一种嵌合抗原受体T细胞及其应用的制作方法

本发明属于肿瘤的细胞免疫治疗领域，具体涉及一种嵌合抗原受体t细胞及其应用，尤其涉及一种同时表达两种嵌合抗原受体的t细胞及其应用。

背景技术：

过继性免疫治疗(adoptivecelltransfertherapy，act)，是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。近年来，嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)修饰的t淋巴细胞(car-modifiedtlymphocyte，car-t)疗法在血液肿瘤的治疗上取的了显著疗效，特别是对于急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia，all)和b细胞淋巴瘤，缓解率达到80％左右。

其中，car-t设计的关键是选择适当的肿瘤抗原作为靶标，cd19car-t靶向治疗法的效果最为显著，可达70-90％的完全缓解。cd19是簇分化抗原的一种，是b细胞增殖、分化、活化及抗体产生有关的重要膜抗原。cd19分布于全体b细胞、毛细胞白血病细胞等恶性b细胞、滤泡树状细胞上，因此是诊断b细胞系肿瘤(白血病、淋巴瘤)和鉴定b细胞最好的标记。截止2019年，美国fda批准了两款针对急性淋巴细胞白血病和b细胞淋巴瘤的car-t疗法，yescarta和kymriah，也都是以cd19作为靶点。

例如，cn108864307a公开了一种信号肽优化靶向cd19的嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的t细胞及制备方法和应用。所述信号肽优化靶向cd19的嵌合抗原受体包含顺序串联的跨膜蛋白信号肽、抗cd19抗体单链可变区、cd8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1bb共刺激结构域与cd3ζ胞内信号传导结构域。

尽管cd19car-t细胞疗法在血液肿瘤的治疗中取得了令人鼓舞的结果，但是研究表明，实体肿瘤比如淋巴瘤和宿主调节细胞诱导的免疫抑制性微环境可能会限制过继性t细胞免疫疗法的潜能。肿瘤可通过刺激t细胞上的免疫抑制受体，例如pd1来逃避免疫监控，这也是cd19car-t细胞疗法在淋巴瘤中的疗效不佳的主要原因。pd-l1在肿瘤细胞中的过表达也是耐药机制的一种，可因pd-l1与t细胞上的pd-1结合，而抑制t细胞的激活，使肿瘤细胞发生免疫逃逸。

阻断pd-l1和pd1的结合理论上可以消除pd1信号对t细胞的抑制，激活t细胞的免疫反应。美国fda已批准三款pd-l1单抗药物对于非小细胞肺癌，黑色素瘤和尿路上皮癌等癌症的临床试验，平均缓解率在30％左右。单用pd-l1单抗的疗效还不足以完全治愈肿瘤患者，很多临床iii期实验由于没有达到最终目标而失败。

因此，本发明的目的在于提供一种能够有效治疗肿瘤、降低免疫抑制性的嵌合抗原受体t细胞。

技术实现要素：

鉴于现有技术中存在的问题，鉴于抗pd-l1的免疫抑制作用，我们利用car来设计转换pd-l1的抑制信号为激活信号，从而为car-t治疗以及过继回输免疫细胞治疗提供一种新的方法和思路。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种嵌合抗原受体t细胞，所述嵌合抗原受体t细胞同时表达靶向cd19和pd-l1特异性结合抗原的嵌合抗原受体。

本发明将靶向cd19的car与靶向pd-l1的car共同构建于同一慢病毒载体，进而转入t细胞当中得到所述car-t细胞，使该基因修饰的t细胞不仅可以靶向识别表达cd19细胞，同时，pd-l1嵌合抗原受体能够把pd-l1/pd1传导的抑制t细胞活性的信号，转换成刺激t细胞激活的信号，还可以解除肿瘤细胞表达的pd-l1对t细胞的免疫抑制。所述双car结构的同时表达，能够提高所述car-t细胞的抗肿瘤效果，缓解car-t治疗的耐药性问题。

作为本发明优选的技术方案，所述cd19嵌合抗原受体包括：cd19抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号传导结构域。

优选地，所述cd19抗原结合结构域包括如seqidno.1所示的氨基酸序列。

优选地，所述cd19嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括cd28胞内结构域、cd3ζ、tlr1、tlr2、4-1bb或cd27中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述cd19嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括4-1bb共刺激结构域和cd3ζ胞内信号传导结构域。

优选地，所述cd19嵌合抗原受体包括如seqidno.2所示的氨基酸序列。

作为本发明优选的技术方案，所述pd-l1嵌合抗原受体包括：pd-l1抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号传导结构域。

pd-l1嵌合抗原受体能够把pd-l1/pd1传导的本来是抑制t细胞活性的信号，转换成刺激t细胞激活的信号。同时，肿瘤细胞中表达的pd-1，pd1-cd28嵌合受体借助于pd-1提供的信号，化抑制为刺激，促进t细胞的抗肿瘤活性。

为了促进pd-l1对于抑制免疫逃逸的作用，本发明通过噬箘体文库筛选到的不同pd-l1抗体，并对pd-l1的靶向序列进行了优化，从多个序列中，筛选出能使car活性最高的pd-l1序列。

优选地，所述pd-l1抗原结合结构域包括如seqidno.3、seqidno.4或seqidno.5所示的任意一种氨基酸序列，优选为seqidno.3。

其中，seqidno.3所示的氨基酸序列为：

mlllvtslllcelphpafllipdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliydvsnrpsgvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyycssytssstrvfgtgtkvtvlgstsgsgkpgsgegstkgevqlvesggglvqpggslrlscaasdswihrywmswvrqapgkglewvanikqdgsekyyvdsvrdnskntlrdnaknslylqmnslraedtavyycareggwfgelafdywgqgtlvtvss；

seqidno.4所示的氨基酸序列为：

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seqidno.5所示的氨基酸序列为：

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优选地，所述pd-l1嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括cd28胞内结构域、cd3ζ、tlr1、tlr2、4-1bb或cd27中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述pd-l1嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括cd28胞内结构域。

优选地，所述pd-l1嵌合抗原受体包括如seqidno.6、seqidno.7或seqidno.8所示的氨基酸序列。

作为本发明优选的技术方案，所述cd19嵌合抗原受体和pd-l1嵌合抗原受体通过2a或ires进行连接。

为了提高慢病毒感染外周血t细胞的效率，本发明采用2a或ires连接目的基因，以增加慢病毒载体对t细胞的感染效率。

优选地，所述2a的氨基酸序列包括如seqidno.9所示的氨基酸序列，具体为egrgslltcgdveenpgp。

本发明中，所述嵌合抗原受体t细胞中双car段表达的氨基酸序列可分为3种，分别为：

(1)seqidno.3、egrgslltcgdveenpgp和seqidno.6组成的氨基酸序列，记为car-cd19/pd-l1(1)；

(2)seqidno.3、egrgslltcgdveenpgp和seqidno.7组成的氨基酸序列，记为car-cd19/pd-l1(2)；

(3)seqidno.3、egrgslltcgdveenpgp和seqidno.8组成的氨基酸序列，记为car-cd19/pd-l1(3)，其中，car-cd19/pd-l1(1)对肿瘤细胞的杀伤率最高。

第二方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体用于制备如第一方面所述的嵌合抗原受体t细胞。

优选地，所述表达载体包括编码cd19嵌合抗原受体的核酸分子、编码2a肽的核酸分子和编码pd-l1嵌合抗原受体的核酸分子。

优选地，所述编码cd19嵌合抗原受体的核酸分子包括如seqidno.10所示的核酸序列。

优选地，所述编码pd-l1嵌合抗原受体的核酸分子包括如seqidno.11、seqidno.12或seqidno.13所示的核酸序列。

作为本发明优选的技术方案，所述编码cd19嵌合抗原受体和编码pd-l1嵌合抗原受体的核酸分子共用一个启动子，且嵌合抗原受体在启动子后的顺序不会影响其表达效率。

优选地，所述启动子为ef1α。

为了促进cd19car结构和pd-l1car结构的高效表达，本发明中编码cd19嵌合抗原受体和编码pd-l1嵌合抗原受体的核酸分子共用一个启动子，以提高目的基因的表达效率和蛋白活性。

优选地，所述表达载体包括病毒载体。

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

第三方面，本发明提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用如第二方面所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。

优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293t细胞或293e细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的嵌合抗原受体t细胞的制备方法，所述方法包括将如第二方面的表达载体或如第三方面所述的重组慢病毒导入t细胞的步骤。

本发明中，可用本领域常规方法制备所述嵌合抗原受体t细胞。

首先，对含有靶向cd19car结构和pd-llcar结构的慢病毒载体进行提取，然后与293ft细胞进行质粒包装，转染，收集病毒上清液，得到含有双car的慢病毒上清；

分离人全血中的淋巴细胞，并分选分离出t细胞，培养后加入含有双car的慢病毒上清，培养，转染，得到所述嵌合抗原受体t细胞。

第五方面，本发明还提供一种组合物，所述组合物包括如第一方面所述的嵌合抗原受体t细胞、如第二方面所述的表达载体或如第三方面所述的重组慢病毒中的任意一种或至少两种的组合。

第六方面，本发明提供一种如第一方面所述的嵌合抗原受体t细胞、如第二方面所述的表达载体、如第三方面所述的重组慢病毒或如第五方面所述的组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

优选地，所述肿瘤为血液相关的肿瘤疾病。

优选地，所述血液相关的肿瘤疾病为白血病和/或淋巴瘤。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明提供一种同时表达靶向cd19和pd-l1的嵌合抗原受体的car-t细胞，所述car-t细胞不仅可以靶向识别表达cd19的细胞，还可以解除肿瘤细胞表达的pd-1对t细胞的免疫抑制，避免肿瘤细胞的免疫逃逸机制，缓解car-t治疗的耐药性问题；

(2)本发明通过对pd-l1抗体序列的优化，获得了高活性的car，与cd19car联合表达之后，能够实现良好的抗肿瘤效果；

(3)本发明将多个目的基因构建于在同一载体上时，通过选择合适的连接方式和启动子，使其对t细胞的感染效率较高，同时还能使得提高其表达的蛋白活性及表达效率，从而实现进一步增加car-t细胞对肿瘤细胞的杀伤率；使用所述car-t细胞处理后，肿瘤细胞的存活率仅为15.7-35.7％。

附图说明

图1为实施例1中提供的用于制备所述car-t细胞的质粒结构示意图。

图2为经过实施例1、对比例1提供的car-t细胞和空白对照car-mock细胞处理后的肿瘤细胞存活率柱状图。

图3为经过实施例2、对比例1提供的car-t细胞和空白对照car-mock细胞处理后的肿瘤细胞存活率柱状图。

图4为经过实施例3、对比例1提供的car-t细胞和空白对照car-mock细胞处理后的肿瘤细胞存活率柱状图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，所用的原始载体为pcdh-ef1-luc2-t2a-tdtomato，购自武汉森灵生物科技有限公司，所用限制性内切酶包括hindiii和bamhi内切酶均购自newenglandbiolabs(beijing)ltd。

以下实施例中，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

本实施例提供一种同时表达cd19car结构和pd-l1car结构的嵌合抗原受体t细胞。

所述嵌合抗原受体t细胞的制备方法包括如下步骤：

1、将表达靶向cd19car与pd-l1car嵌合受体的核苷酸序列(即seqidno.10和seqidno.11)使用编码2a的核苷酸序列进行连接，合成融合基因，合成这段基因时，在两端分别包含限制性内切酶hindiii和bamhi的酶切位点，并装载到pcdna3.1(+)载体上；所述序列委托上海生工生物公司合成。

2、使用hindiii和bamhi双酶切包含目的基因的pcdna3.1(+)载体，酶切后切胶回收目的基因片段；

3、利用hindiii和bamhi双酶切原始载体pcdh-ef1-luc2-t2a-tdtomato，酶切后切胶回收大小约为2.7kb的载体片段；

4、用dna连接酶连接回收的目的基因片段和载体片段，所得质粒的结构如图1所示，其中包含5'ltr、cd19car、pd-l1car和3'ltr，所述双car之间采用2a进行连接，所得质粒可简记为cd19-pd-l1car。

5、再通过转染试剂转染293ft细胞产生慢病毒，然后采集人pbmc细胞，分离出cd⁸⁺t细胞，制备得到同时表达cd19car结构和pd-l1car结构的嵌合抗原受体t细胞，其表达的氨基酸序列为seqidno.3、seqidno.9和seqidno.6所组成的氨基酸序列。

实施例2

与实施例1的区别在于，将seqidno.11替换为seqidno.12，其制备方法与实施例1相同，其表达的氨基酸序列为seqidno.3、seqidno.9和seqidno.7所组成的氨基酸序列。

实施例3

与实施例1的区别在于，将seqidno.11替换为seqidno.13，其制备方法与实施例1相同，其表达的氨基酸序列为seqidno.3、seqidno.9和seqidno.8所组成的氨基酸序列。

对比例1

提供一种cd19car-t细胞，即仅含有靶向cd19抗原的嵌合抗原受体，其制备方法与实施例1相同。

至此，实施例1～3构建了含有3种pd-l1抗体的双car-t细胞，即car-cd19/pd-l1(1)、car-cd19/pd-l1(2)和car-cd19/pd-l1(3)；

对比例1提供一种含有单一嵌合抗原受体的car-t细胞，记为car-cd19。

性能测试

对实施例1～3和对比例1提供的car-t细胞、以及空白对照(car-mock)进行体外杀伤实验，用于验证本发明提供的同时表达cd19和pd-l1的car-t细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。

1、分别制备表达gfp(greenfluorescentprotein，绿色荧光蛋白)和表达cd19/pd-l1的k562细胞；

2、将制备的car-t细胞分别和上述制备的k562细胞共孵育，采用ldh(乳酸脱氢酶)释放法，检测杀伤效果，杀伤效果检测结果如图2、3和4所示。

其中，如图2所示，经过car-mock细胞处理后的肿瘤细胞cd19/pd-l1表达量与gfp相同，即肿瘤细胞存活率为100％，经过car-cd19细胞处理后的cd19/pd-l1表达量小于gfp表达量的45.6％，即肿瘤细胞存活率为45.6％，经过car-cd19/pd-l1(1)(即实施例1提供的car-t细胞)处理后的肿瘤细胞的cd19/pd-l1表达量为gfp表达量的15.7％，即肿瘤细胞存活率为15.7％。

如图3所示，经过car-cd19/pd-l1(2)(即实施例2提供的car-t细胞)处理后的肿瘤细胞的cd19/pd-l1表达量为gfp表达量的35.7％，即肿瘤细胞存活率为35.7％。

如图4所示，经过car-cd19/pd-l1(3)(即实施例3提供的car-t细胞)处理后的肿瘤细胞的cd19/pd-l1表达量约为gfp表达量的33.4％，即肿瘤细胞存活率为33.4％。

综上所述，本发明提供的嵌合抗原受体t细胞同时表达两种嵌合抗原受体，同时靶向cd19和pd-l1两个肿瘤细胞特异性抗原，因此，所述car-t细胞不仅可以靶向识别表达cd19的细胞，还可以解除肿瘤细胞表达的pd-1对t细胞的免疫抑制，避免肿瘤细胞的免疫逃逸机制，缓解car-t治疗的耐药性问题，使用所述car-t细胞处理后，肿瘤细胞的存活率仅为15.7-35.7％。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

sequencelisting

<110>格源致善（上海）生物科技有限公司

<120>一种嵌合抗原受体t细胞及其应用

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