本发明属于大肠菌群的检测技术领域，尤其是涉及一种大肠菌群快速检测试纸片。
背景技术：
大肠菌群是指在37℃下能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，主要来源于人畜粪便。大肠菌群在样品中的含量是检验食品卫生安全的重要指标。目前常用的检测方法有传统发酵法、纸片快速法、滤膜法、酶底物法、聚合酶链式法、荧光原位杂交法，但这些已知检测方法检测时间仍需24h-72h不等，对于工业废水、食品等生产检测而言，大肠菌群检测周期较长，导致大量样品滞留无法及时处理。
目前，现有技术中大肠菌群检测技术例如滤膜法、酶底物法，分子生物需检测法存在成本较高、操作较为繁琐的缺陷；另外，目前纸片法也是大部分领域检测较为常用的方法，但现有的纸片培养基存在需要低温保存的缺点，且现有的用于检测大肠菌群的试纸片其检测时间多数在18h左右出结果，对于野外紧急作业来说时间较长，不适宜应急使用；申请号201410131441.5的一种分光光度法快速检测大肠菌群的方法及应用的专利文件中公开了一种培养液加样培养60min-400min即可检测样品中的大肠菌群数值，但是该培养液需要配合分光光度计进行使用，且操作条件较高，不适合野外作业。
技术实现要素：
本发明提供一种大肠菌群快速检测试纸片，使该检测试纸片对待检测样品中的大肠菌群进行培养检测，检测时间仅需10-14小时即可得到准确检测结果，且该检测试纸片室温避光保存即可，无需低温保存，适合基层实验室与野外试验使用，同时其检测结果准确可靠。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种大肠菌群快速检测试纸片，该试纸片内含有培养基，所述的培养基由检测培养基液、ttc溶液和onpg溶液混合配制而成。
进一步地，所述的检测培养基液、ttc溶液和onpg溶液的体积比为100：0.5-2：0.5-2，优选100:1:1。
进一步地，所述的onpg溶液为质量浓度为0.1％的onpg溶液。
进一步地，所述的onpg溶液的配置如下：称取onpg0.1mg溶解于100ml灭菌蒸馏水中，经0.45μm水系微孔滤膜过滤除菌制得0.1％的onpg溶液，避光保存。
进一步地，所述的大肠菌群快速检测试纸片的制备方法，包括载体纸片制备、内包装袋、培养基配制、试纸片制作和试纸片包装，其特征在于：所述的培养基配制包括如下步骤：
(a)分别配制检测培养基液、ttc溶液和onpg溶液；
(b)将配制的检测培养基液、ttc溶液和onpg溶液混合均匀，避光保存，即得到所述的培养基。
进一步地，步骤(b)中，所述的检测培养基液、ttc溶液和onpg溶液的体积比为100：0.5-2：0.5-2，优选100:1:1。
进一步地，步骤(a)中，所述的onpg溶液的配置如下：称取onpg0.1mg溶解于100ml灭菌蒸馏水中，经0.45μm水系微孔滤膜过滤除菌制得0.1％的onpg溶液，避光保存。
进一步地，步骤(a)中，所述的检测培养基液配置如下：将50-90μl2％溴甲酚紫溶液、4g胰蛋白胨、0.5g乳糖、0.5gd-甘露醇、0.75gnacl、0.02g十二醇硫酸钠、0.01g脱氧胆酸钠、0.5g琼脂加入到100ml蒸馏水中，ph6.9-7.1，115℃，15min灭菌后待用；所述的ttc溶液的配置如下：称取2mgttc加入到100ml灭菌蒸馏水中溶解，经0.45μm水系微孔滤膜过滤除菌制得2％溶液，避光保存备用。
大肠菌群快速检测试纸片检测大肠菌群的方法，所述的方法为将无菌操作取样品匀液，滴加到检测试纸片上，37℃培养10-14h，纸片上有红色斑点并伴有黄晕的菌落记为阳性菌，阳性菌个数即为每毫升样品匀液中所含大肠菌群数。
进一步地，所述的样品匀液的制备具体操作为：
固体和半固体样品：称取25g样品放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌三角瓶中，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成质量：体积为1g:10l的样品匀液；调节其ph在6.9-7.1之间；
液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀制成体积比为1:10的样品匀液；调节其ph在6.9-7.1之间；
用1ml无菌吸管或微量移液器吸取样品匀液1ml，沿管壁缓缓注入9ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中，振摇试管使其混合均匀，制成1:100的样品稀释匀液。
进一步地，所述的方法在进行检测时，首选无菌操作取样品稀释匀液1ml，滴加到检测试纸片上，37℃培养10-14h；之后观察纸片上的红色斑点并伴有黄晕的菌落个数即为每毫升样品稀释匀液中所含大肠菌群数；当使用样品稀释匀液检出限较低时，即低于10cfu/ml时，可直接取样品匀液1ml滴加到检测试纸片上，37℃培养10-14h；观察纸片上的红色斑点并伴有黄晕的菌落个数即为每毫升样品匀液中所含大肠菌群数，以保证检测精度。
一种大肠菌群快速检测试纸片在水质监测、生物、食品、卫生方面的大肠菌群的快速检测方面中的应用。
在本发明的技术方案中，培养基成分中不仅含有促进大肠菌群生长的蛋白胨、乳糖及氯化钠这些基本成分，还添加了可以增加细胞膜通透性的脱氧胆酸钠及细菌培养剂甘露醇，可以提高细胞的渗透压，同时还可促进乳糖代谢；调节ph到适宜大肠菌群培养生产的ph；多组分共同作用，使得大肠菌群的发酵生长速度加快，进而缩短了检测时间。
本发明中的检测试纸片在进行检测使用时，以溴甲酚紫和ttc作为指示剂，其大肠菌群将乳糖进行发酵可以产酸进而使得溴甲酚紫指示剂变黄；同时，由于甲酸脱氢酶的作用，使得甲酸分解产生co2和h2，这个过程中脱掉的氢和ttc(2，3，5－三苯基氯化四氮唑)反应产生ttf(三苯甲臜)，因此检测试纸片上会有红色沉淀的菌落生成并伴有黄晕。同时，培养基中的onpg(邻硝基苯-β-d-吡喃半乳糖苷)可被β-半乳糖苷酶水解为半乳糖和黄色的邻-硝基苯酚(onp)。大肠菌群为发酵乳糖的菌群，均含有β-半乳糖苷酶，onpg可迅速进入到大肠菌群细胞内，在细胞内被β-半乳糖苷酶水解，释放出邻-硝基苯酚，进而呈现黄色，辅助溴甲酚紫和ttc指示剂显色，使得反应和显色更为迅速，进而缩短检测所需要的时间。
若成品试纸片不加ttc溶液，大肠菌群培养相应的时间之后只产生黄色菌落；若加入ttc溶液，则会特征，即其红色菌落周边会有黄晕产生，以便于计算与观察。
本发明具有的优点和积极效果是：
1、本发明的大肠菌群快速检测试纸片，其添加了可以增加细胞膜通透性的脱氧胆酸钠及细菌培养剂甘露醇，提高细胞的渗透压，同时还可促进乳糖代谢；使得大肠菌群的发酵生长速度加快，增加onpg可迅速进入到大肠菌群细胞内，在细胞内被β-半乳糖苷酶水解，释放出邻-硝基苯酚，进而呈现黄色，辅助溴甲酚紫和ttc指示剂显色，使得反应和显色更为迅速，从而而缩短检测所需要的时间，培养10-14小时即可得到准确检测结果；
2、本发明的大肠菌群快速检测试纸片经实验验证，常温避光保存即可保存4-5个月，满足基层实验室以及野外使用的的条件；
3、本发明的大肠菌群快速检测试纸片内含溴甲酚紫、ttc和onpg，在进行检测时，其菌落变为伴有黄晕的红色沉淀，便于观察与计算。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作详细说明。
一种大肠菌群快速检测试纸片，该试纸片内含有培养基，所述的培养基由检测培养基液、ttc溶液和onpg溶液混合配制而成。
其中，所述的检测培养基液、ttc溶液和onpg溶液的体积比为100：0.5-2：0.5-2，优选100:1:1。所述的onpg溶液为质量浓度为0.1％的onpg溶液，配置如下：称取onpg0.1mg溶解于100ml灭菌蒸馏水中，经0.45μm水系微孔滤膜过滤除菌制得0.1％的onpg溶液，避光保存。
上述的大肠菌群快速检测试纸片的制备方法，包括载体纸片制备、内包装袋、培养基配制、试纸片制作和试纸片包装，具体为：
1)载体纸片制备：将中速定性滤纸剪裁为4.5cm*4.5cm规格，且高压灭菌后于50℃恒温干燥后备用。
2)内包装袋：将聚丙烯塑料薄膜袋压合成5cm*5cm的联袋，消毒灭菌后备用。
3)培养基配制：(a)分别配制检测培养基液、ttc溶液和onpg溶液；(b)将配制的检测培养基液、ttc溶液和onpg溶液按照100:0.5-2:0.5-5的体积比混合均匀，避光保存，即得到所述的培养基。其中，检测培养基液配置为：将50-90μl2％溴甲酚紫溶液、4g胰蛋白胨、0.5g乳糖、0.5gd-甘露醇、0.75gnacl、0.02g十二醇硫酸钠、0.01g脱氧胆酸钠、0.5g琼脂加入到100ml蒸馏水中，ph6.9-7.1，115℃，15min灭菌后待用；所述的ttc溶液的配置为：称取2mgttc加入到100ml灭菌蒸馏水中溶解，经0.45μm水系微孔滤膜过滤除菌制得2％溶液，避光保存备用；所述的onpg溶液的配置为：称取onpg0.1mg溶解于100ml灭菌蒸馏水中，经0.45μm水系微孔滤膜过滤除菌制得0.1％的onpg溶液，避光保存；在进行混合时，检测培养基液冷却到45-50℃再加入ttc溶液与onpg溶液进行混合，以防止琼脂凝固影响混合。
4)试纸片制作：在无菌的环境中，将步骤1)的载体纸片放置于已灭菌的烧杯内，加入45℃-55℃步骤3)中制得的培养基淹没试纸片，浸泡1.5-2min，使得培养基吸附在试纸片内，之后使用无菌风吹制30-40min，之后再放入55℃的烘箱内烘干2-2.5h，得到干燥的试纸片。
5)试纸片包装：将步骤4)中得到的干燥的试纸片装入步骤2)中得到的无菌的内包装袋内并封口，之后装入铝铀袋内避光保存即可。
大肠菌群快速检测试纸片检测大肠菌群的方法，所述的方法具体操作为：
1、样品匀液制备
固体和半固体样品：称取25g样品放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌三角瓶中，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成质量：体积为1g:10l的样品匀液；调节其ph在6.9-7.1之间；
液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀制成体积比为1:10的样品匀液；调节其ph在6.9-7.1之间；
用1ml无菌吸管或微量移液器吸取样品匀液1ml，沿管壁缓缓注入9ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中，振摇试管使其混合均匀，制成1:100的样品稀释匀液。
2、样品检测
(a)无菌操作取样品稀释匀液1ml，滴加到检测试纸片上，37℃培养10-14h，观察纸片上有红色斑点并伴有黄晕的菌落记为阳性菌，阳性菌个数即为每毫升样品稀释匀液中所含大肠菌群数；
(b)当样品稀释匀液检出的阳性菌低于10时，直接取样品匀液1ml滴加到检测试纸片上，37℃培养10-14h；观察纸片上的红色斑点并伴有黄晕的菌落个数即为每毫升样品匀液中所含大肠菌群数，以保证检测精度。
一种大肠菌群快速检测试纸片在水质监测、生物、食品、卫生方面的大肠菌群的快速检测方面中的应用。
使用本发明的大肠菌群快速检测试纸片和发酵法分别对不同样品中的大肠菌群进行检测，得到实验例1到实验例6的检测实验，其中，检测培养基液、ttc溶液和onpg溶液的混合比为100:1:1。
实验例1：
取无公害鸡蛋20个，分别使用国标发酵法和该检测试纸片同时进行检测样品，其中国标发酵法检测时间为48小时，检测试纸片检测时间为10、12和14小时，其检测结果如表1所示；
表1无公害鸡蛋中大肠菌群检测结果
由以上实验数据可知，分别对比1-20号每组的检测数据，使用本发明的大肠菌群快速检测试纸进行检测测得的大肠菌群数量，对比国标法检测结果，除16和17号与国标法有较大的差异，其他几组的检测数据皆相差不大，且由本实验数据可知，检测试纸片10-14h即可测的最终的结果，其所需时间短，且计算方便；相对比国标法(发酵法)大大节省了检测时间；
从而本发明的检测试纸片进行检测的检测结果均在国标法检测结果可信范围内，说明本发明检测法较国标法具有一定的可信性，可作为大肠菌群检测的有效检测方法。
由于国标法检测步骤繁琐、检测时间较长；本发明方法不仅的操作简单、结果准确，且其使用便于携带的检测试纸片进行检测，其适用范围广，可以满足基层实验室以及野外使用的各种需求，在未来快速检测领域具有较好的应用前景。
实验例2：
取非发酵豆制品15个，使用国标发酵法和该检测试纸片同时进行检测样品，其中国标发酵法检测时间为48小时，检测试纸片检测时间为10、12和14小时，其检测结果如表2所示；
表2非发酵性豆制品中大肠菌群检测结果
由以上实验数据可知，分别对比1-15号每组的检测数据，使用本发明的大肠菌群快速检测试纸进行检测测得的大肠菌群数量，对比国标法检测结果，均无较大的差异，且由本实验数据可知，检测试纸片10-14h即可测的最终的结果，其所需时间短，且计算方便；相对比国标法(发酵法)大大节省了检测时间；
从而本发明的检测试纸片进行检测的检测结果均在国标法检测结果可信范围内，说明本发明检测法较国标法具有一定的可信性，可作为大肠菌群检测的有效检测方法。
由于国标法检测步骤繁琐、检测时间较长；本发明方法不仅的操作简单、结果准确，且其使用便于携带的检测试纸片进行检测，其适用范围广，可以满足基层实验室以及野外使用的各种需求，在未来快速检测领域具有较好的应用前景。
实验例3：
取饼干15个，同时使用国标发酵法和该检测试纸片进行检测样品，其中国标发酵法检测时间为48小时，检测试纸片检测时间为10、12和14小时，其检测结果如表3所示；
表3饼干中大肠菌群检测结果
由以上实验数据可知，分别对比1-15号每组的检测数据，使用本发明的大肠菌群快速检测试纸进行检测测得的大肠菌群数量，对比国标法检测结果，均无较大的差异，且由本实验数据可知，检测试纸片10-14h即可测的最终的结果，其所需时间短，且计算方便；相对比国标法(发酵法)大大节省了检测时间；
从而本发明的检测试纸片进行检测的检测结果均在国标法检测结果可信范围内，说明本发明检测法较国标法具有一定的可信性，可作为大肠菌群检测的有效检测方法。
由于国标法检测步骤繁琐、检测时间较长；本发明方法不仅的操作简单、结果准确，且其使用便于携带的检测试纸片进行检测，其适用范围广，可以满足基层实验室以及野外使用的各种需求，在未来快速检测领域具有较好的应用前景。
实验例4：
取矿泉水15个，同时使用国标发酵法和该检测试纸片同时进行检测样品，其中国标发酵法检测时间为48小时，检测试纸片检测时间为10、12和14小时，其检测结果如表4所示；
表4矿泉水中大肠菌群检测结果
由以上实验数据可知，分别对比1-15号每组的检测数据，使用本发明的大肠菌群快速检测试纸进行检测测得的大肠菌群数量，对比国标法检测结果，均无较大的差异，且由本实验数据可知，检测试纸片10h即可测的最终的结果，其所需时间短，且计算方便；相对比国标法(发酵法)大大节省了检测时间；
从而本发明的检测试纸片进行检测的检测结果均在国标法检测结果可信范围内，说明本发明检测法较国标法具有一定的可信性，可作为大肠菌群检测的有效检测方法。
由于国标法检测步骤繁琐、检测时间较长；本发明方法不仅的操作简单、结果准确，且其使用便于携带的检测试纸片进行检测，其适用范围广，可以满足基层实验室以及野外使用的各种需求，在未来快速检测领域具有较好的应用前景。
实验例5：
取食堂餐具30个，同时使用国标发酵法和该检测试纸片同时进行检测样品，其中国标发酵法检测时间为48小时，检测试纸片检测时间为10、12和14小时，其检测结果如表5所示；
表5食堂餐具中大肠菌群检测结果
由以上实验数据可知，分别对比1-15号每组的检测数据，使用本发明的大肠菌群快速检测试纸进行检测测得的大肠菌群数量，对比国标法检测结果，均无较大的差异，且由本实验数据可知，检测试纸片10-14h即可测的最终的结果，其所需时间短，且计算方便；相对比国标法(发酵法)大大节省了检测时间；
从而本发明的检测试纸片进行检测的检测结果均在国标法检测结果可信范围内，说明本发明检测法较国标法具有一定的可信性，可作为大肠菌群检测的有效检测方法。
由16和17号的对比数据可知，当待测样品所含的阳性菌数较多时，因纸片面积有限，技术较为困难，故当检测所含含量较多的样品时，需要参考国标法；但是对于大多数的工业污水以及食品等有要求的样品来说，该检测试纸片可以满足其检测需求。
由于国标法检测步骤繁琐、检测时间较长；本发明方法不仅的操作简单、结果准确，且其使用便于携带的检测试纸片进行检测，其适用范围广，可以满足基层实验室以及野外使用的各种需求，在未来快速检测领域具有较好的应用前景。
实验例6：
取工业污0水10个，同时使用国标发酵法和该检测试纸片同时进行检测样品，其中国标发酵法检测时间为48小时，检测试纸片检测时间为10、12和14小时，其检测结果如表6所示；
表6工业污水中大肠菌群检测结果
由以上实验数据可知，分别对比1-10号每组的检测数据，使用本发明的大肠菌群快速检测试纸进行检测测得的大肠菌群数量，对比国标法检测结果，均无较大的差异，结果可信，且由本实验数据可知，检测试纸片10-14h即可测的最终的结果，其所需时间短，且计算方便；相对比国标法(发酵法)大大节省了检测时间；
从而本发明的检测试纸片进行检测的检测结果均在国标法检测结果可信范围内，说明本发明检测法较国标法具有一定的可信性，可作为大肠菌群检测的有效检测方法。
由于国标法检测步骤繁琐、检测时间较长；本发明方法不仅的操作简单、结果准确，且其使用便于携带的检测试纸片进行检测，其适用范围广，可以满足基层实验室以及野外使用的各种需求，在未来快速检测领域具有较好的应用前景。
取存放不同时间的检测试纸片对同一工业污水样品进行检测，用以检查不同存放时间下的检测试纸片是否有效，判断其检测结果是否准确，具体操作如实验例7所示：其中，在制备检测试纸片时，所述的检测培养基液、ttc溶液和onpg溶液的体积混合比为100:1:1。
实验例7：
同时取该检测试纸片9张，分别标号1-9，其常温状态下避光存放时间分别为15天、30天、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月和8个月；同时对同一工业污水样品进行检测，判断其检测试纸片是否有效，其检测结果表7如下所示：
表7不同存储时间段的检测试纸片的检测数据
由以上实验数据可知，检测试纸片在常温避光保存的条件下，4-5个月内可以正常使用，存放超过6个月之后会导致检测误差较大。因此，该检测试纸片在4-5个月，正常避光存放，无需冷藏低温保存，便于带出野外使用。
按照本发明的制备方法制备对比例的检测试纸片，其中不添加onpg溶液，其他制备过程与本发明中完全一致，制得对比例的检测试纸片；将本发明和对比例的检测试纸片分别对同一工业污水进行检测，通过不同的检测时间对比，比较其得到准确结果的所需时间，具体试验如实验例8所示，其中，在制备时检测试纸片时，所述的检测培养基液、ttc溶液和onpg溶液的混合比为100:1:1。
实验例8：
以本发明的方法制备不含有onpg的检测试纸片，作为对比例，除不添加onpg溶液，其他制备过程与本发明的制备过程完全一致；取对比例和本发明实施例的检测试纸片，对同一工业污水进行检测，记录对比例和本发明的检测试纸片再进行检测大肠菌群时不同检测时间所检测到的数值，其实验数据如表8所示：其中，在制备时检测试纸片时，所述的检测培养基液、ttc溶液和onpg溶液的混合比为100:1:1。
表8检测时间数据
由表8中的检测数据，分别对比6组中的对比例和本发明实施例中不同检测时间所检测出的大肠菌群的个数，可知，本发明的检测试纸片进行检测大肠菌群时最短需要10h，正常检测时间10-14h即可检测得到准确数值；而对比例中最短则需要14h，正常检测时间为16-18h得到准确检测数值；由此可知，添加有onpg配合溴甲酚紫和ttc指示剂进行显色，可以使得反应和显色更为迅速，进而缩短检测所需要的时间。
根据不同的检测培养基液、ttc溶液和onpg溶液的体积比制备不同的检测试纸片，分别为实施例1，实施例2，实施例3，实施例4其体积比分别为100:0.5:0.5,100:1:1,100:1.5:1.5,100:2:2，使用实施例1、实施例2、实施例3和实施例4的检测试纸片分别对同一样品的工业污水进行检测，观察其形成的菌落的颜色变化是否明显，得到如表9所示的检测结果：
表9不同实施例的检测现象
由表9的结果可知，当检测培养基液、ttc溶液和onpg溶液的体积比为100:1:1、100:1.5:1.5和100:2:2时，其显色均为清晰可见，故此范围的含量均可，考虑到实际成本，优选体积比100:1:1进行制备。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。