has-mirna-21-5p在肝癌组和对照组中的表达存在显著差异，肝癌组血清外泌体中has-mirna-21-5p的相对表达量显著高于对照组血清外泌体中has-mirna-21-5p相对表达量(p<0.01)，人血清外泌体has-mirna-21-5p可作为肝癌诊断的生物标记物。

实施例6：肝癌诊断试剂盒

所述肝癌诊断试剂盒包括：实施例1所述的肝癌诊断相关的血清外泌体has-mirna-21-5p-f的定量扩增引物has-mirna-21-5p-f(序列如seqidno.17所示)和has-mirna-21-5p-r(序列如seqidno.18所示)、内参u6的正反向引物u6-f(序列如seqidno.19所示)和u6-r(序列如seqidno.20所示)，各引物均为100μm，10μl，还包括pcr技术常用的试剂，如trizol、氯仿、ddh2o、rtmastermix(forrealtime)，具体组成为：10mltrizol、10ml氯仿、10mlddh2o、1mlrtmastermix(forrealtime)；

上述pcr技术常用的试剂也可采用相应的市售产品；

所述肝癌诊断试剂盒通过检测血清外泌体mirna中has-mirna-21-5p的表达量来诊断肝癌。

以上是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>南京鼓楼医院

<120>一种与肝癌诊断相关的血清外泌体mirna标志物及其应用

<160>20

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aucgaauagucugacuacaacu22

<210>2

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

uagcuuaucagacugauguuga22

<210>3

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<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aucgaauagucugacuacaacu22

<210>4

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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ccctggctttactgctgtac20

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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cttcttccctcgcaagcc18

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atggattcgagaaaaccg18

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acgcagacatcgtcatcc18

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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tggcttctaaatgtgttacg20

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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cctggaagatggtgatgggat21

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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gcttcggcagcacatatactaaaat25

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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cgcttcacgaatttgcgtgtcat23