本发明涉及生物技术领域，且特别涉及用于沉淀血浆中免疫球蛋白的方法及从血浆中分离免疫球蛋白的方法。
背景技术：
医用动物免疫球蛋白在动物保健、动物疫情紧急防御和免疫诊断等方面都发挥着重要作用。目前大规模生产高纯度动物免疫球蛋白是国内市场的空白，开发规模化的高纯度免疫球蛋白生产工艺是满足目前市场需求的必须方案。现阶段，血浆免疫球蛋白的主要生产方法包括：硫酸铵沉淀法、低温乙醇沉淀法、辛酸沉淀法等。
硫酸铵沉淀法生产免疫球蛋白，是利用硫酸铵在一定的饱和度下，能使免疫球蛋白沉淀，对沉淀复溶后，再进行盐析沉淀，能使免疫球蛋白纯度达到80％以上。该方法能很好的保持免疫球蛋白的活性，生产成本也比较低。但是，在沉淀过程中容易引起白蛋白的共沉淀，导致免疫球蛋白的纯度达不到要求，同时要消耗大量的硫酸铵废弃物。
低温乙醇法制备免疫球蛋白，是人血制品的基本生产方法，能够完全沉淀分离出免疫球蛋白，但是需要比较多的分批沉淀步骤，导致分批沉淀存在比较大的目标蛋白损失。沉淀分离的免疫球蛋白纯度在85％以上，整个生产过程需要严格控制反应温度，能耗大，车间要求条件高，需要大量存储乙醇。
辛酸沉淀法制备免疫球蛋白，是动物血提取免疫球蛋白的常用方法，能够针对免疫球蛋白以外的蛋白，在特定的ph条件下，使其他蛋白都沉淀，而只有免疫球蛋白存留在上清液中，达到从血浆中分离免疫球蛋白的目的，一般制备的免疫球蛋白纯度可以到80％以上。
动物免疫球蛋白是在生物诊断技术和动物保健紧缺的一种生化试剂，近年来宠物和经济动物养殖以及免疫诊断在快速发展，免疫球蛋白的需求量迅速增加，需要吨级的供应量才能满足整个行业的需求。国内的免疫球蛋白生产企业大都采用以上的方法进行生产，因为工艺的限制，最终产品的外观和理化性质均不能达到实验和动物保健的实际要求，同时产量也远远不能满足市场需求。目前，免疫球蛋白还是依赖进口，动物养殖对于免疫球蛋白的需求只能在低层次的产品上徘徊。
此外，科研和医疗应用标准的免疫球蛋白，必须满足纯度高(96％以上)、残留杂质对实验和动物干扰小(低内毒素、低杂蛋白)、蛋白稳定性好等要求。以往采用的方法为了追求产量，采用的工艺技术相对比较粗放，产品的纯度远远达不到要求，注射级产品标准更是目前方法无法完成的。
鉴于此，提出本申请。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于沉淀血浆中免疫球蛋白的方法，其能够经过一次沉淀就将血浆中的免疫球蛋白分离下来，操作方便显著提升了生产效率。
本发明的另一目的在于提供一种从血浆中分离免疫球蛋白的方法，其生产效率高，便于工业化推广。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出了一种用于沉淀血浆中免疫球蛋白的方法，包括：
将聚乙二醇、水和血浆形成的混合液进行静置；
其中，聚乙二醇在混合液中的浓度为60-100g/l。
本发明提出了一种从血浆中分离免疫球蛋白的方法，采用上述方法沉淀免疫球蛋白。
本发明实施例提供一种用于沉淀血浆中免疫球蛋白的方法的有益效果是：其采用聚乙二醇对血浆中的免疫球蛋白进行沉积，通过改进聚乙二醇的用量经一次沉淀就能将血浆中的免疫球蛋白沉积下来，且无需在特定ph下进行沉淀。
本发明实施例还提供一种从血浆中分离免疫球蛋白的方法，采用上述方法沉淀免疫球蛋白，其操作方便，适于工业化应用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供的用于沉淀血浆中免疫球蛋白的方法及从血浆中分离免疫球蛋白的方法进行具体说明。
本发明实施例还提出一种从血浆中分离免疫球蛋白的方法，其包括免疫球蛋白的沉积和层析处理。发明人通过改进沉积过程，使沉积过程所的沉淀刚好与层析步骤对接，能够制备出高纯度的免疫球蛋白，且提取率很高。采用柱层析分离技术，对沉淀后的免疫球蛋白做了内毒素去除，把杂蛋白也一并去除保证了产品的纯度和品质。
s1、沉淀
将聚乙二醇、水和血浆形成的混合液进行静置；其中，聚乙二醇在混合液中的浓度为60-100g/l。优选地，聚乙二醇在混合液中的浓度为60-70g/l；聚乙二醇的分子量为10000。聚乙二醇在混合液中的浓度是指聚乙二醇、水和血浆刚混合时的浓度，在混合之后免疫球蛋白在静置过程中缓慢地沉积下来。
需要说明的是，发明人意外发现采用聚乙二醇对血浆进行沉淀可以通过调控其浓度达到一次有效沉淀的效果，血浆中绝大多数的免疫球蛋白被沉淀下来，相比于传统的辛酸沉淀法和硫酸铵沉淀法具有明显的优势，本发明中的方法不用在特定ph下进行，且仅需一次沉淀就能达到免疫球蛋白的有效沉积。发明人在此基础上通过扩大化实验验证了该方法能够实现工业化的量产，具有很好的经济价值，适合于在产业化应用。
一般而言，水和血浆的体积比为0.8-1.5:1；优选为1-1.3:1，如1:1、0.8:1、1.5:1等。控制水和血浆的比例在上述范围内能够使血浆更好地溶解，并在聚乙二醇作用下使免疫球蛋白沉淀下来。
在一些实施例中，将聚乙二醇、水和血浆混合搅拌1-2h再进行静置，静置时间2-5h，优选为2.5-3.5h。将聚乙二醇、水和血浆混合均匀之后再经过3h左右的静置就能使免疫球蛋白沉淀下来。
具体地，血浆选自牛血浆、猪血浆和羊血浆中的任意一种，发明人针对以上三种血浆进行了实验，发现本发明中的方法对于这三种血浆均适用。
s2、层析处理
将静置后的混合物进行过滤分离得到固体沉淀，再将固体沉淀进行层析处理。发明人发现，本发明实施例提供的沉淀方法可以和层析很好地衔接，通过层析可以使免疫球蛋白出来且纯度可以达到96％以上。
层析处理包括如下步骤：将固体沉淀与生理盐水混合溶解后进行膜过滤，随后超滤换液成ph为6.3-6.8的磷酸盐缓冲液，再进行层析分离；通过膜过滤可以将部分杂质沉淀去除，防止在层析过程中影响分离。具体地，每克固体沉淀对应生理盐水的用量为8-12ml，生理盐水的ph为6.3-6.8；超滤过程是采用截留分子量为40-60kd的超滤膜进行超滤换液。整个层析处理过程中所用的溶液ph均为6.5左右为宜，在此范围内能够进一步使免疫球蛋白的纯度达到96％以上。
层析分离过程是在上柱后先采用ph为6.3-6.8磷酸盐缓冲液进行冲洗，再用ph为6.3-6.8磷酸盐缓冲液和氯化钠溶液形成的混合洗脱液进行洗脱；优选地，氯化钠在混合洗脱液中的浓度为0.5-0.7mol/l。通过高盐洗脱能够将免疫球蛋白分离出来，得到纯度96％以上的产品。
在一些实施例中，在洗脱之后对得到的目标蛋白进行超滤脱盐，再制成免疫球蛋白制剂，通过超滤脱盐去除洗脱液中带入的盐分，使制备的产品满足使用要求。具体地，超滤脱盐为常规步骤，其对工艺参数没有特别的要求。
在一些实施例中，免疫球蛋白制剂是经过冷冻干燥而得；在另外的实施例中，免疫球蛋白制剂是经过浓缩而得，且免疫球蛋白的质量分数为18-23％。发明人根据生产需要制备了两种制剂，可以为冻干粉也可以为浓缩液。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种从血浆中分离免疫球蛋白的方法，包括如下步骤：
量取7l纯净水，加入1.0kg聚乙二醇(分子量为10000)充分溶解，加入7l牛血浆，搅拌1小时，静置3小时，过滤收集沉淀。将沉淀与ph6.5的生理盐水充分溶解，(每克所述固体沉淀对应所述生理盐水的用量为10ml)，用50kd的超滤膜对溶解液换液成ph6.5的磷酸盐缓冲液，上柱进行柱层析分离。上样后先用ph6.5的磷酸盐缓冲液冲洗，然后用ph6.5磷酸盐缓冲液和氯化钠溶液形成的混合洗脱液洗脱目标蛋白(混合洗脱液中氯化钠的浓度为0.6mol/l)，对目标蛋白超滤脱盐后，冷冻干燥得冻干粉56g。其中，冷冻干燥是将样品液迅速冷冻至-40℃，持续干燥1小时；再升到-25℃，持续干燥15小时；再升温至0℃，持续干燥2小时；升温至保存温度20℃，恒温2小时，结束。
经测试冻干粉电泳检测纯度在97％，冻干粉复溶性好，溶液清澈透明。
实施例2
本实施例提供一种从血浆中分离免疫球蛋白的方法，包括如下步骤：
量取70l纯净水，加入9.0kg聚乙二醇(分子量为10000)充分溶解，加入70l牛血浆，搅拌1小时，静置3小时，过滤收集沉淀。将沉淀与ph6.5的生理盐水充分溶解，(每克所述固体沉淀对应所述生理盐水的用量为10ml)，用50kd的超滤膜对溶解液换液成ph6.5的磷酸盐缓冲液，上柱进行柱层析分离。上样后先用ph6.5的磷酸盐缓冲液冲洗，然后用ph6.5磷酸盐缓冲液和氯化钠溶液形成的混合洗脱液洗脱目标蛋白(混合洗脱液中氯化钠的浓度为0.6mol/l)，对目标蛋白超滤脱盐后，冷冻干燥得冻干粉600g。冷冻干燥过程参照实施例1。
经测试冻干粉电泳检测纯度在98％，冻干粉复溶性好，溶液清澈透明。
实施例3
本实施例提供一种从血浆中分离免疫球蛋白的方法，包括如下步骤：
量取500l纯净水，加入64kg聚乙二醇(分子量为10000)充分溶解，加入500l猪血浆，搅拌1小时，静置3小时，过滤收集沉淀。将沉淀与ph6.5的生理盐水充分溶解，(每克所述固体沉淀对应所述生理盐水的用量为10ml)，用50kd的超滤膜对溶解液换液成ph6.5的磷酸盐缓冲液，上柱进行柱层析分离。上样后先用ph6.5的磷酸盐缓冲液冲洗，然后用ph6.5磷酸盐缓冲液和氯化钠溶液形成的混合洗脱液洗脱目标蛋白(混合洗脱液中氯化钠的浓度为0.6mol/l)，对目标蛋白超滤脱盐后，冷冻干燥得冻干粉4300g。冷冻干燥过程参照实施例1。
经测试冻干粉电泳检测纯度在97％，冻干粉复溶性好，溶液清澈透明。
实施例4
本实施例提供一种从血浆中分离免疫球蛋白的方法，包括如下步骤：
量取10.5l纯净水，加入1.75kg聚乙二醇(分子量为10000)充分溶解，加入7l牛血浆，搅拌2小时，静置2小时，过滤收集沉淀。将沉淀与ph6.5的生理盐水充分溶解，(每克所述固体沉淀对应所述生理盐水的用量为8ml)，用50kd的超滤膜对溶解液换液成ph6.3的磷酸盐缓冲液，上柱进行柱层析分离。上样后先用ph6.3的磷酸盐缓冲液冲洗，然后用ph6.3磷酸盐缓冲液和氯化钠溶液形成的混合洗脱液洗脱目标蛋白(混合洗脱液中氯化钠的浓度为0.5mol/l)，对目标蛋白超滤脱盐后，浓缩成质量分数为20％的浓缩液。
实施例5
本实施例提供一种从血浆中分离免疫球蛋白的方法，包括如下步骤：
量取5.6l纯净水，加入1.0kg聚乙二醇(分子量为10000)充分溶解，加入7l牛血浆，搅拌2小时，静置5小时，过滤收集沉淀。将沉淀与ph6.5的生理盐水充分溶解，(每克所述固体沉淀对应所述生理盐水的用量为12ml)，用50kd的超滤膜对溶解液换液成ph6.8的磷酸盐缓冲液，上柱进行柱层析分离。上样后先用ph6.8的磷酸盐缓冲液冲洗，然后用ph6.8磷酸盐缓冲液和氯化钠溶液形成的混合洗脱液洗脱目标蛋白(混合洗脱液中氯化钠的浓度为0.5mol/l)，对目标蛋白超滤脱盐后，冷冻干燥制得粉剂，冷冻干燥过程参照实施例1。
对比例1
本对比例提供一种从血浆中分离免疫球蛋白的方法，其与实施例1步骤大致相同，不同之处仅在于：聚乙二醇的用量为0.7kg(聚乙二醇的用量为50g/l)。
对比例2
本对比例提供一种从血浆中分离免疫球蛋白的方法，其与实施例1步骤大致相同，不同之处仅在于：聚乙二醇的用量为1.54kg(聚乙二醇的用量为110g/l)。
对比例3
本对比例提供一种从血浆中分离免疫球蛋白的方法，其与实施例1步骤大致相同，不同之处仅在于：将聚乙二醇替换为硫酸铵。
对比例4
本对比例提供一种从血浆中分离免疫球蛋白的方法，其与实施例1步骤大致相同，不同之处仅在于：将聚乙二醇替换为辛酸。
对比例5
本对比例提供一种从血浆中分离免疫球蛋白的方法，其与实施例1步骤大致相同，不同之处仅在于：将聚乙二醇10000替换为聚乙二醇8000。
对比例6
本对比例提供一种从血浆中分离免疫球蛋白的方法，其与实施例1步骤大致相同，不同之处仅在于：将聚乙二醇10000替换为聚乙二醇20000。
试验例
测试实施例1和对比例1-6中固体沉淀中免疫球蛋白的含量，并和原血浆中免疫球蛋白的含量进行对比。测试方法：实施例1沉淀和对比例沉淀用相同体积生理盐水充分溶解后，对所有溶解样品做蛋白质电泳，通过电泳条带灰度对比沉淀中免疫球蛋白的含量以及血浆中免疫球蛋白含量。
测试结果显示，实施例1和对比例1-6中血浆中免疫球蛋白含量为12g/l，实施例1、对比例1-6中所得固体沉淀中免疫球蛋白含量依次为8g/l、5g/l、8g/l、8g/l、6g/l、3g/l、8g/l。其中对比例2的杂蛋白明显增多，对后续纯化不利；对比例3的杂蛋白含量很高，给后续纯化造成很大压力；对比例4中免疫球蛋白含量达到6g/l，因为辛酸沉淀是沉淀杂蛋白，保留免疫球蛋白在上清中，从而可以推测辛酸沉淀上清纯化得到的免疫球蛋白大概在7g/l；对比例6的沉淀中杂蛋白含量非常高，对后续纯化造成很大麻烦。在收率和纯度两个重要参数要求之下，实施例1的工艺条件更加符合免疫球蛋白大规模生产。
可见，本申请中的沉淀方法能够最大程度上将免疫球蛋白沉淀出来，同时尽可能减少杂蛋白的接入。聚乙二醇的用量对于沉淀效果影响显著，控制在本发明实施例所提供的范围内为宜。
本发明实施例1-3均经过连续生产三批以上，样品经检测批间差细微，免疫球蛋白活性与血浆中并无差异，说明该方法是稳定制备动物免疫蛋白的生产工艺。尤其是对传统的两步沉淀做了优化之后，制备过程大大简化，生产效率大幅度提高，具有很强的生产可操作性。经过70倍放大后，产品依然保持稳定的检测参数标准，证明了该方法的规模化生产可行性，最后的柱层析分离步骤，突破了柱层析处理量的瓶颈限制，能进行吨级样品的处理，适合大生产要求。
此外，本发明实施例制备的最终产品经几家诊断试剂厂试用和养殖企业验证，在检测方面完全和进口试剂(罗氏等品牌)性能效果相当，在免疫保护方面对动物的机体免疫有大幅度提高。经过聚乙二醇分离之后，其他蛋白任然保持生物活性和价值，在对其他蛋白进行逐一精细分离。
综上所述，本发明提供的用于沉淀血浆中免疫球蛋白的方法，其通过聚乙二醇对血浆中的免疫球蛋白进行沉积，通过改进聚乙二醇的用量可以通过一次沉淀就能将血浆中的免疫球蛋白沉积下来，且无需在特定ph下进行沉淀。
本发明技术方法具有周期短(提取分离仅两天)，不耗能(室温反应)，无污染物引入(聚乙二醇可被回收循环使用)，无废渣产生(其他蛋白没有变性，还可再深加工)，该方法最大限度地利用了血浆组分的潜在价值，在所有免疫球蛋白制备中工艺路径最简捷，成本最低，生产最环保。
本发明还提供的一种从血浆中分离免疫球蛋白的方法，采用上述方法沉淀免疫球蛋白，其操作方便，适于工业化应用。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。