自噬基因ATG9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用

本发明属于植物学和生物技术领域，具体涉及自噬基因atg9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用。

背景技术：

水稻是世界上种植范围最为广泛也是最为重要的粮食作物之一，也是植物基因组学研究的模式生物之一，为全球超过30亿人口提供食物及能量。随着人口的日益增长，全球气候变化和环境胁迫等，培育高产优质水稻新品种显得尤为重要。水稻的籽粒大小是影响其产量和品质的最重要因素之一。发掘调控籽粒大小的新基因和分子机制，可为将来遗传改良水稻产量品质提供重要的理论基础。

细胞自噬是一种生物进化过程中高度保守的降解机制，主要是将细胞内的组分如受损的细胞器、变性或未折叠的蛋白等转运至液泡或溶酶体中进行降解，继而促使营养物质得以循环利用，达到协助植物在逆境中生存和生长发育的目的。已有的研究表明，细胞自噬广泛参与了植物各个方面的调控，包括花粉育性，水稻分蘖，氮利用和各种胁迫等。值得一提的是，目前尚未发现细胞自噬直接参与产量性状的调控，如籽粒大小。现在有关自噬的研究进展基本上是关于自噬基因的抗衰老、抗逆性和促进植物氮素循环的功能。但有关自噬基因atg9对于水稻粒型的调控并未见报道。

技术实现要素：

本发明目的在于提供自噬基因atg9的应用，特别是自噬基因atg9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

自噬基因atg9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用。

所述的自噬基因atg9的核苷酸序列如序列表中seqidno:1所示。

所述的自噬基因atg9的编码蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示。

所述的水稻育种优选包括对水稻粒型改良的调控。

所述的调控为正调控。

所述的正调控是指在水稻中过表达自噬基因atg9，促进水稻atg9过表达植株株高和穗长显著提高，粒宽、粒长以及百粒重明显增加。自噬基因atg9正调控了籽粒等水稻各组织的大小变化，因此，自噬基因atg9过表达对增加籽粒大小具有重要意义，为水稻产量的提高提供了重要的基因资源。

所述的水稻优选为粳稻。

所述的粳稻优选为中花11。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本发明利用pcr的方法从水稻中克隆出自噬基因atg9(所对应基因座位号与ricegenomeannotationproject中公布的loc_os10g07994相对应)。自噬基因atg9对提高水稻产量和品质具有非凡的意义，可以作为水稻籽粒品质改良的新靶点。

(2)本发明通过crispr/cas9敲除atg9，获得atg9突变体植株。对atg9突变体植株的表型进行详细分析。结果表明，与野生型(wt)相比，atg9突变体植株的株高明显降低，穗长变短、籽粒变小以及百粒重减少。通过深入研究，构建了atg9过表达植株，发现与wt相比，atg9过表达植株株高和穗长显著提高，粒宽粒长以及百粒重亦明显增加，atg9正调控了籽粒等水稻各组织的大小变化。

(3)本发明可以通过深入的研究探索atg9基因的表达调控，结合基因编辑技术，有望创制优异的atg9等位基因，如敲除该基因的沉默子进而提高其表达水平，最终产生与atg9过表达类似的表型(籽粒变大，产量提高)。此外，还可以通过分子操作粒长基因和atg9(如基因聚合)，进一步培育超长粒高产优质水稻。鉴于以往研究，可能可以提高植株的抗逆性，提高水稻对环境的适应性，尤其是对不良环境的适应性。综上所述，我们认为atg9基因是一个潜在的协同水稻产量和抗逆的候选新靶点。

附图说明

图1为atg9的基因编辑：野生型(wt)和突变体(atg9)的序列分析图；其中，该序列分析图通过chromas软件查看比对，gagtggaagcgctcgagtc代表靶位点，pam代表crrna互补序列邻近基序，箭头所指代表突变位点，箭头所指字体t代表插入碱基t。

图2为atg9表型分析结果图；其中，图a从左到右，分别为野生型(wt)、突变体(atg9)和atg9过表达植株的株高结果图，标尺等于15cm；图b从左到右，分别为野生型(wt)、突变体(atg9)和atg9过表达植株的穗型结果图，标尺等于2cm；图c从上到下，分别为野生型(wt)、突变体(atg9)和atg9过表达植株的粒宽结果图，标尺等于0.5cm；图d从上到下，分别为野生型(wt)、突变体(atg9)和atg9过表达植株的粒长结果图，标尺等于0.5cm；图e从左到右，分别为野生型(wt)、突变体(atg9)和atg9过表达植株的百粒重结果图，标尺等于1cm。

图3分别为wt、atg9和atg9过表达表型数据统计结果图；其中，图a为野生型(wt)、突变体(atg9)和atg9过表达(oe)植株的株高结果图；图b为野生型(wt)、突变体(atg9)和atg9过表达(oe)植株的穗长结果图；图c为野生型(wt)、突变体(atg9)和atg9过表达(oe)植株的粒宽结果图；图d为野生型(wt)、突变体(atg9)和atg9过表达(oe)植株的粒长结果图；图e为野生型(wt)、突变体(atg9)和atg9过表达(oe)植株的百粒重结果图。图中数据为平均值±标准差，a、b、c分别代表互相具有显著性差异。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中所使用的实验方法如无说明，均为常规方法。

植物材料：本研究供试材料为粳稻背景(oryzasatival.)。野生型(wt)为中花11(zh11)(公开使用的水稻品种，市售)。atg9突变体植株由本实验室联合中国水稻研究所王克剑课题组利用crispr/cas9方法所创制(具体crispr/cas9方法见参考文献wangc,shenl,fuy,etal.asimplecrispr/cas9systemformultiplexgenomeeditinginrice[j].journalofgeneticsandgenomics,2015,42(12):703-706.)。atg9过表达植株oe水稻由百格基因科技(江苏)有限公司构建。菌株和质粒：实验所用的菌株大肠杆菌dh5α购自广州春泥有限公司；植物过表达载体prhvcgfp由中国农业科学院王国梁课题组提供(植物过表达载体prhvcgfp在hef,zhangf,sunw,etal.aversatilevectortoolkitforfunctionalanalysisofricegenes[j].rice,2018,11(1):27.的补充数据中已公开)；pc1300-cas9和sk-grna载体由中国水稻研究所王克剑课题组提供(pc1300-cas9载体和sk-grna载体已在申请号为：2015104855732，名称为：植物多基因敲除载体的构建及应用的发明专利中公开)。

化学试剂：限制性核酸内切酶kpni、noti、bamhi、bglii和t4dna连接酶购自newenglandbiolabs公司；限制性核酸内切酶aari购自ferment公司；高保真酶kodfx购自toyobo公司；abm反转录试剂盒购自爱必梦生物科技有限公司；胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购自济凡生物科技(北京)有限公司；2×taqpcrstarmix购自北京康润诚业生物科技有限公司。

实施例1：水稻atg9突变体的获得

atg9突变体是根据wangc,shenl,fuy,etal.asimplecrispr/cas9systemformultiplexgenomeeditinginrice[j].journalofgeneticsandgenomics,2015,42(12):703-706.中记载的crispr/cas9技术构建的。

1、靶序列选择及引物设计

以野生型植株atg9基因取19bp大小gagtggaagcgctcgagtc为靶位点，根据靶位点设计引物，如表1。

表1：靶位点引物

2、中间载体构建

atg9-2-g++与atg9-2-g--引物用水稀释至浓度100μm，前引物和后引物各20μl，混合在一起，引物混合后变性退火，100℃变性5分钟，室温冷却，形成带有粘性末端的片段。中间载体sk-grna进行aari酶切，37℃酶切3-6h，试剂盒纯化酶切产物，形成带有粘性末端的载体，酶切体系如表2所示。

表2：aari酶切sk-grna载体体系

将带有粘性末端的载体和带有粘性末端的片段进行连接(摩尔浓度1:3-10)，得到重组质粒1，命名为sk-grna-atg9重组载体。如表3配制体系完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，短暂离心将反应液收集至管底，置于室温0.5-1h。反应产物转化感受态细胞dh5α，将菌液涂布棒在含有amp抗性的平板上轻轻涂匀，将平板倒置，于37℃过夜培养。

表3：重组反应体系

克隆鉴定可用公共引物t3与atg9-2-g--搭配进行菌落pcr阳性检测，利用公共引物t7或t3进行测序检测，验证是否正确。

t7：5’-taatacgactcactatagg-3’

t3：5’-attaaccctcactaaaggga-3’

3、构建至最终载体

pc1300-cas9载体用kpni和bamhi进行酶切回收。sk-grna-atg9重组载体用kpni和bglii进行酶切并回收片段。pc1300-cas9和sk-grna-atg9载体各反应体系如表4-1和4-2所示，37℃双酶切1h。

表4-1：pc1300-cas9载体酶切反应体系

表4-2：sk-grna-atg9重组载体酶切反应体系

并将回收片段连接到线性化的pc1300-cas9载体上，得到重组载体2。连接体系如表5所示，用移液器轻轻吸打混匀各组分，短暂离心将反应液收集至管底，置于室温0.5-1h。反应产物转化感受态细胞dh5α，将菌液涂布棒在含有kan抗性的平板上轻轻涂匀，将平板倒置，于37℃过夜培养。

表5：终载体连接体系

利用测序引物pc1300-f进行测序检测，验证重组载体是否正确。

pc1300-f：5’-acactttatgcttccggctc-3’

4、转农杆菌转化水稻愈伤，获得转基因植株

转农杆菌转化水稻愈伤，获得转基因植株t0代，再将t0代自交繁种，直至获得纯合位点的单突变体(该过程由百格基因科技(江苏)有限公司完成)。通过测序(测序由广州睿博生物技术有限公司完成)比对该基因靶位点，确定该基因在第390位插入了一个t碱基，最终导致其发生移码而提前终止。

5、水稻基因组总dna的提取

提取待测水稻植株叶片基因组dna，在敲除靶位点序列附近设计引物，经pcr扩增后，产物进行测序分析，鉴定其基因靶序列是否发生了改变。

(1)取少量叶片置2ml管子中，加入钢珠，加入400-500μltps溶液；

(2)粉碎机粉碎，75℃水浴30min；

(3)12000rpm离心10min；

(4)取上清(500μl)至1.5ml管子中，加冰冻的等体积无水乙醇，上下混匀；

(5)放置-20℃0.5h以上；

(6)12000rpm离心5min，去上清；

(7)静置0.5h以上，去酒精，干燥；

(8)加100μlddh2o，混合均匀，溶解备用。

6、pcr扩增鉴定

以提取的dna为模板，引物为表6的atg9-f/r，进行pcr扩增，pcr扩增反应体系如表7所示。

表6：pcr扩增的目的片段引物

表7：pcr反应体系

扩增程序为：94℃预变性5min；98℃变性10s、55℃退火30s、68℃延伸60s/1kb，25个循环；68℃总延伸5min，16℃保持1min。反应结束后，取5μl扩增产物加到含核酸染料的1％琼脂糖凝胶中电泳；电泳结束后在紫外成像仪上照胶，检测条带是否扩增出来，如果条带扩增出来，说明该片段是可能包含突变点的目的基因片段。其余pcr产物则送去测序公司进行测序(测序由广州睿博生物技术有限公司完成)。

7、测序比对

将测序结果放入华南农业大学刘耀光院士dsdecodem(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)网站进行比对，根据峰图判断纯杂合位点，单峰则代表纯合位点，双峰则代表杂合位点。结果如图1所示，突变位点插入t的并为单峰则表示该植株即纯合的atg9突变体植株。

实施例2：atg9过表达植株的构建

植物过表达载体prhvcgfp由中国农业科学院王国梁课题组提供(植物过表达载体prhvcgfp已在hef,zhangf,sunw,etal.aversatilevectortoolkitforfunctionalanalysisofricegenes[j].rice,2018,11(1):27.的补充数据中公开)

1、prhvcgfp-atg9过表达载体的构建

(1)目的基因扩增

取wt叶片的cdna为模板(根据abm反转录试剂盒说明书操作)，根据目的基因设计引物(表8)，经过pcr扩增得到目的基因，扩增pcr体系如表9所示：

表8：pcr扩增的目的片段引物

表9：目的基因pcr反应体系

扩增程序为：94℃预变性5min；98℃变性10s、55℃退火30s、68℃延伸60s，32个循环；68℃总延伸5min，16℃保持1min。反应结束后，取50μl扩增产物加到含核酸染料的1％琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后在紫外成像仪上照胶，检测条带是否扩增出来。如果目的条带扩增出来，说明扩增片段中可能含有目的基因。将目的条带切割起来，继续胶回收纯化产物(根据胶回收试剂盒说明书操作)以及浓度测定。

(2)制备线性化载体

分别取过表达载体prhvcgfp和目的基因各3μg(根据质粒抽提试剂盒说明书操作)，两个反应体系都加入相应限制性核酸内切酶37℃双酶切20min。过表达载体prhvcgfp和目的基因各反应体系如表10所示：

表10：酶切反应体系

取50μl反应产物加到含核酸染料的1％琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后在紫外成像仪上照胶，目的条带分离出来后，将目的条带切割起来，继续胶回收纯化产物以及浓度测定。

(3)重组反应

用t4dna连接酶将插入片段和载体按比例重组在起来，得到prhvcgfp-atg9过表达载体。最适载体与插入片段摩尔比为1:(2-3)。这些摩尔数对应的dna质量可由以下公式粗略计算获得：最适载体使用量x＝[0.02×载体碱基对数]ng(0.03pmol)。最适插入片段使用量y＝[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)或＝[0.06×插入片段碱基对数]ng(0.09pmol)。重组反应体系如表11：

表11：重组反应体系

体系配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，短暂离心将反应液收集至管底。置于16℃反应6-8h。反应产物可直接进行转化，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

(4)重组产物转化、涂板

在冰上解冻克隆感受态细胞dh5α。取10μl冷却重组产物(prhvcgfp-atg9过表达载体)，加入到100μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min；42℃热激60秒，冰浴孵育2min，加入900μllb培养基，37℃，200rpm，摇菌30min，5000rpm离心3min，弃掉上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有kan抗性的平板上轻轻涂匀。待菌液被吸收，将平板倒置，于37℃过夜培养。

(5)克隆鉴定

最方便快捷的方法是菌落pcr。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至500μllb培养基中混匀，直接取1μl作为pcr模板，剩余菌液后续做测序鉴定。所用引物如表6，进行pcr反应，反应体系如表12：

表12：菌落pcr反应体系

扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，25个循环；72℃总延伸5min，16℃保持1min。反应结束后，取20μl扩增产物加到含核酸染料的1％琼脂糖凝胶中电泳；电泳结束后在紫外成像仪上照胶，检测条带是否扩增出来。如果条带扩增出来，则将克隆送去测序公司进行测序(测序由广州睿博生物技术有限公司完成)。

2、转基因植物遗传转化与鉴定

将构建好的prhvcgfp-atg9过表达载体送去百格基因科技(江苏)有限公司做遗传转化，至得到t0代植株。对得到的转基因植株进行鉴定，由于prhvcgfp-atg9过表达载体带hyg潮霉素标签，所以只需要通过鉴定有无潮霉素标记判断是否是转基因植株。提取待测植株叶片的总基因组dna，采用引物hyg(表13)进行pcr扩增，通过跑琼脂糖凝胶电泳判断pcr产物的条带大小是否符合，符合即为含有目的基因的转基因植株(即atg9过表达植株)。pcr扩增方法参考植物prhvcgfp-atg9过表达载体构建方法中的步骤(5)克隆鉴定的pcr反应体系和pcr扩增程序，反应结束后，取5μl扩增产物加到含有核酸染料的1％琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后在紫外成像仪上照胶，观察是否有目的条带。t0代植株自交，得到t1代植株，t1代植株自交，再得到t2代纯合的atg9过表达植株。

表13：hyg鉴定引物

实施例3：atg9表型分析

本发明人在广东省增城实验基地试验田和广东省广州市华南农业大学农场播种粳稻品种野生型(wt)、突变体(atg9)和atg9过表达植株(oe)，在水稻生长过程中统计成熟期的株高、穗长，待到收种时，测量粒宽、粒长和百粒重。

待测植株：野生型(wt)、突变体(atg9)和atg9过表达植株(oe)。

分别取待测植株，详细分析成熟期的株高、穗长、粒宽、粒长和百粒重，并对其进一步的测量统计。结果如图2和图3所示。表型分析发现，与野生型(wt)相比，atg9突变体表现出多种生长发育缺陷的表型，包括株型变矮，穗长变短，籽粒长度变短以及百粒重减少。与wt相比，oe的株高和穗长显著提高，粒宽粒长以及百粒重亦明显增加。以上结果表明，atg9过表达正调控了多个水稻重要农艺性状，是潜在的改良水稻产量和品质的新靶点。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南农业大学

<120>自噬基因atg9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用

<160>17

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2784

<212>dna

<213>artificialsequence(人工序列)

<223>自噬基因atg9的核苷酸序列

<400>1

atgatgtccttccttccgaagggcaaaactacacaaacagcgtttaagtggccatggaga60

ggtgaatcgcagctatcggcgcatcttctcattgatattccacctgaaatcgaattgtcg120

gactaccgaagattgccaagccctggtaatgagagcccatcagggctacttcatggagaa180

gactttaaggaggaggtgatccctgacttggatattttctttgagaggctctatgagtat240

ttctgcgcgaaaggtctgcggtgcatcatcaccaagtggataattgagatcctcaatgtg300

acgtttatggtttgctgtatcgggtttttcttcttgtttgttgattggcctgcccttggc360

gatttgaaatgtggagtggaagcgctcgagtcaggggcaaaaccttgtgacctaatgaaa420

ctcattaagtatcgtcccctagatcctttcacatttacaaagtttatcactattggatcc480

atggttatactctcaacttacggaatcattaactttgtgaagttttttgtaaaactgaga540

agcacactcaaggtccgtgacttctactgtaacagtctcaaggttacagatctcgaaatt600

cagactatatcatggcctagagtagttgagaaggtcgtacttctgcagaagtcacaacga660

ctttgtgtcgttaaagatctcacggagcatgatataatcatgcgaataatgcgtaaacaa720

aactacctgattgggatggttaataaaggtatcatcgcattgccaatcccctcttggctt780

cctggagttggcccaactgtcagctcacgtatgcatggaaaaaaaagctatctgatgctt840

ccaaaggccctggagtggacattgaattggtgcatcttccaaaccatgtttgataggaaa900

ttttgtgttagaaaagacattctgacaagtccgtctttattgaagaaacggcttgtattt960

atgggtattgccatgtttcttctgtcaccttgtcttgttatcttcccattggtataccta1020

tttctgagatatgcagaagaattctacaatcaccccagtacggcatcatctcgaaaatgg1080

tcgaatctttcaaagtggattttgagggaatacaatgaggttgaccatttcttcaaacat1140

aggttgaacaacagtagtgtcaactcactaaattatttgaagcagtttccaactccacta1200

gtatctattattgcaaaattcatatcgtttgtatctggtggattggctggaattcttctc1260

atccttggatttctaggtgaatccatccttgagggtcatgtatttggccgaaatcttctc1320

tggtatactattgtttttggaacaatagcaactgttagtcggaatgttgtggttgatgaa1380

ctccaagtgattgatccagaaggagctatgtcctttgttctgcagcagacacactacatg1440

cctaaaaggtggcgcggtaaagagggcagtgaacttgtacgaagggactttgaatctctg1500

tttcagtataccataacgatgctactagaagagatggcctcaattttcatcactccatat1560

ctgctaatatttgtggttccaaagcgtgttgatgatattctacgcttcatatcagacttc1620

acagtttatgttgatggagtgggagatgtgtgcagcttaagcatgttcgacttaagaaga1680

catggaaatagaaactacggttcaccacataatgcagttaaaagcatgagaagctcccaa1740

ggaaaaatggagaaatcactattaagtttccaaagcacctacacatcatgggagccaaac1800

gcagatggcaagaaatttatttgcaacctccagaaattcaaggagaaacaaatccgtcaa1860

catacctttcaaacaacggaatcatcacagcttgggttgagttgtagaggtcaaactgca1920

gttttccatcgactgctccctagaaacatctatcctggcaatggggtcatttttaacttt1980

gatccattaggactgctcgacacagatcaaagagcttgtccatatatcctggattggtat2040

tacacacaccaacacacaaatagagaagcgggctcatcttcccaccttaatgaagcatca2100

cctgagcaacaggaggagatatggccacctctgagcaaaccattaacagaaattgaagat2160

gagcaaatctgggattctgatttatatagaagagctcgaagctacctggaggcatcaaca2220

tcaagtgcattctttcgacaggccaccaccttcaagcgccatggcagggaacaaaattct2280

accagccatcaatggtgggctcaggcctcgaggcagcaggctgatccacgaaacagtttt2340

caagggcctcctcaagacagttttcttgagcctccggacttccgaaatcatttggaagct2400

agccatgattccagccatcaaagtgattgtaggctgacctccagaaggtcaactgatcca2460

caagacagcttcgttgagcctcctgattttggtgattacatgtcctgtcatagctctagc2520

tatcatggcgatgaaacgtcggatggaaactcagaactagatcaaagcaacaatagttgg2580

cgaagcccccatgccctgtcaaagacaaggtacatgggtgatgatgatcttgacctagaa2640

caaggcccgagtttccattttactgatgcccctcagaaggacagtggaagtgaaggagat2700

ggacatggtgtagccaatatttacagctctacgccagccagccttcctgtacggataata2760

cctagaagcagtgacccagtttag2784

<210>2

<223>自噬基因atg9的氨基酸序列

<400>2

metmetserpheleuprolysglylysthrthrglnthralaphelys

151015

trpprotrpargglygluserglnleuseralahisleuleuileasp

202530

ileproprogluilegluleuserasptyrargargleuproserpro

354045

glyasngluserproserglyleuleuhisglygluaspphelysglu

505560

gluvalileproaspleuaspilephephegluargleutyrglutyr

65707580

phecysalalysglyleuargcysileilethrlystrpileileglu

859095

ileleuasnvalthrphemetvalcyscysileglyphephepheleu

100105110

phevalasptrpproalaleuglyaspleulyscysglyvalgluala

115120125

leugluserglyalalysprocysaspleumetlysleuilelystyr

130135140

argproleuaspprophethrphethrlyspheilethrileglyser

145150155160

metvalileleuserthrtyrglyileileasnphevallysphephe

165170175

vallysleuargserthrleulysvalargaspphetyrcysasnser

180185190

leulysvalthraspleugluileglnthrilesertrpproargval

195200205

valglulysvalvalleuleuglnlysserglnargleucysvalval

210215220

lysaspleuthrgluhisaspileilemetargilemetarglysgln

225230235240

asntyrleuileglymetvalasnlysglyileilealaleuproile

245250255

prosertrpleuproglyvalglyprothrvalserserargmethis

260265270

glylyslyssertyrleumetleuprolysalaleuglutrpthrleu

275280285

asntrpcysilepheglnthrmetpheasparglysphecysvalarg

290295300

lysaspileleuthrserproserleuleulyslysargleuvalphe

305310315320

metglyilealametpheleuleuserprocysleuvalilephepro

325330335

leuvaltyrleupheleuargtyralaglugluphetyrasnhispro

340345350

serthralaserserarglystrpserasnleuserlystrpileleu

355360365

argglutyrasngluvalasphisphephelyshisargleuasnasn

370375380

serservalasnserleuasntyrleulysglnpheprothrproleu

385390395400

valserileilealalyspheileserphevalserglyglyleuala

405410415

glyileleuleuileleuglypheleuglygluserileleuglugly

420425430

hisvalpheglyargasnleuleutrptyrthrilevalpheglythr

435440445

ilealathrvalserargasnvalvalvalaspgluleuglnvalile

450455460

aspprogluglyalametserphevalleuglnglnthrhistyrmet

465470475480

prolysargtrpargglylysgluglysergluleuvalargargasp

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hisglyasnargasntyrglyserprohisasnalavallyssermet

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thrtyrthrsertrpgluproasnalaaspglylyslyspheilecys

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