1.一种高效的绿木霉菌遗传转化方法,其步骤如下:
a、农杆菌的活化与扩大培养
将含有潮霉素抗性基因和目的基因的质粒载体,通过电击转化导入到农杆菌c58c1的感受态细胞的t-dna中,获得t-dna中携带有所述的质粒载体的阳性农杆菌菌株;将阳性农杆菌菌株,用lb固体培养基26-30℃培养48-60h;随后,挑取阳性农杆菌菌株到lb液体培养基中,26-30℃振荡培养48-60h;然后,4000rpm离心5min收集阳性农杆菌菌株;随后用im诱导培养基重悬浮阳性农杆菌菌株,并使悬浮液在600nm波长的吸光值至0.2-0.3,然后,28℃振荡培养6h,即得到扩大培养后的农杆菌菌液;
b、绿木霉菌分生孢子液的制备
将绿木霉菌用pda平板培养基、26-30℃活化培养至产生分生孢子,用灭菌水刮洗菌株菌面,并用三层擦镜纸过滤菌丝,得到分生孢子滤液;将分生孢子滤液4000-5000rpm离心5-10min,倒掉上清液,收集分生孢子;再用浓度0.6-0.8m的nacl溶液重悬浮分生孢子,并加入glucanex溶壁酶,加入量为每毫升nacl溶液加入15-20mg的glucanex溶壁酶;随后,30℃下、80rpm振荡培养2.5-4h;然后,将悬浮液4000rpm离心,弃滤液、得到分生孢子,再用浓度0.6-0.8m的nacl溶液清洗分生孢子1-2遍,并用单层擦镜纸过滤残渣,得到绿木霉菌分生孢子液,并调节其浓度至106个/ml;
c、农杆菌与绿木霉菌的共培养
将a步得到的农杆菌菌液和b步得到的绿木霉菌分生孢子液,等体积混合得到混合液;再将混合液均匀涂布于共培养平板培养基中,20-24℃暗培养68-76h,得到共培养物;
所述的共培养平板培养基,为每升im诱导培养基加入14-16克的琼脂粉,凝固而得;
d、转化子的初筛及稳定
在pda固体培养基中加入终浓度为140-160ug/ml的潮霉素抗生素,得到pda固体筛选培养基;
取pda固体筛选培养基,将其覆盖在c步得到的共培养物上,随后27-29℃培养至pda固体筛选培养基表面长出绿木霉菌菌株;长出的绿木霉菌菌株即为基因组中插入有农杆菌t-dna的绿木霉菌初筛转化子;
挑取出绿木霉菌初筛转化子,将其接种至另取的pda固体筛选培养基上,然后,27-29℃培养至pda固体筛选培养基表面长出绿木霉菌菌株;长出的绿木霉菌菌株即为稳定生长的、基因组中插入有农杆菌t-dna的绿木霉菌转化子。
2.根据权利要求1所述的一种高效的绿木霉菌遗传转化方法,其特征在于,所述的im诱导培养基由以下方法配制而得:
配制浓度为0.9-1.1m的mes生物缓冲液,并用naoh调ph到5.4-5.6;
往400ml的mes生物缓冲液中加入600ml的水;再加入1.5-1.6g的k2hpo4、1.1-1.3g的kh2po4、5-7g的mgso4·7h2o、2.5-3.5g的nacl、9-11mg的cacl2·2h2o、47-53mg的nh4no3、4.5-5.5g的甘油、4.5-5.5mg的znso4·7h2o、4.5-5.5mg的cuso4·5h2o、4.5-5.5mg的mnso4·h2o、4.5-5.5mg的na2moo4·7h2o、4.5-5.5mg的h3bo3、18-22mg的葡萄糖、1mg的feso4,得混合液;
将混合液121℃高温高压灭菌后,加入终浓度为200μm的乙酰丁香酮,即得。