配对的抗MRJP2单克隆抗体及其在定性或定量检测MRJP2中的应用的制作方法

本发明涉及蜂王浆主蛋白2(mrjp2)单克隆抗体的制备及其应用，尤其涉及配对的mrjp2单克隆抗体的制备，本发明进一步涉及用所制备的配对的mrjp2单克隆抗体构建的检测mrjp2的elisa检测试剂盒和胶体金免疫检测试纸及其在定量或定性检测mrjp2中的应用，属于mrjp2的定性和定量检测领域。
背景技术：
：蜂王浆是一种具有滋补保健和延年益寿功能的天然功能性蜂产品。蜂王浆成分复杂，营养丰富，其中蛋白质含量为12.0％～15.0％。蜂王浆主蛋白(mrjps)是蜂王浆中一类具有重要功能的家族蛋白，具有为蜜蜂幼虫和蜂王提供营养、参与决定蜜蜂级型分化及较强的抗菌活性等功能。目前已经通过多种分子生物学途径鉴定了mrjps中的10个成员，其中蜂王浆主蛋白2(mrjp2)为一种弱碱性的糖蛋白，在蜂王浆主蛋白中的含量为16％左右。有报道显示，mrjp2可以刺激小鼠巨噬细胞释放肿瘤坏死因子，基于此提出了mrjp2抗癌应用的潜在生理价值。也有报道显示，mrjp2是蜂王浆中的主要过敏原。蜂王浆不易保存，极易变质。已有报道显示，蜂王浆的品质和其新鲜度紧密相关。因此，实现对mrjp2的定量或者定性检测，将有利于mrjp2抗癌、抑菌等应用、蜂王浆新鲜度检测等提供支持。然而，目前对mrjp2的定量或者定性检测报道极少。免疫分析方法相对于仪器检测方法，具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员要求低等特点，亟待需要开发对mrjp2蛋白的特异性好、灵敏度高的蜂王浆主蛋白2单克隆抗体，以实现mrjp2蛋白的高效检测。技术实现要素：本发明的目的之一是提供针对mrjp2蛋白的特异性好、灵敏度高的配对的mrjp2单克隆抗体；本发明的目的之二是将所述的mrjp2单克隆抗体应用于mrjp2蛋白的定性或定量检测；本发明的目的之三提供一种定量检测检测样品中mrjp2蛋白含量的elisa试剂盒；本发明的目的之四提供一种定性检测样品中是否含有mrjp2蛋白的胶体金免疫检测试纸。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明将mrjp2的全序列经过跨膜区分析、信号肽分析、疏水性分析、无序序列分析、抗原性分析、同源性分析和结构域分析，最终选定seqidno.1所述氨基酸序列为抗原序列在大肠杆菌中进行表达制备抗原。本发明进一步将所制备的抗原纯化后免疫balb/c小鼠，采用细胞融合技术制备融合细胞；进行半固体和液体融合获得21株阳性细胞株；挑选其中的10株进行一亚，一亚检测后筛选出多株二亚，再经过三轮的亚克隆；经过与其它蜂王浆主蛋白的重组蛋白和天然蛋白交叉反应检测，去除有交叉反应的细胞株，最终获得6株mrjp2特异性融合细胞株，挑选了其中亲和力最高的3株进行后续抗体表位检测和配对实验，根据识别不同抗原表位的抗体配对检测进行下一步的配对初筛，最终根据识别不同抗原表位的抗体配对检测、标准曲线绘制及样本测定结果发现，1f21b4(以下简称为1f2)和1b73c4(以下简称为1b7)这对配对的抗体有较好的线性关系且灵敏度高，故最终确定1f2和1b7用于构建检测mrjp2的elisa试剂盒以及胶体金免疫检测试纸。本发明将分泌1f2和1b7的杂交瘤细胞系分别提交提交专利认可的机构进行保藏；其中，分泌单克隆抗体1f2的杂交瘤细胞株的微生物保藏编号为：cgmccno.17296；分类命名为：小鼠杂交瘤细胞。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2019年2月18日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。分泌单克隆抗体1b7的杂交瘤细胞株的微生物保藏编号为：cgmccno.17297；分类命名为：小鼠杂交瘤细胞。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2019年2月19日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明进一步提供了一种采用elisa法定量检测mrjp2的酶联免疫试剂盒，包括：抗mrjp2的一抗，生物素标记的抗mrjp2的二抗，标准品，辣根过氧化物酶标记亲和素，生物素标记抗体稀释液，辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，样本稀释液，浓洗涤液，底物溶液和终止液；其中，所述的一抗是抗mrjp2的单克隆抗体1f2，所述的二抗是抗mrjp4的单克隆抗体1b7；或者，所述的一抗是抗mrjp4的单克隆抗体1b7，所述的二抗是抗mrjp4的单克隆抗体1f2。本发明试剂盒检测mrjp2含量的工作原理或使用方法如下：用纯化的抗体包被微孔板制成固相载体，向包被抗mrjp2抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗mrjp2抗体、hrp标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物tmb显色。tmb在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中的mrjp2含量呈正相关；用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(od值)，计算样本浓度。应用本发明酶联免疫试剂盒采用双抗体夹心elisa法定量测定样本中mrjp2含量的结果表明，其检测范围为3.125-200ng/ml，检测灵敏度为4.529ng/ml。本发明进一步提供了一种快速定性检测mrjp2的胶体金免疫检测试纸，包括：金标垫，含有检测线和质控线的nc膜，样本垫，吸水垫和检测底板；其中，所述的nc膜含有一条检测线和一条质控线；所述的检测线由单克隆抗体1f2和1b7组成，所述的质控线由羊抗鼠igg抗体组成。所述的金标垫以及含有检测线和质控线的nc膜可以按照胶体金免疫试剂盒的常规制备方法制备得到。作为参考，本发明提供一种金标垫的制备方法，包括：(1)将胶体金溶液与单克隆抗体1f2和1b7结合得到胶体金－抗体结合物原液；(2)将胶体金－抗体结合物溶液稀释后均匀加在玻璃纤维膜上，烤干，即得金标垫。本发明进一步对金标垫以及含有检测线和质控线的nc膜的制备方法中的各项参数进行了优化，通过优化试验发现，采用下述参数能够有效的提升检测效果：1b74μg/ml包被，检抗1f21:500稀释的条件最佳本发明进一步提供了一种应用本发明胶体金免疫检测试纸定性检测样品中是否含有mrjp2的方法，包括：(1)将样品加到试剂盒样本垫的加样孔中；(2)若样本为阳性，加样后在t区出现一条紫红色条带；若样本为阴性，则t区不会出现紫红色条带；无论样本中是否有mrjp2蛋白存在，c区都会出现一条紫红色条带。本发明提供的检测mrjp2的胶体金免疫检测试纸具有方便、快速、灵敏等特点，适用于现场大批量样本检测。应用本发明酶联免疫检测试剂盒定量测定样本中mrjp2含量的结果表明，本发明酶联免疫检测试剂盒的检测范围为3.125-200ng/ml，检测灵敏度为4.529ng/ml；热破坏试验表明，热稳定性4天下降均＜30％，热稳基本合格；精密度实验结果表明，批内批间cv值均小于10％；特异性实验表明，本发明酶联免疫检测试剂盒以及胶体金免疫检测试纸，能够特异性检测mrjp2，不与其它相关蛋白(mrjp1、mrjp3、mrjp4以及mrjp5)产生交叉反应，而且具有方便、快速、灵敏等特点，适用于现场大批量样本检测。附图说明图1上清验证內源样本的western-boltting实验结果；所有泳道：蜂王浆样本15μl/6×loadingbuffer；泳道1-9：杂交瘤细胞培养上清；二抗:igg(h+l)-hrp(1:5000)；marker：180/130/95/72/55/45/35/25/17/10(kda)。图2抗体1b7、1f2和1e5。腹水纯化后的sds检测结果。图3抗体1f2的效价检测结果。图4抗体1b7的效价检测结果。图5抗体1e5的效价检测结果。图6抗体wb验证蜂王浆样本结果；所有泳道：蜂王浆样本15μl/6×loadingbuffer；泳道1：mrjp2小鼠血清1:1000；泳道2：1f5上清；泳道3：1e5抗体1/500；泳道4：1g53f3抗体1/500；泳道5：1f2抗体1/500；泳道6：1b7抗体1/500；泳道7：5h113f2抗体1/500；二抗：igg(h+l)-hrp(1:5000)；marker：180/130/95/72/55/45/35/25/17/10(kda)。图7抗体1f2的特异性检测结果。图8抗体1b7的特异性检测结果。图9不同检测条件的初步测样的标准曲线。图10是批内批间差实验标准曲线。图11本发明制备的mrjp2胶体金试纸测样结果展示。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。实施例1蜂王浆主蛋白2的抗原的制备与纯化一、蜂王浆主蛋白2的抗原序列的选择majorroyaljellyprotein2基因编码452个氨基酸，无跨膜区，整体蛋白亲水性较好，且序列区别于mrjps家族其他同源性较高蛋白。经过跨膜区分析、信号肽分析、疏水性分析、无序序列分析、抗原性分析、同源性分析和结构域分析，最终选定seqidno.1所述氨基酸序列为抗原序列在大肠杆菌中进行表达制备抗原。二、抗原的制备和纯化小量表达1.将测序鉴定正确的重组质粒转化表达宿主。2.挑取含重组质粒的单菌落至3mllb(含抗生素)中37℃过夜培养。3.取30μl过夜培养菌液加入到含3mllb培养基中，37℃震荡培养至od600约0.6；剩余的过夜培养液添加甘油到20％置于-80℃，作为工作种子备用。4.取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入iptg诱导剂至终浓度0.5mm作为实验组，两组继续37℃震荡培养3h。5.取菌体1ml，离心12000g×30s收获沉淀，用100μl1％sds重悬，混匀，100℃10min。12000g离心10min，取上清进行sds-page检测分析。蛋白表达与破菌检测1.取保存于-80℃的菌种20μl转接入20ml液体lb培养基(含相应抗生素)。2.取2ml过夜培养菌液加入到含2000mllb培养基中，37℃震荡培养至od600约0.6，降低温度到30℃。3.加入iptg诱导剂至终浓度0.5mm作为实验组，30℃继续震荡培养3h。4.收集发酵液，6000g离心10min收集菌体。将菌体悬浮于40ml预冷的nta-0(tris-hcl20mmol/l(ph7.9)，nacl0.5mol/l，甘油10％)缓冲液中。5.冰浴超声波破碎细菌，控制功率为300w，超声4s，暂停4s，超声90次。6.20000g，4℃离心30min，收集上清以及沉淀。7.取少量样品进行sds-page检测；剩余上清及沉淀至于0-7℃备用。抗原mrjp2在大肠杆菌中重组表达后，放大纯化的sds结果。蛋白浓度为2mg/ml，分子量大小为38kd，纯度为80％。蛋白纯化1.将ni-nta树脂装入合适的层析柱，用10倍柱床体积的nta-0buffer冲洗。2.将样品加到层析柱中，流速控制在0.5ml/min左右，收集穿透部分。3.层析用10倍柱床体积的nta-0buffer冲洗，流速控制在1ml/min左右。4.分别用10倍柱床体积的nta-20，nta-60，nta-200，nta-500buffer洗脱(注：nta-20、nta-60、nta-200、nta-500溶液分别为nta-0溶液含咪唑20mmol/l、60mmol/l、200mmol/l、500mmol/l)，流速控制在1ml/min左右，收集各洗脱峰。5.sds-page检测各组分。6.纯度达到要求的组分，至于透析带中，4℃以1×pbs透析(换液2次)。7.4℃超滤浓缩透析产物。以本实施例制备得到的抗原，作为后续实施例中的抗原使用。实施例2蜂王浆主蛋白2的单克隆抗体的制备一、小鼠免疫及血清效价评价免疫balb/c小鼠8周左右成年雌性，抗原与等体积完全佐剂(首免)和不完全佐剂(加强免疫)混合并进行乳化，充分混合至油包水状态进行皮下多点免疫，2-3次加强免疫，每次免疫间隔周期2周，之后进行效价检测，高于1:10000后1周内进行腹腔冲击，直接将免疫剂量的抗原溶于pbs中，具体免疫程序见表1。表1小鼠免疫程序免疫后效价检测采用间接法检测血清效价，具体方法如下：1)包被：将抗原按1μg/ml浓度包被96孔板每孔50μl，37℃2h或4℃过夜；2)封闭：2％bsa或者5％的脱脂牛奶封闭液200μl/孔，37℃1h或4℃过夜，tbst洗4遍；3)一抗：将之前已经准备好的小鼠血清用样稀或者pbs按一定稀释倍数进行检测；4)37℃温育1h后洗板4次，加二抗，用酶稀按1:10000稀释jackson二抗，100μl/孔，37℃温育1h；5)洗板4次后显色：加底物溶液100μl/孔，37℃恒温箱放置5～10min；6)终止反应、比色：加30μl/孔终止液，颜色变黄；用酶标仪测定450nm的吸光值。血清效价结果效价检测结果见表2。表2血清效价检测结果二、细胞融合末次冲击3天后，摘除眼球处死，并收集阳性对照血，取出脾脏，制备成单细胞悬液，然后取出处于对数期的sp2/0细胞处理后，与脾细胞以一定比例混合(1:5-1:10)，50％peg1450作用1min，以基础培养基dmem稀释终止，低速离心后，再用含20％胎牛血清的hat培养基轻轻悬浮并混匀，按照2×107/板铺至预先准备好的饲养层细胞板里，置于5％co2，37℃下培养。具体步骤如下：脾细胞：小鼠解剖取出免疫好的脾脏，并分离脾脏中的淋巴细胞；1.在超净工作台中准备一个1.5mlep管，加入1ml无血清培养基，两个3.5cm培养皿，加入2ml无血清培养基，两支15ml离心管，其中一支加入10ml无血清培养基，手术器械(高压湿热灭菌)，绢网，移液器(1ml)，枪头。2.取已经免疫的balb/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过断颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中5min，放蜡盘上固定后剪开脾脏上皮肤，用镊子取出脾脏，放在1.5ml离心管中。3.将脾脏转移到超净台里的其中一个3.5cm培养皿中，摘除脾脏上面的脂肪和结缔组织，洗一遍，铺开一张绢网放在培养皿盖子上，将脾脏轻轻挤破，放在绢网中间位置。将绢网两次对折，用移液器吸取无血清培养基轻轻吹散，用研磨棒研磨，使脾脏内淋巴细胞透过绢网制成单细胞悬液，收集单细胞悬液于15ml离心管中，1000rpm离心5min。准备sp2/0：取瘤分离制备单细胞悬液后，1000rpm，离心5min后弃掉上清，10-20mldmem(根据瘤子大小而定)重悬并混匀，利用淋巴细胞分离液进行分离，其与dmem体积比为1:1，缓慢滴加分离液于重悬的细胞中，然后2500rpm，离心15min，后小心放置到超净工作台上，用移液枪将中间一层乳白色的晕圈转移至新的离心管中(事先准备好30mldmem于管中)，1000rpm，离心5min，最后弃掉上清，收集细胞于10cm培养皿中，用10％的胎牛血清调整状态并扩大培养，通常一只小鼠的瘤子当天可制备3-5皿，第二天离心扩大到30皿，然后冻存30-35管。准备融合时，按下列步骤进行：a.第一天复苏；b.第二天根据融合的数量传代，5皿/1个融合；c.约两天后观察细胞状态，是否达到对数期，然后收集细胞准备融合。饲养层细胞准备：将健康的balb/c小鼠在无菌条件下取出其脾脏，并用含20％胎牛血清的hat培养基制成单个脾细胞悬液，然后根据铺板数量，预先将其铺入到96孔板中。终止液：基础培养基dmem20ml预先放入37℃水浴锅中孵育。三、细胞建株融合板检测待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测(检测方法为elisa方法)在elisa质控合格(即阴性对照<0.2，阳性对照>1.0)后挑选阳性孔(一般od450≥0.5)作亚克隆。1.检测方法效价检测-间接elsia(1)抗原包被：用包被液稀释抗原到1μg/ml，100μl/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中，4℃放置过夜。(2)洗涤：次日弃掉孔内的液体，洗涤液洗3次。(3)封闭：加l50μl/孔封闭液，室温放置0.5h。(4)洗涤：用洗涤液洗3次。(5)加待测样品(一抗)：细胞培养上清原液，其中抗血清做阳性对照，空白血清做阴性对照，稀释好之后均每孔100μl，37℃温育1h；(6)洗涤：用洗涤液洗3次；(7)加酶标抗抗体：加入hrp标记羊抗鼠igg(1:10000，酶稀稀释)，100μl/孔，37℃孵育40min；(8)洗涤：用洗涤液洗5次，蒸馏水洗2次；(9)显色：加新鲜配制的底物溶液100μl/孔，室温暗处放置5-30min；(10)终止反应、比色：加50μl/孔终止液。颜色变黄；用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值。2.细胞融合检测结果进行半固体和液体融合共10板，一共获得识别内源样本的阳性细胞株21株；其中效价值od>2.0的有10株；od在1.0-2.0之间的有6株。筛选mrjp2特异性细胞株经过与重组蛋白和天然蛋白交叉反应检测，去除有交叉反应的细胞株，最终获得12株mrjp2融合细胞株。根据表3的部分结果可见，mrjp2与其余四种重组蛋白共有8株交叉。表3mrjp2特异性细胞株筛选结果mrjp2与重组蛋白筛完交叉后，选取测试结果较好的12株与天然蛋白mrjp1、mrjp5测交叉，交叉测定结果见表4。表4交叉测定结果包1μg/ml天然mrjp1(单)包1μg/ml天然mrjp50.00650.03890.00990.06050.00840.03520.04410.01850.31050.0210.00910.00520.00510.41170.01030.00870.00760.00650.03520.1905由表4可见，mrjp2与天然蛋白mrjp1、mrjp5有2株交叉，故mrjp2现剩余10株。亚克隆方法及检测从上述结果中挑出融合板中检测阳性值高的孔进行有限稀释，以每板60％的单克隆孔数量计数做亚克隆，每次均挑取阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，每次亚克隆5-7天即可进行elisa检测，直到最终筛选出能稳定分泌阳性抗体的单克隆细胞株进行扩大培养。a.第一次亚克隆检测表5第一次亚克隆结果b.第二次亚克隆结果表6第二次亚克隆结果mrjp2阳性较多，融合检测后筛选出21株阳性，根据检测结果挑选其中的10株进行一亚，一亚检测后筛选出8株二亚，二亚检测后挑选阳性克隆6株进行扩大，经过三轮的亚克隆，最终定株杂交瘤细胞株6株，挑选了其中亲和力较高的1株制备抗体，进行后续抗体表位检测和配对实验。细胞株定株及亚型鉴定将亚克隆阶段筛选出的稳定分泌阳性抗体的细胞株，扩大培养于24孔板，扩大后收集上清进行抗原检测，采用elisa梯度稀释及wb验证其稳定性，收集细胞扩大于10cm培养皿中，再次收集上清并检测其中抗体的效价，挑选出较高的1-3株细胞株培养于细胞瓶中，进行冻存。表7细胞株亚型鉴定结果细胞株号亚型5h11igg11b7igg2a1g5igg11f2igg2a1f5igg11e5igg1细胞株冻存鉴定在细胞株冻存完毕后必须复苏同一批次中的一支进行鉴定，鉴定标准：①复苏活细胞数≥100万个细胞/支；②活细胞中有活力细胞≥50万/株；③复苏细胞中不能有除细胞株细胞以外的其它微生物(如：细菌.真菌.支原体等)出现；④复苏细胞生长到一定数目后选出生长好的细胞作单克隆计数铺板，并检测单克隆的分泌抗体能力是否全阳或有抗体分泌；⑤细胞培养上清也需作elisa，以确定是否分泌阳性抗体的同时做western-boltting的鉴定(图1)。腹水制备制备腹水，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中。细胞定株后扩大培养选用10％胎牛血清培养基，当细胞密度达到以1×106-2×106/ml时，800rpm离心，收集沉淀，并用pbs重悬后，腹腔注入到小鼠(液体石蜡)体内，7-10天后，收集腹水准备纯化。抗体纯化表8抗体纯化步骤表9抗体的得率细胞株克隆号腹水体积抗体得率1b75ml10mg1f26ml4mg1e54ml2mg抗体的sds结果如图2所示，结果显示，抗体1b7浓度约3.5mg/ml，纯度90％；抗体1f2浓度约1.5mg/ml，纯度90％；抗体1e5浓度约1mg/ml，纯度90％。抗体验证1)抗体1f2、1b7以及1e5的效价检测结果见图3-5。2)抗体wb验证蜂王浆样本：抗体wb验证蜂王浆样本的结果见图6。3)抗体的特异性检测：抗体1f2、1b7的特异性检测结果分别为图7和图8所示。从特异性检测结果可见，抗体1f2以及抗体1b7只与mrjp2发生特异性反应反应，与mrjp1、mrjp3以及mrjp4等其他相关蛋白无交叉反应。四、抗体表位检测及抗体配对筛选具体步骤如下：1)经过亲和力以及样本检测，选择1b7制备抗体，并标记生物素，摸索最佳的稀释比例；2)包被：用cbs包被对应的抗原，浓度为1μg/ml，100μl/孔，37℃2小时或者4℃过夜；3)封闭：5％pbs的脱脂奶粉或者2％pbs的bsa封闭，37℃1h或者4℃过夜；4)一抗：将标记的抗体和检测的抗体均按照方阵摸索的稀释度稀释；阴性对照：50μl标记抗体+50μl自身抗体；阳性对照：50μl标记抗体+50μl无关抗体；5)二抗：羊抗鼠或者兔抗鼠均可，100μl/孔，37℃1h；6)底物：根据标记的酶选择合适的底物，100μl/孔，10min；7)显色，终止，读数。首先通过梯度试验确定1b7生物素标记抗体的稀释比例，梯度试验的结果见表10。表101b7生物素标记抗体的梯度稀释试验结果选择标记抗体的稀释比例为1/4000，进行接下来的阻断实验。阻断实验的检测方法为间接竞争elisa(包被浓度：1μg/mlcb直包；一抗检测：50μl标记抗体+50μl检测抗体，阴性对照为50μl标记抗体+50μl自身抗体，阳性对照50μl标记抗体+50μlsp2/0培养上清；avidin-hrp：1/4000)。表11阻断实验的检测结果待测抗体株号1b7-bio标记抗体1/40001f21.91971e51.38091g51.4069阴性对照1b70.9249阳性对照sp2/02.404从阻断实验结果分析，1f2、1g5、1e5与标记抗体均为不同表位，其中，1f2与1b7的表位相异程度较高。将与1b7具有不同表位的细胞株1f2、1g5、1e5进行下一步的配对初筛。测试备选抗体，评估其稳定性(1)试验方法：双抗夹心法；hrp：1：4000；试验反应时间：2h+1h+1h+20min。表12抗体配对检测结果试验结果：1、1e5作为包被抗体，1b7标记生物素作为检测抗体可进行配对；2、1b7作为包被抗体，1e5标记生物素作为检测抗体可进行配对，下一步两对组合测试样本。(2)试验方法：双抗夹心法；hrp：1:4000；试验反应时间：2h+1h+1h+20min。表131e5和1b7的配对组合的稳定性试验结果试验结果：1、两对组合不管是从标曲检测范围，还是测样结果，区别不大，且比之前的那对组合灵敏度更高，若后续的热稳实验没有问题，将可以进行替换；2、胶体金产品，两对组合可以同时测试，择优放大。实施例3双抗体夹心elisa法的酶联免疫试剂盒的制备实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗mrjp2抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗mrjp2抗体、hrp标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物tmb显色。tmb在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中的mrjp2呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(od值)，计算样本浓度。标准曲线图及标准曲线线性范围(1)抗体配对初筛具体步骤如下：a包被：将待测的抗体2μg/ml包被，37℃2h或者4℃过夜；b封闭：2％bsa或者5％的脱脂牛奶封闭液200μl/孔，37℃1h或4℃过夜，tbst洗4遍；c标品及样本：标准品及样本按照图中备注信息添加到96孔中，50μl/孔，37℃2h；d二抗：生物素标记的抗体按照推荐的稀释比例加入96孔中，90μl/孔，37℃1h；e二抗：hrp-avidin，目前使用浓度1：4000，90μl/孔，37℃1h；f底物：90μl/孔，37℃放置5-15min；g终止反应、比色：加30μl/孔终止液，颜色变黄；用酶标仪测定450nm的吸光值。表14配对筛选结果根据表14的配对筛选结果可见，1b7作为捕获抗体，1f2作为检测抗体，灵敏度和测值较好，符合预期，下一步进行棋盘滴定，摸索各参数的使用浓度。(2)标准曲线设置标准曲线的设置原则以样本检出浓度为基准，即此曲线需包含各样本的检出浓度范围。固定标准品的浓度，选取不同的包检、检抗及二抗的浓度进行棋盘滴定实验(见表15)，以此选取各个参数合适的浓度条件。表15棋盘滴定实验结果具体步骤如下：1.包被：将待测的抗体按照图中标注的1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml分别包被，37℃2h或者4℃过夜；2.封闭：2％bsa或者5％的脱脂牛奶封闭液200μl/孔，37℃1h或4℃过夜，tbst洗4遍；3.重组蛋白为标准品：标准品设置s7和s0添加到96孔中，50μl/孔，37℃2h；4.二抗：生物素标记的抗体按照推荐的稀释比例加入96孔中，90μl/孔，37℃1h；5.二二抗：hrp-avidin，目前使用浓度1：4000，90μl/孔，37℃1h；6.底物：90μl/孔，37℃放置5-15min；7.终止反应、比色：加30μl/孔终止液，颜色变黄；用酶标仪测定450nm的吸光值。(3)标准曲线调整适当调整包抗、检抗及hrp的浓度来优化标准曲线，确保标曲r2≥0.99视为合格。表16第一次标准曲线摸索标曲(ng/ml)od1值od2值meanod2002.24082.71742.47911001.69831.86311.7807500.8330.96310.8981250.43260.53770.485212.50.26750.32660.29716.250.19670.22410.21043.1250.17550.17410.174800.12560.1210.1233从测试结果来看，标曲线性均较好，但低值较低；降低检抗浓度进一步调试标准曲线。表17第二次标准曲线摸索标曲(ng/ml)od值od值meanod2002.79472.50952.65211001.5171.54431.5307500.86220.88130.8718250.48970.54950.519612.50.30830.35010.32926.250.22220.24120.23173.1250.21010.18470.197400.11090.140.1255结果显示降低检抗浓度后，低值区间略微有提升，但是背景增加，再进行优化。表18第三次标准曲线摸索图9为不同检测条件的初步测样的标准曲线。结合测样结果，确定1b74μg/ml包被，检抗1f21∶500稀释的条件最佳，标曲计算公式为y＝(-3.552271796+37.86253734x)/(1-0.158838897x-0.004056212x2)，(y为蛋白浓度浓度，x是测量值od)，后续以此条件进行37℃热破坏实验。样品的检测及评价方法的建立a.根据样本类型提前处理样本；b.测试中均设置复孔：c.对于个别含量较高的项目，需要稀释后梯度测试样本。考核评估elisa方法(1)稳定性a.稳定性测试含4天及7天的稳定性，测试方法如下：分别将包被板(已包被抗体)、标准品(冻干粉)、中间浓度检抗各2套放置于37℃培养箱，于4天后取出一套，7天后取出一套；7天后将放热破的2套原料与4℃放置的原料一起做标曲的比较，计算od值的下降率。b.评判标准37℃培养箱热破7天后，下降率≤30％即视为稳定性合格。表19试剂盒37℃热破坏试验结果表2037℃热破坏实验的不同天数的下降率结果热稳定性4天下降均＜30％，热稳合格，进入下一步批内批间试验。(2)批内批间差a.批内变异系数：要求≤8％，方法：测试高、中、低浓度各24份，用其标准差/平均值×100％，即为其变异系数值。b.批间变异系数：要求≤10％，方法：测试高、中、低浓度各24份，用其标准差/平均值×100％，即为其变异系数值。图10是批内批间差实验标准曲线；表21试剂盒批内批间试验结果。表21试剂盒批内批间试验结果elisa法定量测定样本中mrjp2含量1)产品性能指标1.检测范围：3.125-200ng/ml。2.灵敏度：4.529ng/ml。3.精密度：批内差cv％<8％，批间差cv％<10％。4.特异性：本试剂盒特异性检测mrjp2，且与其他相关蛋白无交叉反应。5.稳定性结果：稳定性测试合格。6.热破坏稳定性测试2)试剂盒组成成分表22试剂盒组成成分组份96t酶标板(assayplate)12条×8孔标准品(standard)2瓶(冻干品)生物素标记抗体(biotin-antibody)1×120μl/瓶(100×)辣根过氧化物酶标记亲和素(hrp-avidin)1×120μl/瓶(100×)生物素标记抗体稀释液(biotin-antibodydiluent)1×15ml/瓶辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液(hrp-avidindiluent)1×15ml/瓶样本稀释液(samplediluent)1×50ml/瓶浓洗涤液(washbuffer)1×20ml/瓶(25×)底物溶液(tmbsubstrate)1×10ml/瓶终止液(stopsolution)1×10ml/瓶板贴43)样本采集及保存1.血清：全血标本请于室温放置2h或4℃过夜后于2℃-8℃1000×g离心15min，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融；解冻后的样品应再次离心，然后检测。2.血浆：可用edta或肝素作为抗凝剂，标本采集后30min内于2℃-8℃1000×g离心15min，取上清即可立即检测或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融；解冻后的样品应再次离心，然后检测。3.细胞培养物上清：标本于2-8℃1000×g离心15min取上清，上清立即用于实验或分装后于-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。4.尿液：用无菌管收集尿液于2℃-8℃，1000×g离心15min取上清，上清立即用于实验或分装后于-20℃或-80℃保存；避免反复冻融。试验前再次离心，以去除在样本保存期间可能出现的一些沉淀。5.组织裂解液：取100mg组织，用1×pbs洗去血污。剪成小块放入组织研磨器(匀浆管)中，加入1ml1×pbs，制成匀浆，然后置于-20℃过夜。经过反复冻融2次处理破坏细胞膜后，将组织匀浆于2-8℃5000×g离心5min取上清。取适量上清液立即进行实验，或将上清分装保存于-20℃或-80℃。解冻后的样品应再次离心，然后检测；避免反复冻融。6.蜂王浆原液处理办法：样本加入3倍体积pbs稀释，充分震荡后，超声20次，于10,000×g离心15min，取上清。因样本粘稠度较高，推荐1:200倍稀释，混匀后立即用于实验或分装后于-20℃或-80℃保存。避免反复冻融。注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。4)试剂配制标准品：(1)从试剂盒中取出一支标准品，于6000-10000rpm离心30s。用1ml样本稀释液溶解，并用枪头对准冻存管底部反复吸打5次以助溶解，充分混匀得到标准品s7，放置备用。(2)取7个1.5ml离心管(s0-s6)依次排列，各加入250μl样本稀释液，吸取250μl标准品s7到第一个离心管中(s6)，轻轻吹打混匀。从s6中吸取250μl到第二个ep管中(s5)，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释，s0为样本稀释液。表23标准品浓度编号s7s6s5s4s3s2s1s0ng/ml200100502512.56.253.1250洗液工作液：浓洗涤液按1:25倍用去离子水进行稀释。例如用量筒量取240ml去离子水，倒入烧杯或其他洁净容器中，再量取10ml浓洗涤液，均匀加入，搅拌混匀，在临用前配妥。浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。生物素标记抗体工作液：生物素标记抗体液按1:100倍用生物素标记抗体稀释液进行稀释。如10μl生物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液，轻轻混匀，在临用前10分钟内配妥。辣根过氧化物酶标记亲和素工作液：辣根过氧化物酶标记亲和素按1:100倍用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液进行稀释。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，轻轻混匀，在临用前10min内配妥。实施例4蜂王浆mrjp2胶体金免疫检测试纸的制备蜂浆mrjp2胶体金试纸条的组装和结果判定1.组装(1)将pvc底板切成宽2.8mm×长6cm的条；(2)在pvc底板条中间粘贴抗体固相nc膜，距离上段1.5cm；(3)在pvc底板条下端(即靠近nc膜的t线端)粘贴玻璃纤维膜探针条带，并与固相抗体nc膜重叠0.1cm，然后在下端粘贴1.7cm宽样本垫(玻璃纤维膜)与探针条带重叠0.1-0.2cm；(4)在pvc底板条上端(即靠近nc膜的c线端)粘贴1.7cm宽的吸水纸，并与抗体固相nc膜重叠0.1-0.2cm；(5)切成2.8mm宽的试纸条。2.结果判定将随机抽取的试纸条检测卡，向加样孔中滴加60μl处理好的待检样品，室温下反应15min。检测结果显示，标准阴性仅在c线出现一条玫瑰红线；检测结果显示，标准阳性为出现t线、c线2条玫瑰红线；c线必须显色，否则说明该试纸条无效。胶体金免疫检测试纸的各项性能mrjp2靶点快速检测卡具有方便、快速、灵敏等特点，适用于现场大批量样本检测。检测卡含有被事先固定于硝酸纤维素膜测试区(t)的抗原和控制区(c)的ⅱ抗以及固定于结合垫上的金标抗体。若样本为阳性，加样后在t区出现一条紫红色条带；若样本为阴性性，则t区不会出现紫红色条带。无论样本中是否有mrjp2蛋白存在，c区都会出现一条紫红色条带。样本采集及保存1血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于2–8℃1000g离心15min，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心，然后检测。2血浆：可用edta或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2–8℃1000g离心15分钟，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心，然后检测。3细胞培养物上清：标本于2–8℃1000g离心15分钟取上清，上清立即用于实验，或分装后于-20℃或-80℃保存。避免反复冻融。4尿液：用无菌管收集尿液于2–8℃1000g离心15min取上清，上清立即用于实验，或分装后于-20℃或-80℃保存。避免反复冻融。试验前再次离心，以去除在样本保存期间可能出现的一些沉淀。5动物组织裂解液：取100mg组织，用1xpbs洗去血污。剪成小块放入组织研磨器(匀浆管)中，加入1ml1xpbs，制成匀浆，然后置于-20℃过夜。经过反复冻融2次处理破坏细胞膜后，将组织匀浆于2–8℃5000g离心5分钟取上清。取适量上清液立即进行实验，或将上清分装保存于-20℃或-80℃。解冻后的样品应再次离心，然后检测。避免反复冻融。6植物组织裂解液：称取约0.5g洗净后(滤纸吸干)的植物组织，用消毒的剪刀尽量剪碎于灭菌后的预冷研钵中，液氮研磨成粉末，收集粉末至标记好的相应2mlep管中(约0.5ml粉末)；加入1ml含有蛋白酶抑制剂混合物(临用前加入)的植物组织提取液，用移液枪头轻轻吹打混匀；冰浴静置20min，每10min涡旋一次；超声5min，功率为20％；4℃12000r/min离心20min，取上清即为总蛋白。检测步骤1从-80℃冰箱取出样本，解冻之后，待检测；2取出检测卡，开封后平放于桌面，使用本产品附带滴管吸取待检样本上清液，加入3滴于样本孔中；3加样后5-10min，观察显色区，判定结果。4结果判定：阳性：c线显色，t线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阳性；阴性：c线显色，t线肉眼不显色，判为阴性；无效：c线不显色，无论t线是否显色，该检测卡均判为无效。试验例1本发明胶体金检测试纸检测蜂王浆mrjp2的特异性试验用磷酸缓冲溶液稀释新鲜蜂王浆样本代替蜂王浆样品，对试纸条特异性进行测定，结果显示，pbs和样本稀释液仅在c线出现1条玫瑰红线；蜂王浆样品出现t线、c线2条玫瑰红线，说明蜂王浆mrjp2胶体金试纸条只与mrjp2发生特异性反应反应，与其他相关蛋白(mrjp1、mrjp3、mrjp4以及mrjp5)无交叉反应。图11是采用本发明制备的胶体金检测卡测样检测的一种结果。试验例2本发明酶联免疫检测试剂盒检测蜂王浆mrjp2的灵敏度试验根据检测结果可见，本发明酶联免疫检测试剂盒检测蜂王浆mrjp2的灵敏度为4.529ng/ml。序列表<110>中国农业科学院蜜蜂研究所<120>配对的抗mrjp2单克隆抗体及其在定性或定量检测mrjp2中的应用<130>bj-2009-191019a<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>156<212>prt<213>bee<400>1gluaspileleuasnthrglnserleualalysalavalserlysasn151015glyvalleuphevalglyleuvalglyasnseralavalglycystrp202530asngluhisglnserleuglnargglnasnleuglumetvalalagln354045asnaspargthrleuglnmetilealaglymetlysilelysgluglu505560leuprohisphevalglyserasnlysprovallysaspglutyrmet65707580leuvalleuserasnargmetglnlysilevalasnaspasppheasn859095pheaspaspvalasnpheargileleuglyalaasnvallysgluleu100105110ileargasnthrhiscysvalasnasnasnglnasnaspasnilegln115120125asnthrasnasnglnasnaspasnasnglnlysasnasnlyslysasn130135140alaasnasnglnlysasnasnasnglnasnaspasn145150155当前第1页12