一种高通量柑橘黄龙病叶脉DNA的提取方法与流程

【技术领域】

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种高通量柑橘黄龙病叶脉dna的提取方法。

背景技术：

柑橘黄龙病(citrushuanglongbing，hlb)是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害之一，植株感染黄龙病后，轻则树势衰退，产量下降柑橘，品质降低，重则3-5年内枯死，且其发生面积广、损失巨大。

目前柑橘黄龙病没有有效的防治药剂，属可防可控不可治病害，其综合防控措施主要是种无病苗、严防柑橘木虱、砍伐病树、种植隔离带等。为减少损失，广西在全国率先颁布了地方性法规《广西壮族自治区柑橘黄龙病防控规定》，采取引导和鼓励措施；柑橘种植者、柑橘种苗繁育者是柑橘黄龙病防控主体；建立监测预警机制，明确鉴定检测程序；完善柑橘种苗检疫监管机制；县级人民政府或者乡镇人民政府清除柑橘黄龙病病株是应对柑橘黄龙病自然灾害必须采取的应急处置措施。不管是苗木检疫还、挖除病树、监测预警，控制传染源，首先都要都要对病树进行诊断。

长期以来对柑橘黄龙病主要是根据田间症状来进行诊断，其典型症状有黄梢、斑驳黄化叶、红鼻子，但不同品种，表现症状不尽相同，且田间表现症状复杂。目前仅有斑驳叶和红鼻子果出现时，才能田间作为确诊柑橘树已感染黄龙病的依据，但有些柑橘品种早期不易出现这两种症状，有的品种出现落果，但叶片正常，有的品种幼树仅出现黄梢，因此pcr检测技术是精准诊断其是否感染黄龙病的技术，在检疫、监测预警、防控诊断上能发挥重要作用。

然而柑橘黄龙病病原菌聚集最多的是叶脉，与其他检测不一样，其他检测检测叶片即可。叶片磨样很容易，机磨效果也很好，便于开展大规模的监测，很好地为产业服务。而检测柑橘黄龙病需要剪柑橘叶脉磨样，柑橘叶脉比叶片难磨，特别是老叶叶脉，还有橙、柚子的叶脉又大，磨样非常花时间，这样就大大降低了检测的速率，导致检测所需时间长，不利于大规模、高效率的开展检测工作。发明人也参照了别人用机器研磨的方法研磨柑橘叶脉，但是出现研磨不碎、提取效果不佳、dna降解等情况。

技术实现要素：

鉴于上述内容，有必要提供一种高通量柑橘黄龙病叶脉dna的提取方法，利用机器研磨柑橘叶脉，在同样的时间内磨样数量大大增加。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种高通量柑橘黄龙病叶脉dna的提取方法，所述提取方法包括以下步骤：

(1)称取200mg叶基部叶脉样品，并切碎；

(2)将切碎后的叶基部叶脉样品放入到2ml的圆底离心管a中，并在离心管a内放入两颗直径3mm钢珠；

(3)将离心管a放入研磨机磨样盒孔内，将磨样盒浸入分装好液氮的泡沫箱中，浸泡液氮后迅速装入研磨机进行研磨，研磨好后放入-70℃冰箱待批量提取；

(4)将步骤(3)所得物料加入植物快捷提取试剂盒中，摇晃一次；

(5)在经步骤(4)处理后的植物快捷提取试剂盒中加入6ul的rnasea，旋涡振荡1min，接着于常温下放置10min；

(6)在经步骤(4)处理后的植物快捷提取试剂盒中加入130ul的缓冲液fp2，充分混匀，旋涡振荡1min；接着在12000rpm的转速下离心处理8min，将上清液转至新的离心管b中；再次于12000rpm的转速下离心5min，将所得上清液继续转至离心管b中；

(7)用分液器向离心管b中加入占上清液0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，在12000rpm的转速下离心处理2min；

(8)向经步骤(7)处理后的离心管b中加入600ul体积分数为70％乙醇，摇匀，于12000rpm的转速下离心处理2min，然后弃去上清液，重复上述操作一次；

(9)开盖倒置，于室温下静置，彻底晾干残留的乙醇；用分液器加入60ul的洗脱缓冲液te，颠倒混匀数次帮助溶解，即可得到溶解的柑橘黄龙病叶脉dna。

本发明中，进一步地，所述步骤(3)还包括将研磨后的成品置于-70℃冰箱保存。

本发明中，进一步地，所述步骤(3)中泡液氮、研磨的具体方式为：泡液氮50-70s，接着放入研磨机研磨25-35s，再泡液氮50-70s，最后再研磨25-35s，研磨频率为45-60hz。

本发明中，进一步地，所述泡液氮、研磨的具体方式为：泡液氮60s，接着放入研磨机研磨30s，再泡液氮60s，最后再研磨30s，研磨频率为60hz。

本发明中，进一步地，所述步骤(3)中泡液氮、研磨的具体方式为：泡液氮60s，接着放入研磨机研磨60s，其中，研磨频率为55hz。

本发明中，进一步地，所述步骤(4)中的植物快捷提取试剂盒包括400ul的缓冲液fp1。

本发明中，进一步地，所述步骤(5)中加入的rnasea的浓度为10mg/ml。

检测方法：手磨的样品中挑取p1、p4、c2、c6、y3、y5共6个样品，采用本发明方法研磨后提取dna，再用1％琼脂糖凝胶电泳上检测dna提取效果，然后采用黄龙病亚洲种的16srdna特异引物fd1/fd2和oi1/oi2进行nested-pcr扩增，扩增结果在1％琼脂糖凝胶电泳上检测，看样品是否感染黄龙病。

本发明具有如下有益效果：

本发明利用机器研磨柑橘叶脉，在同样的时间内磨样数量大大增加，且能够保证样品的研磨程度，通过在离心管内放入钢珠研磨加速黄龙病菌细胞裂解，从而有效提高黄龙病菌dna得率，将离心管放入研磨机研磨板孔内，泡液氮后放入研磨机内进行研磨，浸泡液氮能够使叶脉快速地达到低温，防止组织破坏，导致dna降解，另外在液氮中叶脉组织内水分会形成结晶，植物组织会变脆，可以充分的研磨以释放dna。此外，申请人还研究了研磨频率、时间对dna提取的影响，优化提取参数，同时利用分液器，采用试剂盒直接提取dna，简单方便，加快柑橘黄龙病检测的效率，且确保检测结果准确，进而能大规模地开展柑橘黄龙病检测工作，为促进柑橘产业健康可持续发展提供技术服务。

【附图说明】

图1是采用常规液氮手磨方法提取得到的dna琼脂糖凝胶电泳检测结果图；

图2是采用常规液氮手磨方法提取得到的dna的dna的nested-pcr产物电泳检测结果图；

图3是采用本申请方法研磨提取得到的dna琼脂糖凝胶电泳检测结果图；

图4是采用本申请方法研磨提取得到的dna的nested-pcr产物电泳检测结果图；

图5是试验二中第一组所述的方式提取得到的dna琼脂糖凝胶电泳检测结果图；

图6是试验二中第二组所述的方式提取得到的dna琼脂糖凝胶电泳检测结果图；

图7是试验二中第三组所述的方式提取得到的dna琼脂糖凝胶电泳检测结果图；

图8是试验二中第四组所述的方式提取得到的dna琼脂糖凝胶电泳检测结果图；

图9是试验三中第五组所述的方式提取得到的dna琼脂糖凝胶电泳检测结果图；

图10是试验三中第六组所述的方式提取得到的dna琼脂糖凝胶电泳检测结果图；

图11是试验三中第七组所述的方式提取得到的dna琼脂糖凝胶电泳检测结果图；

图12是试验三中第八组所述的方式提取得到的dna琼脂糖凝胶电泳检测结果图；

图13是试验三的图10中的9-16条带泡液氮60s，研磨60s，频率55hz研磨提取的dna的nested-pcr产物电泳检测结果图。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

本申请所使用的研磨机为(上海净信实业发展有限公司多样品组织研磨仪tissuelyser-48)、快捷提取试剂盒为(tiangendnaquickplantsystem快捷型植物基因组dna提取系统(非离心柱型))

实施例1：

本实施例提供一种高通量柑橘黄龙病叶脉dna的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：

(1)称取200mg叶基部叶脉样品，并切碎；

(2)将切碎后的叶基部叶脉样品放入到2ml的圆底离心管a中，并在离心管a内放入两颗直径3mm钢珠；

(3)将离心管a放入研磨机研磨盒孔内，泡液氮50s，接着放入研磨机研磨25s，再泡液氮50s，最后再研磨25-35s；将研磨后的成品置于-70℃冰箱保存；上述中提及的研磨为在45hz的频率下进行研磨；

(4)将步骤(3)所得物料加入植物快捷提取试剂盒中fp1400ul；

(5)在经步骤(4)处理后的植物快捷提取试剂盒中加入6ul的rnasea，旋涡振荡1min，接着于常温下放置10min；其中，rnasea的浓度为10mg/ml；

(6)在经步骤(4)处理后的植物快捷提取试剂盒中加入130ul的缓冲液fp2，充分混匀，旋涡振荡1min；接着在12000rpm的转速下离心处理8min，将上清液转至新的离心管b中；再次于12000rpm的转速下离心5min，将所得上清液继续转至离心管b中；

(7)用分液器向离心管b中加入占上清液0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，在12000rpm的转速下离心处理2min；

(8)向经步骤(7)处理后的离心管b中加入600ul体积分数为70％乙醇，摇匀，于12000rpm的转速下离心处理2min，然后弃去上清液，重复上述操作一次；

(9)开盖倒置，于室温下静置，彻底晾干残留的乙醇；用分液器加入60ul的洗脱缓冲液te，颠倒混匀数次帮助溶解，即可得到溶解的柑橘黄龙病叶脉dna。

实施例2：

本实施例提供一种高通量柑橘黄龙病叶脉dna的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：

(1)称取200mg叶基部叶脉样品，并切碎；

(2)将切碎后的叶基部叶脉样品放入到2ml的圆底离心管a中，并在离心管a内放入两颗直径3mm钢珠；

(3)将离心管a放入研磨机研磨板盒内，泡液氮60s，接着放入研磨机研磨30s，再泡液氮60s，最后再研磨30s；将研磨后的成品置于-70℃冰箱保存；上述中提及的研磨为在60hz的频率下进行研磨；

(4)将步骤(3)所得物料加入植物快捷提取试剂盒中fp1400ul；

(5)在经步骤(4)处理后的植物快捷提取试剂盒中加入6ul的rnasea，旋涡振荡1min，接着于常温下放置10min；其中，rnasea的浓度为10mg/ml；

(6)在经步骤(4)处理后的植物快捷提取试剂盒中加入130ul的缓冲液fp2，充分混匀，旋涡振荡1min；接着在12000rpm的转速下离心处理8min，将上清液转至新的离心管b中；再次于12000rpm的转速下离心5min，将所得上清液继续转至离心管b中；

(7)用分液器向离心管b中加入占上清液0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，在12000rpm的转速下离心处理2min；

(8)向经步骤(7)处理后的离心管b中加入600ul体积分数为70％乙醇，摇匀，于12000rpm的转速下离心处理2min，然后弃去上清液，重复上述操作一次；

(9)开盖倒置，于室温下静置，彻底晾干残留的乙醇；用分液器加入60ul的洗脱缓冲液te，颠倒混匀数次帮助溶解，即可得到溶解的柑橘黄龙病叶脉dna。

实施例3

本实施例提供一种高通量柑橘黄龙病叶脉dna的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：

(1)称取200mg叶基部叶脉样品，并切碎；

(2)将切碎后的叶基部叶脉样品放入到2ml的圆底离心管a中，并在离心管a内放入两颗3mm钢珠；

(3)将离心管a放入研磨机研磨盒孔内，泡液氮70s，接着放入研磨机研磨35s，再泡液氮70s，最后再研磨35s；将研磨后的成品置于-70℃冰箱保存；上述中提及的研磨为在60hz的频率下进行研磨；

(4)将步骤(3)所得物料加入植物快捷提取试剂盒中fp1400ul；

(5)在经步骤(4)处理后的植物快捷提取试剂盒中加入6ul的rnasea，旋涡振荡1min，接着于常温下放置10min；其中，rnasea的浓度为10mg/ml；

(6)在经步骤(4)处理后的植物快捷提取试剂盒中加入130ul的缓冲液fp2，充分混匀，旋涡振荡1min；接着在12000rpm的转速下离心处理8min，将上清液转至新的离心管b中；再次于12000rpm的转速下离心5min，将所得上清液继续转至离心管b中；

(7)用分液器向离心管b中加入占上清液0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，在12000rpm的转速下离心处理2min；

(8)向经步骤(7)处理后的离心管b中加入600ul体积分数为70％乙醇，摇匀，于12000rpm的转速下离心处理2min，然后弃去上清液，重复上述操作一次；

(9)开盖倒置，于室温下静置，彻底晾干残留的乙醇；用分液器加入60ul的洗脱缓冲液te，颠倒混匀数次帮助溶解，即可得到溶解的柑橘黄龙病叶脉dna。

实施例4

本实施例提供一种高通量柑橘黄龙病叶脉dna的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：

(1)称取200mg叶基部叶脉样品，并切碎；

(2)将切碎后的叶基部叶脉样品放入到2ml的圆底离心管a中，并在离心管a内放入两颗直径3mm钢珠；

(3)将离心管a放入研磨机研磨盒孔内，泡液氮60s，接着放入研磨机研磨60s；将研磨后的成品置于-70℃冰箱保存；上述中提及的研磨为在55hz的频率下进行研磨；

(4)将步骤(3)所得物料加入植物快捷提取试剂盒中fp1400ul；

(5)在经步骤(4)处理后的植物快捷提取试剂盒中加入6ul的rnasea，旋涡振荡1min，接着于常温下放置10min；其中，rnasea的浓度为10mg/ml；

(6)在经步骤(4)处理后的植物快捷提取试剂盒中加入130ul的缓冲液fp2，充分混匀，旋涡振荡1min；接着在12000rpm的转速下离心处理8min，将上清液转至新的离心管b中；再次于12000rpm的转速下离心5min，将所得上清液继续转至离心管b中；

(7)用分液器向离心管b中加入占上清液0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，在12000rpm的转速下离心处理2min；

(8)向经步骤(7)处理后的离心管b中加入600ul体积分数为70％乙醇，摇匀，于12000rpm的转速下离心处理2min，然后弃去上清液，重复上述操作一次；

(9)开盖倒置，于室温下静置，彻底晾干残留的乙醇；用分液器加入60ul的洗脱缓冲液te，颠倒混匀数次帮助溶解，即可得到溶解的柑橘黄龙病叶脉dna。

试验及结果

试验一：

分别采了有斑驳叶的椪柑p1、p2、p3样品，叶片正常的椪柑p4、p5、p6样品；有斑驳叶的红江橙c1、c2、c3样品，叶片正常的红江橙c4、c5、c6样品；有斑驳叶的沙田柚y1、y2、y3样品，叶片正常的沙田柚y4、y5、y6样品；共计18个样品。采用常规液氮手磨方法，然后提取dna，48个样品，需要2天。

如图1所示，为上述手磨样品的dna跑胶图片，图中，m:mark；1:p1；2:p2；3:p3；4:p4；5:p5；6:p6；7:c1；8:c2；9:c3；10:c4；11:c5；12:c6；13:y1；14:y2；15:y3；16:y4；17:y5；18:y6。如图2所示，为nested-pcr产物跑胶结果图片，图中，m:mark；1:p1；2:p2；3:p3；4:p4；5:p5；6:p6；7:c1；8:c2；9:c3；10:c4；11:c5；12:c6；13:y1；14:y2；15:y3；16:y4；17:y5；18:y6。

从手磨的样品中挑取p1、p4、c2、c6、y3、y5共6个样品，采用本发明方法进行研磨，然后提取dna，需要0.5天。

如图3所示，为本发明实施例2所述的方法进行研磨，然后提取dna后的dna跑胶结果图片；如图4所示，为nested-pcr产物跑胶结果图片。

结论：机磨比手磨节约时间，假如48个样品，就可以节约1.5天时间，如果大批量提取,节约的时间就更多，对比起来更高效，而且提取的dna的nested-pcr产物跑胶结果显示，检测结果与手磨检测结果一致，且黄龙病菌量底的也可以检测出来。说明上述方法提取的柑橘黄龙病叶脉dna完全可用于nested-pcr检测。

试验二：

为了说明本申请中部分参数(泡液氮时间、研磨时间)的实用价值，申请人设置以下对比组(第一组至第四组)，观察不在本申请保护范围中的参数下dna的提取情况：

第一组：不泡液氮，研磨时间为1min，其他方式严格按照实施例2进行；其dna跑胶图片如图5所示；其中，m:mark；1:p1；2:p2；3:p3；4:p4；5:p5；6:p6；7:c1；8:c2；9:c3；10:c4；11:c5；12:c6；13:y1；14:y2；15:y3；16:y4；17:y5；18:y6。根据图5可知，由第一组的方式提取得到的dna由于没有液氮低温速冻，导致酶活性高，降解较多，提取效果不好。

第二组：泡液氮30s，研磨时间为1min，其他方式严格按照实施例2进行；其dna跑胶图片如图6所示；其中，m:mark；1:p1；2:p2；3:p3；4:p4；5:p5；6:p6；7:c1；8:c2；9:c3；10:c4；11:c5；12:c6；13:y1；14:y2；15:y3；16:y4；17:y5；18:y6。根据图6可知，由第二组的方式提取得到的dna有降解，原因是泡液氮时间不够长，部分dna降解，导致提取量不均匀，提取纯度不好。

第三组：泡液氮3min，研磨时间为1min，其他方式严格按照实施例2进行；其dna跑胶图片如图7所示；其中，m:mark；1:p1；2:p2；3:p3；4:p4；5:p5；6:p6；7:c1；8:c2；9:c3；10:c4；11:c5；12:c6；13:y1；14:y2；15:y3；16:y4；17:y5；18:y6。根据图7可知，由第三组的方式提取得到的dna由于研磨时，泡液氮时间较长导致使叶脉变硬，研磨时只有少量磨碎，提取到少量的dna，提取效果不好。

第四组：泡液氮时间4min，研磨1min，其他方式严格按照实施例2进行；其dna跑胶图片如图8所示；其中，m:mark；1:p1；2:p2；3:p3；4:p4；5:p5；6:p6；7:c1；8:c2；9:c3；10:c4；11:c5；12:c6；13:y1；14:y2；15:y3；16:y4；17:y5；18:y6。根据图8可知，由第四组的方式提取得到的dna由于泡液氮的时间过长，叶脉变得过硬，增加了研磨难度，导致样品研磨不够碎，基本提取不成功。

试验三：

在摸索出泡液氮时间60s，研磨30s，再泡液氮60s，研磨30s，研磨频率60hz，提取的dna效果较好后，申请人又对以上进行了进一步的摸索。因为研磨时间频率过大，会出现裂管的现象，然后重复泡液氮研磨，操作增加。因此，我们又设计了，以下实验。

采取的样品为已知结果的不同品种的病树的斑驳叶和健康树叶。分别为椪柑病树斑驳叶(gb1,gb2......gb12),正常树上叶片(gz1,gz2......gz12)；红江橙病树斑驳叶(cb1,cb2......cb12),正常树上叶片(cz1,cz2......cz12)；沙田柚病树斑驳叶(yb1,yb2......yb12),正常树上叶片(yz1,yz2......yz12)；蜜柚病树斑驳叶(mb1,mb2......mb12),正常树上叶片(mz1,mz2......mz12)。

图9中，m:mark；1:gb1；2:gz1；3:cb1；4:cz1；5:yb1；6:yz1；7:mb1；8:mz1；9:gb2；10:gz2；11:cb2；12:cz2；13:yb2；14:yz2；15:mb2；16:mz2；17:gb3；18:gz3；19:cb3；20:cz3；21:yb3；22:yz3；23::mb3；24:mz3。其中，1-8条带泡液氮30s，研磨30s，频率55hz的检测带型；9-16条带为泡液氮30s，研磨60s，频率55hz的检测带型；17-24条带为泡液氮30s，研磨90s，频率55hz的检测带型。(设置为第五组)

图10中，m:mark；1:gb4；2:gz4；3:cb4；4:cz4；5:yb4；6:yz4；7:mb4；8:mz4；9:gb5；10:gz5；11:cb5；12:cz5；13:yb5；14:yz5；15:mb5；16:mz5；17:gb6；18:gz6；19:cb6；20:cz6；21:yb6；22:yz6；23::mb6；24:mz6。其中，1-8条带泡液氮60s，研磨30s，频率55hz的检测带型；9-16条带为泡液氮60s，研磨60s，频率55hz的检测带型；17-24条带为泡液氮60s，研磨90s，频率55hz的检测带型。(设置为第六组)

图11中，m:mark；1:gb7；2:gz7；3:cb7；4:cz7；5:yb7；6:yz7；7:mb7；8:mz7；9:gb8；10:gz8；11:cb8；12:cz8；13:yb8；14:yz8；15:mb8；16:mz8；17:gb9；18:gz9；19:cb9；20:cz9；21:yb9；22:yz9；23::mb9；24:mz9；其中，1-8条带泡液氮30s，研磨30s，频率50hz的检测带型；9-16条带为泡液氮30s，研磨60s，频率50hz的检测带型；17-24条带为泡液氮30s，研磨90s，频率50hz的检测带型。(设置为第七组)

图12中，m:mark；1:gb10；2:gz10；3:cb10；4:cz10；5:yb10；6:yz10；7:mb10；8:mz10；9:gb11；10:gz11；11:cb11；12:cz11；13:yb11；14:yz11；15:mb11；16:mz11；17:gb12；18:gz12；19:cb12；20:cz12；21:yb12；22:yz12；23:mb12；24:mz12；其中，1-8条带泡液氮30s，研磨30s，频率45hz的检测带型；9-16条带为泡液氮30s，研磨60s，频率45hz的检测带型；17-24条带为泡液氮30s，研磨90s，频率45hz的检测带型。(设置为第八组)

结合上述图9-图12可知，图10中的9-16条带泡液氮60s，研磨60s，频率55hz研磨提取的dna条带最亮，其nested-pcr产物跑胶结果如图13所示，图13中，m:mark；阴性对照；阳性对照；1:gb5；2:gz4；5:cb5；4:cz5；5:yb5；6:yz5；7:mb5；8:mz5。从图13(nested-pcr产物跑胶结果)可知，正常叶片检测结果为阴性，斑驳叶片检测结果为阳性，检测结果与所选样品结果一致。

结论：通过dna琼脂糖电泳跑胶，发现泡液氮60s，研磨60s，频率55hz提取的dna条带最清晰，效果最好。按照这样计算，一台磨样机，按一天7小时工作计算，可以磨样2000个左右。大大提升了磨样的效率。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。