芝麻多肽及其制备方法和应用与流程

本发明属于植物蛋白深加工领域，具体涉及一种来源于芝麻7s蛋白的活性多肽eaciqack、制备方法以及其在抗氧化活性与降血压活性方面的应用。

背景技术：

目前，功能肽研究是食品研究的热点之一，常见的功能肽包括抗氧化肽、降血压肽、抗菌肽、风味肽等。前人研究往往侧重于多肽的某一单独活性研究，而忽视具有多种活性的活性肽的研究。tanzadehpanah等人通过结构修饰afkdedteevpfr，使其具有降血压活性，同时也具有抗氧化活性。garcia-mora等人酶解扁豆蛋白发现具有降血压活性与抗氧化活性的多肽，这就表明多功能活性肽在自然界是存在的。较单一功能的活性肽，多功能活性肽应用范围更广，优势明显，更具有研究与应用价值。

随着生活方式改变，非传染慢性疾病（高血压、心脑血管疾病、糖尿病等）严重威胁全球人民的健康。研究表明，大多数非传染慢性疾病的发生发展与体内自由基引发的氧化应激反应有关，抑制自由基反应、抗氧化，对于预防与缓解上述疾病具有积极意义。同时，调控体内血管紧张酶活性，对于控制血压具有重要意义。因此，若能开发出同时具有抗氧化与降血压活性的功能肽对于预防与辅助治疗非传染慢性疾病具有积极研究价值与光明的市场价值。

我国是芝麻生产与消费大国，每年芝麻产量约为60万吨，加工芝麻在150万吨左右。作为芝麻的主要成分——芝麻蛋白（占芝麻总重的20%左右），由于加工技术落后，芝麻蛋白加工程度较低，多加工成饲料或肥料使用，芝麻蛋白资源未得到充分利用。为利用芝麻蛋白，前人将芝麻蛋白酶解可以制备抗氧化肽、降血压肽、螯合金属肽。在此基础上，若能制备具有抗氧化与降血压的双功能芝麻活性肽，具有更强的市场竞争力，应用范围更广泛，提升芝麻蛋白加工附加值的同时，也为提升居民健康做出贡献。

技术实现要素：

为满足人民健康生活的需求和替代有毒副作用人工合成抗氧化剂与降血压药，本发明目的在于提供一种来自芝麻蛋白的同时具有抗氧化和降血压活性的芝麻多肽，该芝麻多肽具有活性高、制备工艺成熟，成本可控等优点，具有广阔的市场前景。

本发明还提供了上述芝麻多肽的制备方法，以及其在制备具有抗氧化和/或降血压药物方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种具有抗氧化和/或降血压活性功效的芝麻多肽，该多肽由八个氨基酸组成，其序列为：glu-ala-cys-ile-gln-ala-cys-lys（eaciqack），该芝麻多肽来源于芝麻7s蛋白（q9aud0_sesin）。

上述的芝麻多肽，其可以通过人工化学合成制备，如采用固相合成法按照本领域常规工艺制备合成。

本发明还提供了另外一种从芝麻蛋白中提取上述芝麻多肽的方法，其通过蛋白酶解、分离纯化等步骤制得；具体包括下述步骤：

1）芝麻蛋白提取：

将除杂后的芝麻粉碎、脱脂，加入蒸馏水，调节ph至8-10，离心后，收集上清液，调节ph至4-5，离心，收集沉淀，水洗，冷冻干燥，获得芝麻蛋白；

2）蛋白酶解：

将步骤1）所得芝麻蛋白，按料液比1g：6-15ml加入蒸馏水获得芝麻蛋白溶液，将ph值调至1.5-2.5，加入0.1-1.5%(w/v，即每100ml芝麻蛋白溶液中加入0.1-1.5g胃蛋白酶)的胃蛋白酶，于30-50℃搅拌酶解1-5h，随后调节ph至7.0-8.5，加入0.1-2.5%(w/v，即每100ml芝麻蛋白溶液中加入0.1-2.5g复合蛋白酶)的复合蛋白酶，于30-50℃酶解3-6h，调节ph至4.0-4.5，离心取上清液，4-10℃低温备用；

3）分离纯化：

将步骤2）所得上清液调节ph至7.0-8.0，利用强阳离子交换树脂吸附除去杂质多肽后，采用截留分子量1000-5000da的超滤膜进行超滤，透过液采用纳滤进行脱盐浓缩，然后采用制备液相色谱分离纯化，收集保留时间在22min-23min的组分，冷冻干燥。

将上述冷冻干燥获得的多肽样品，通过nano-lc-esi-ms/ms进行分析鉴定，鉴定具有抗氧化与降血压活性的多肽的氨基酸序列为：glu-ala-cys-ile-gln-ala-cys-lys（eaciqack）。eaciqack源自芝麻7s蛋白49-56处，即skeqkeaciqackeyirq49-56。

具体的，步骤1）中芝麻脱脂采用溶剂萃取法或亚临界萃取法。溶剂萃取时，采用石油醚、正已烷或乙醚进行脱脂；亚临界萃取时，采用丁烷、丙烷脱脂。提取蛋白时按料液比1g：6ml-24ml加入蒸馏水。采用氢氧化钠将ph调节为8-10，室温搅拌30-90min。离心条件为：3500-5000r/min离心20-40min；采用盐酸将上清液的ph调至4-5。

具体的，步骤2）中所述复合蛋白酶由质量比为6-12:1的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶组成。

进一步的，步骤3）中所用的强阳离子交换树脂为anxsephroseff，上样后，采用2-8ml/min蒸馏水流速洗脱60-180min，收集流出液进行超滤。纳滤时选用的纳滤膜截留分子量为100-300da。

进一步优选的，步骤3）中制备液相色谱条件为：色谱柱ultimateaq-c18(250×20mm，5μm)，流动相为含0.1%三氟乙酸的55%甲醇水溶液，即55%(v/v)甲醇溶液（含0.1%(v/v)三氟乙酸）；流速8ml/min，上样量4ml，检测波长220nm。

本发明还提供了上述芝麻多肽作为主要功能成分在制备抗氧化和/或降血压药物、保健品、食品、营养强化剂、动物饲料、化妆品、日化用品等领域中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1）本发明所用的原料为芝麻或低温芝麻饼粕，来源广泛，有价格优势且不影响其他芝麻组分利用，因此具有成本可控、原料利用率高、对环境友好等优点；

2）本发明提供的芝麻活性多肽，安全性高（见表2），且具有抗氧化肽和/或降血压活性功效；

3）本发明提供的芝麻多肽活性显著，不仅可以作为食品添加剂，也可以作为功能性成分应用于药物、保健品、食品、营养强化剂、动物饲料、化妆品及日化用品中。

附图说明

图1为实施例1制备液相分离超滤透过液的色谱图；

图2为本发明提取所得芝麻多肽样品在nano-lc-esi-ms/ms中的二级质谱图；

图3为本发明芝麻多肽的hplc图；

图4为本发明芝麻多肽的质谱图；

图5为本发明芝麻多肽eaciqack与人体血管紧张素酶结合预测图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员未做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1

一种从芝麻蛋白中提取芝麻多肽的方法，其具体包括如下步骤：

1）芝麻蛋白提取：

取0.5kg无杂质和霉粒的芝麻，粉碎至60目，采用索氏抽提器进行脱脂，脱脂条件为：石油醚（沸程30-60℃）为萃取剂，温度为65℃，脱脂8h。将脱脂后的芝麻按料液比（w/v）1g:12ml加入蒸馏水，用氢氧化钠将ph调节为10，室温搅拌90min，随后4000r/min离心30min，取上清液，调节ph到4.5，4500r/min离心30min，收集沉淀，用蒸馏水水洗3次，冷冻干燥，获得芝麻蛋白，密封备用。

2）蛋白酶解：

将步骤1）所得芝麻蛋白按料液比1g:10ml（w/v）加入蒸馏水获得芝麻蛋白溶液，调节ph值调节至2.0，加入0.5%(w/v，即每100ml芝麻蛋白溶液中加入0.5g胃蛋白酶)的胃蛋白酶，于37℃搅拌酶解4h；随后调节ph至8.0，加入0.5%复合蛋白酶（w/v，即每100ml芝麻蛋白溶液中加入0.5g复合蛋白酶，复合蛋白酶由质量比为6:1的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶组成），于37℃酶解6h，酶解结束后，调节ph至4.3，8000r/min离心30min，收集上清液，4-10℃低温备用。

3）分离纯化

将步骤2）所得上清液ph调整为7.5，取50ml上清液上样到anxsephroseff树脂柱（500×40mm），随后以4ml/min流速洗脱160min，收集流出液，采用截留分子量3000da的超滤膜进行超滤，透过液采用纳滤（纳滤膜截留分子量为200da）进行脱盐浓缩，然后采用制备液相色谱分离纯化，制备液相色谱的条件为：流动相为含0.1%三氟乙酸的55%甲醇水溶液，即55%(v/v)甲醇溶液（含0.1%(v/v)三氟乙酸），流速8ml/min，上样量4ml，检测波长为220nm，色谱柱为ultimateaq-c18(250×20mmi.d.,5μm)；收集保留时间在22min-23min的组分（见图1），-60℃冷冻干燥24h，获得芝麻多肽样品。

图1给出了实施例1制备的液相分离超滤透过液的色谱图；经过上述分离纯化，体系中依然有其他多肽组分，反映在色谱图中存在的编号p1-p14的色谱峰。分别收集上述色谱峰对应的组分，并测定活性。结果发现色谱峰p8对应的组分活性最强，对组分进行鉴定发现其序列为eaciqack。

将冷冻干燥获得的芝麻多肽样品，通过nano-lc-esi-ms/ms进行分析鉴定（见图2），鉴定该多肽的氨基酸序列为：glu-ala-cys-ile-gln-ala-cys-lys（eaciqack）。合成的上述多肽进行液相质谱分析（见图3和图4），其分子量同nano-lc-esi-ms/ms一致。

实施例2

一种人工合成芝麻多肽的方法，其采用固相合成法人工合成。基本流程如下：首先将一个氨基被fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接到固相载体上了；其次将氨基被fmoc基团保护的第二个氨基酸的羧基用缩合剂活化，活化后的氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从c端向n端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的多肽glu-ala-cys-ile-gln-ala-cys-lys（eaciqack）。合成的芝麻多肽序列的液相质谱分析图见图3和图4，此高纯度合成肽的主要离子峰质荷比为865.03，符合需要合成序列的分子量，说明固相合成成功。

上述采用固相合成法合成芝麻多肽的具体过程参见：①黄惟德、陈常庆著，多肽合成，科学出版社，1985年。②.n.休厄德、h.d.贾库布克著，刘克良等译，肽：化学与生物学，科学出版社，2005年。），该芝麻多肽也可以委托相应的多肽生物公司进行合成，因其化学合成过程不是本申请的重点所在，故本申请此处不再对化学合成过程进行详细赘述。

抗氧化与降血压活性应用试验

下述应用试验中，dpph、abts清除能力、总抗氧化能力frap及ace抑制能力的测定参照如下进行。多肽溶液为将冻干或人工合成的芝麻多肽，加入蒸馏水稀释，配成一定浓度的水溶液。

1）dpph清除测定：取多肽溶液100μl加入于96孔酶标板中，随后加入100μl0.2mmol/ldpph乙醇溶液，振荡30s，室温避光反应30min，在波长517nm处测定吸光度ai，以同样的方法同时测定100μl多肽溶液与100μl乙醇混合后的吸光度aj，以及100μl0.2mmol/ldpph乙醇溶液与100μl乙醇混合后的吸光度ao。dpph自由基清除率(di)计算公式：

调节多肽溶液浓度至0.01～10mg/ml，测定dpph自由基清除率，采用spss24的probit回归计算ic50，即dpph清除率达到50%时对应的浓度。

2）abts清除能力测定：取25μl多肽溶液加入到96孔酶标板中，随后加入200μl3.7mmol/labts溶液，室温避光静置6min，在波长734nm处测定吸光度ai′，分别测定25μl多肽溶液与200μl甲醇混合后的吸光度aj′，25μl甲醇与200μl3.7mmol/labts溶液混合后的吸光度ao′。abts自由基清除率(ai)计算公式如下：

测定不同浓度多肽的abts自由基清除率，采用ibmspss24的概率回归算法，计算ic50。

3）frap测定：可参照文献（a.aleman，contributionofleuandhypresiduestoantioxidantandace-inhibitoryactivitiesofpeptidesequencesisolatedfromsquidgelatinhydrolysate.foodchemistry125(2011)334-341.）进行测定，具体如下：

frap工作液由体积比10:1:1的300mmol/lph3.6乙酸缓冲液、10mmol/l2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪（tptz）和20mmol/lfecl3组成。取150μlfrap工作液加入到96孔板的孔洞中，随后加入25μl、3mg/ml的多肽溶液，混匀后，在暗处37℃反应30min，采用酶标仪测定593nm的吸光度。标准溶液采用0-2mmol/lfeso4的吸光度作为标准，结果表示μmolfeeq/g蛋白，其值越高，抗氧化能力越强。

4）ace抑制能力测定：取马尿酰-组氨酰-亮氨酸(hhl)加入到0.05mol/lph8.2硼酸缓冲液（含0.3mol/l氯化钠）配制成浓度为5mmol/l，取0.125ml加入到离心管中，加入0.025ml4.66mmol/lace溶液和0.025ml的多肽溶液，37℃反应1h，随后加入0.2ml1mol/l盐酸终止反应。取0.4ml吡啶和0.2ml苯磺酰氯加入到溶液中，混匀1min，冷却，410nm测定吸光度（as）。分别测定未加入ace溶液和多肽溶液、未加入多肽溶液的吸光度ab和ac，采用如下公式计算ace抑制率：

采用ibmspss24的概率回归算法，计算ic50。

芝麻多肽的活性应用，以dpph、abts自由基清除能力的ic50、frap值作为抗氧化指标，ace抑制ic50作为降血压指标，测试分析实施例1从芝麻蛋白中提取的芝麻多肽和实施例2采用人工合成的芝麻多肽eaciqack的抗氧化和降血压活性，两者基本一致，均显示较强的抗氧化与降血压能力（见表1）。

表1、实施例1和2所得芝麻多肽eaciqack的相关活性结果

表1给出了实施例1和2制备的芝麻多肽eaciqack的dpph清除、abts清除、总抗氧化能力（frap值）、ace抑制的ic50。由表1可知：本发明芝麻多肽eaciqack具有强抗氧化能力，适宜在极性水溶液体系中作为抗氧化剂使用。同时，该芝麻多肽也有一定的ace抑制能力，可以辅助降血压药物控制病人血压。

表2、本发明芝麻多肽eaciqack安全性预测

注：括号中数字为预测概率，^a预测采用algpred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpred/sub-mission.html)，^b预测采用toxinpred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/design.php)，^c采用admetsar(http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar2/)。

表2给出了本发明芝麻多肽eaciqack的安全性预测。由表2可知：eaciqack无致敏性，无毒，无致癌性，同时，也不会干扰正常的细胞色素450的功能，对人体安全性高。

图5给出了本发明芝麻多肽eaciqack与人体血管紧张素酶结合预测图。由图5可知，eaciqack可以通过氢键同血管紧张素转换酶（ace）中的氨基酸残基glu162,thr166,gln281,ala356,lys511,tyr523发生作用，从而影响ace的空间结构，增加其与底物结合的难度，起到抑制作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。