一种高通量药敏检测试剂盒及其使用方法和应用与流程

本发明涉及药敏检测
技术领域：
，尤其涉及一种高通量药敏检测试剂盒及其使用方法和应用。
背景技术：
：结核病(tuberculosis，tb)是由结核分枝杆菌所引起的一种慢性空气传染疾病，虽然结核分枝杆菌主要是侵染肺部，但是它几乎可以侵入人体全身的各种器官，它一直是威胁全球人类健康的重大公共卫生问题。非结核分枝杆菌(nontuberculosismycobacteria，ntm)是指除结核杆菌及麻风杆菌以外的所有分枝杆菌，也称为环境分枝杆菌。非结核分枝杆菌广泛存在于自然界的土壤、尘埃、水、鱼类和家禽中，传播途径主要是从环境中获得感染，例如污水，而人与人之间的传染极少见。非结核分枝杆菌属于条件致病菌，健康人的呼吸道可有某些类型的非结核分枝杆菌寄植，当口腔和呼吸道卫生状况改善后可消失。通常非结核分枝杆菌对人类致病性较结核分枝杆菌低，但如果存在易感因素，使宿主局部或全身免疫功能发生障碍，也可导致病变。迄今为止，结核病已有几千年的历史，随着环境的改变耐药结核杆菌也随之出现，而在过去的40年中却未开发出能有效杀灭耐药菌株的新型抗结核药物，未来数年内可能会出现以耐药甚至耐多药结核杆菌为主的结核病的流行趋势，全球医疗工作者将会面临更加严重的挑战。目前现有的结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的药敏检测方法主要是细菌培养法和分子生物学方法。(1)细菌培养法主要分为固体培养和液体快速培养。固体培养法主要是利用罗氏固体培养基，将菌种接种到固体斜面上，置于37℃培养，按时间进行观察，根据菌落形态，初次生长的时间，以及是否产生色素等特点来进行判断是否为结核分枝杆菌。此法是目前全球普遍采用的细菌分离培养法，方法简便，但是由于细菌生长缓慢，导致其耗时长，一般要4～8周才能报道结果，而且其特异性差，不利于临床初断。近年来，以液体培养法为基础的细菌培养方法得到了广泛的应用。目前，常用的自动检测仪器有bactecmgit960系统、bact/alert3d微生物检测系统、versatrek/esp培养系统ⅱ等。上述液体培养法虽然缩短了培养时间，提高了灵敏性，但是也存在判定方法不直观、污染率高、价格昂贵、工作量大的缺点，限制了一些中小型的实验室以及高负担资源的国家采用这些设备。(2)分子生物学方法。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，其在分枝杆菌中的应用也不断增多，目前临床诊断实验室最常用的分子生物学技术有核酸杂交探针、线性杂交检测、dna测序等。但是分子生物学方法步骤繁多，每个药的检测成本高。比色法检测多步操作，在微孔板中进行，精准度不高。可见，现有的结核病的药敏检测方法均存在一些缺陷。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种高通量药敏检测试剂盒及其使用方法和应用，本发明的药敏检测试剂盒具有高通量、快速精准、经济简便、安全无毒、可以目测、临床相关性高的特点，能够发现传统方法发现不了的异质性耐药。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种高通量药敏检测试剂盒，包括培养容器、培养基和检测试剂，所述检测试剂是包括吩嗪甲基硫酸盐衍生物和含四氮唑盐的氧化试剂的混合物。优选的，所述检测试剂中所述含四氮唑盐的氧化试剂的浓度为0.001～10mm，所述吩嗪甲基硫酸盐衍生物的浓度为0.1～250μm。优选的，所述含四氮唑盐的氧化试剂在氧化还原后具有吸光度或荧光度，所述含四氮唑盐的氧化试剂为单磺酸四氮唑盐、羧酸四氮唑盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐和四氮唑蓝盐中的一种。优选的，所述吩嗪甲基硫酸盐衍生物的结构通式为：其中，r表示1～18个碳原子的直链、支链或环状烷基，或者表示包含n、o、s、p、si和卤素原子中的一种或几种杂原子的1～18个碳原子的直链、支链或环状烷基衍生物。本发明还提供了一种高通量药敏检测试剂盒用于筛选抗结核病药物的应用。本发明还提供了一种高通量药敏检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)将按照终浓度配制的不同浓度梯度的待检药物包被到培养容器中制得含药培养容器；(2)将活菌与培养基、检测试剂混合，加入到含药培养容器中，封存培养，每天检测培养液在od450nm处的吸光度，绘制生长曲线；以待检药物浓度为0的生长曲线为活菌的标准生长曲线，设为对照组，其他设为加药组；并设立空白组，所述空白组与加药组的区别在于没有加活菌；培养至对照组与空白组在od450nm处的吸光度的比值为3时，培养结束；并根据对照组的标准生长曲线和加药组的生长曲线数据计算细胞活力值，绘制药物剂量效应曲线；(3)按照如下公式计算细胞活力值：细胞活力值(％)＝[od(加药)-od(空白)]/[od(对照)-od(空白)]×100其中：od(加药)：表示具有活菌、培养基、检测试剂、待检药物的培养液在od450nm处的吸光度；od(对照)：表示具有活菌、培养基、检测试剂的培养液在od450nm处的吸光度；od(空白)：表示具有培养基、检测试剂、待检药物的培养液在od450nm处的吸光度；(4)根据含药培养容器中培养液的颜色变化，获得最低抑菌浓度值，或根据ezmtt法测得的待测药物各浓度梯度的生长曲线对照标准生长曲线，获得最低抑菌浓度值，或根据药物剂量效应曲线，获得最低抑菌浓度值，将获得的最低抑菌浓度值与clsi标准中对应的最低抑菌浓度值比较，判定是否耐药。优选的，所述待检药物包括异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素、链霉素硫酸盐、阿米卡星、硫酸阿米卡星、左氧氟沙星、莫西沙星、莫西沙星盐酸盐、环丝氨酸、丙硫异烟胺、利奈唑胺、氯法齐明、贝达喹啉富马酸盐、卡那霉素、卷曲霉素、妥布霉素、对氨基水杨酸、强力霉素、克拉霉素、替加环素、贝达喹啉中的一种或几种，所述异烟肼的终浓度为0.05-256μg/ml、利福平的终浓度为0.1-256μg/ml、吡嗪酰胺的终浓度为100-400μg/ml、乙胺丁醇的终浓度为1-256μg/ml、链霉素的终浓度为0.01-256μg/ml、链霉素硫酸盐的终浓度为0.01-256μg/ml、阿米卡星的终浓度为0.01-16μg/ml、硫酸阿米卡星的终浓度为0.01-16μg/ml、左氧氟沙星的终浓度为0.01-32μg/ml、莫西沙星的终浓度为0.03-16μg/ml、莫西沙星盐酸盐的终浓度为0.03-16μg/ml、环丝氨酸的终浓度为10-400μg/ml、丙硫异烟胺的终浓度为1-20μg/ml、利奈唑胺的终浓度为0.1-64μg/ml、氯法齐明的终浓度为0.02-2μg/ml、贝达喹啉富马酸盐的终浓度为0.01-1μg/ml、卡那霉素的终浓度为1-200μg/ml、卷曲霉素的终浓度为1-200μg/ml、妥布霉素的终浓度为0.1-16μg/ml、对氨基水杨酸的终浓度为1-10μg/ml、强力霉素的终浓度为1-16μg/ml、克拉霉素的终浓度为2-8μg/ml、替加环素的终浓度为0.01-8μg/ml、贝达喹啉的终浓度为0.01-0.48μg/ml。优选的，所述异烟肼的终浓度为0.2μg/ml、利福平的终浓度为0.25μg/ml、吡嗪酰胺的终浓度为400μg/ml、乙胺丁醇的终浓度为10μg/ml、链霉素的终浓度为1μg/ml、链霉素硫酸盐的终浓度为1μg/ml、阿米卡星的终浓度为2μg/ml、硫酸阿米卡星的终浓度为2μg/ml、左氧氟沙星的终浓度为1μg/ml、莫西沙星的终浓度为0.5μg/ml、莫西沙星盐酸盐的终浓度为0.5μg/ml、环丝氨酸的终浓度为200μg/ml、丙硫异烟胺的终浓度为10μg/ml、利奈唑胺的终浓度为2μg/ml、氯法齐明的终浓度为1μg/ml、贝达喹啉富马酸盐的终浓度为0.12μg/ml、卡那霉素的终浓度为2μg/ml、卷曲霉素的终浓度为100μg/ml、妥布霉素的终浓度为16μg/ml、对氨基水杨酸的终浓度为10μg/ml、强力霉素的终浓度为16μg/ml、克拉霉素的终浓度为8μg/ml、替加环素的终浓度为8μg/ml、贝达喹啉的终浓度为0.03μg/ml。优选的，所述活菌的浓度为0.7×103～4×105cfu/ml。优选的，所述活菌与培养基、检测试剂的混合体积比为1：20：0.1本发明提供的一种高通量药敏检测试剂盒及其使用方法和应用，具有快速精准、经济简便、安全无毒、可以目测、临床相关性高、使用方法简单的特点；本发明还提供了多种抗生素药物的药敏浓度，对检测结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌等分枝杆菌具有较高的精准性、灵敏性；且能够一次性筛查大量的抗菌药物。附图说明图1为不同菌量的ezmtt法和浊度法的生长曲线比较；图2为ezmtt追踪的不同菌量的生长曲线；图3为ezmtt追踪的不同菌量的结合分枝杆菌在单管中培养的倍增时间；图4为采用ezmtt法测定单管的z因子；图5为ezmtt法和浊度法分别在96孔板和单管中培养结核分枝杆菌的生长曲线；图6为ezmtt追踪的不同菌量的结核分枝杆菌在96孔板中的倍增时间；图7为分别采用ezmtt法和浊度法测定96孔板的z因子；图8为本发明的试剂盒对h37ra菌药敏检测的生长曲线和药物剂量效应曲线；图9为ezmtt法与浊度法药敏检测的生长曲线比较；图10为本发明的试剂盒对多菌株多药物的药敏检测结果；具体实施方式本发明提供了一种高通量药敏检测试剂盒及其使用方法和应用。本发明的药敏检测试剂盒的检测原理是：nad(p)+/nad(p)h是一类重要的辅酶因子，存在于所有细菌中，其作为反应介质参与多种生命过程，包括能量代谢，线粒体功能，钙稳态，氧化应激，基因调节，免疫功能，老化和细胞死亡等。nad(p)+/nad(p)h可用有吸光度或荧光的含四氮唑盐的氧化试剂检测，四氮唑盐可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)，再通过酶标仪测定吸光度或荧光，即可对细菌的生长状态进行检测，进一步检测细菌对抗菌药物的耐药性，活细胞数量越多，则吸光度越高，具有线性剂量效应。本发明的检测试剂是包括吩嗪甲基硫酸盐衍生物和含四氮唑盐的氧化试剂的混合物，对微生物安全无毒，可与活菌共同孵育1h～30天，跟踪药物对活菌生长的影响。本发明提供了一种高通量药敏检测试剂盒，包括培养容器、培养基和检测试剂，所述检测试剂是包括吩嗪甲基硫酸盐衍生物和含四氮唑盐的氧化试剂的混合物。在本发明中，所述培养容器优选为单个试管、48孔板、96孔板、192孔板或384孔板的微孔板；进一步优选为96孔板或384孔板。在本发明中，所述培养基和检测试剂均优选为独立包装。在本发明中，所述培养基优选为罗氏培养基，小川辰次鸡蛋培养基，苏通培养基，middlebrook7h9培养基、middlebrook7h10培养基、middlebrook7h11培养基和bactec460tmtb培养基中的一种，进一步优选为middlebrook7h9培养基、middlebrook7h10培养基和middlebrook7h11培养基中的一种；再进一步优选为middlebrook7h9培养基。在本发明中，所述含四氮唑盐的氧化剂在氧化还原后具有吸光度或荧光度。在本发明中，所述含四氮唑盐的氧化剂优选为单磺酸四氮唑盐(ezmtt)、羧酸四氮唑盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐(cck-8)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)和四氮唑蓝盐(mts)中的一种，进一步优选单磺酸四氮唑盐(ezmtt)。在本发明中，所述吩嗪甲基硫酸盐衍生物的结构通式优选为：其中，r表示1～18个碳原子的直链、支链或环状烷基，或者表示包含n、o、s、p、si和卤素原子中的一种或几种杂原子的1～18个碳原子的直链、支链或环状烷基衍生物，进一步优选为吩嗪硫酸甲酯(pms)、吩嗪硫酸乙酯(pes)、已基-pms、环已基-pms和c18烷基-pms中的一种，再进一步优选为吩嗪甲基硫酸甲酯(pms)。在本发明中，所述检测试剂中所述含四氮唑盐的氧化试剂的浓度为0.001～10mm，进一步优选为0.02～1.0mm，再进一步优选为0.1～0.5mm；所述吩嗪甲基硫酸盐衍生物的浓度为0.1～250μm，进一步优选为1～100μm，再进一步优选为5～50μm。本发明还提供了所述的高通量药敏检测试剂盒用于筛选抗结核病药物的应用。本发明还提供了一种高通量药敏检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)将按照终浓度配制的不同浓度梯度的待检药物包被到培养容器中制得含药培养容器；(2)将活菌与培养基、检测试剂混合，加入到含药培养容器中，封存培养，每天检测培养液在od450nm处的吸光度，绘制生长曲线；以待检药物浓度为0的生长曲线为活菌的标准生长曲线，设为对照，其他设为加药组；并设立空白组，所述空白组与加药组的区别在于没有加活菌；培养至对照组与空白组在od450nm处的吸光度的比值为3时，培养结束，当对照组与空白组在od450nm处的吸光度的比值为3时，信号足够大，能够进行精确检测；并根据对照组的标准生长曲线和加药组的生长曲线数据计算细胞活力值，绘制药物剂量效应曲线；(3)按照如下公式计算细胞活力值：细胞活力值(％)＝[od(加药)-od(空白)]/[od(对照)-od(空白)]×100其中：od(加药)：表示具有活菌、培养基、检测试剂、待检药物的培养液在od450nm处的吸光度；od(对照)：表示具有活菌、培养基、检测试剂的培养液在od450nm处的吸光度；od(空白)：表示具有培养基、检测试剂、待检药物的培养液在od450nm处的吸光度；(4)根据含药培养容器中培养液的颜色变化，获得最低抑菌浓度值，或根据ezmtt法测得的待测药物各浓度梯度的生长曲线对照标准生长曲线，获得最低抑菌浓度值，或根据药物剂量效应曲线，获得最低抑菌浓度值，将获得的最低抑菌浓度值与clsi标准中对应的最低抑菌浓度值比较，判定是否耐药。本发明在使用高通量药敏检测试剂盒时，先准备含药培养容器，所述含药培养容器是将按照终浓度配制的不同浓度梯度的待检药物包被到培养容器中制得。在本发明中，所述待检药物优选为目前已知的抗菌药物，进一步优选为异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素、链霉素硫酸盐、阿米卡星、硫酸阿米卡星、左氧氟沙星、莫西沙星、莫西沙星盐酸盐、环丝氨酸、丙硫异烟胺、利奈唑胺、氯法齐明、贝达喹啉富马酸盐、卡那霉素、卷曲霉素、妥布霉素、对氨基水杨酸、强力霉素、克拉霉素、替加环素、贝达喹啉中的一种或几种。本发明所述终浓度是指所述待检药物在制备不同浓度梯度的待检药物时的初始浓度，即所述浓度梯度中的最大浓度。在本发明中，所述异烟肼的终浓度优选为0.05-256μg/ml，进一步优选为0.2μg/ml；利福平的终浓度优选为0.1-256μg/ml，进一步优选为0.25μg/ml；吡嗪酰胺的终浓度优选为100-400μg/ml，进一步优选为400μg/ml；乙胺丁醇的终浓度优选为1-256μg/ml，进一步优选为10μg/ml；链霉素的终浓度优选为0.01-256μg/ml，进一步优选为1μg/ml；链霉素硫酸盐的终浓度优选为0.01-256μg/ml，进一步优选为1μg/ml；阿米卡星的终浓度优选为0.01-16μg/ml，进一步优选为2μg/ml；硫酸阿米卡星的终浓度优选为0.01-16μg/ml，进一步优选为2μg/ml；左氧氟沙星的终浓度优选为0.01-32μg/ml，进一步优选为1μg/ml；莫西沙星的终浓度优选为0.03-16μg/ml，进一步优选为0.5μg/ml；莫西沙星盐酸盐的终浓度优选为0.03-16μg/m，进一步优选为0.5μg/ml；环丝氨酸的终浓度优选为10-400μg/ml，进一步优选为200μg/ml；丙硫异烟胺的终浓度优选为1-20μg/ml，进一步优选为10μg/ml；利奈唑胺的终浓度优选为0.1-64μg/ml，进一步优选为2μg/ml；氯法齐明的终浓度优选为0.02-2μg/ml，进一步优选为1μg/ml；贝达喹啉富马酸盐的终浓度优选为0.01-1μg/ml，进一步优选为0.12μg/ml；卡那霉素的终浓度优选为1-200μg/ml，进一步优选为2μg/ml，卷曲霉素的终浓度优选为1-200μg/ml，进一步优选为100μg/ml；妥布霉素的终浓度优选为0.1-16μg/ml，进一步优选为16μg/ml；对氨基水杨酸的终浓度优选为1-10μg/ml，进一步优选为10μg/ml；强力霉素的终浓度优选为1-16μg/ml，进一步优选为16μg/ml；克拉霉素的终浓度优选为2-8μg/ml，进一步优选为8μg/ml；替加环素的终浓度优选为0.01-8μg/ml，进一步优选为8μg/ml；贝达喹啉的终浓度优选为0.01-0.48μg/ml，进一步优选为0.03μg/ml。本发明在准备好含药培养容器后，将活菌与培养基、检测试剂混合，加入到含药培养容器中，封存培养，每天检测培养液在od450nm处的吸光度，绘制生长曲线；以待检药物浓度为0的生长曲线为活菌的标准生长曲线，设为对照，其他设为加药组；并设立空白组，所述空白组与加药组的区别在于没有加活菌；培养至对照组与空白组在od450nm处的吸光度的比值为3时，培养结束；并根据对照组的标准生长曲线和加药组的生长曲线数据计算细胞活力值，绘制药物剂量效应曲线；在本发明中，所述活菌的浓度优选为0.7×103～4×105cfu/ml，进一步优选为1×104～2×105cfu/ml。在本发明中，所述活菌、培养基和检测试剂的体积比优选为为1:20:0.1。在本发明中，所述活菌优选为目前已知的或临床分离的菌株。在本发明中，所述封存培养的温度优选为36～38℃，进一步优选为37℃。下面结合实施例对本发明提供的一种高通量药敏检测试剂盒及其使用方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1本实验例分别采用ezmtt法和浊度法在单个试管中培养结核分枝杆菌。ezmtt法：将活菌、检测试剂与middlebrook7h9培养基按照1:0.1:20的体积比混合，加入到4ml塑料单管中，在37℃下封存培养，每天测其在od450nm处的吸光度，并绘制生长曲线。本实验所用的检测试剂中含有0.5mm的单磺酸四氮唑盐和50μm的吩嗪甲基硫酸甲酯。浊度法：将活菌与middlebrook7h9培养基按照1:20的体积比混合，加入到4ml塑料单管中，在37℃下封存培养，每天测其在od610nm处的吸光度，并绘制生长曲线。本实验选取活菌为结核分枝杆菌，其浓度分别选为a)1.25×104cfu/ml、b)6.25×103cfu/ml、c)3.13×103cfu/ml、d)1.56×103cfu/ml、e)0.78×103cfu/ml的菌液，每个浓度的菌液均用ezmtt法和浊度法两种方法培养，绘制生长曲线，如图1(a～e)所示。从图1中可以看出，在相同菌液浓度和相同培养条件下，本发明提供的ezmtt法的灵敏度远高于浊度法。为了进一步检验ezmtt法的灵敏度，本实验还选取浓度分别为5×105cfu/ml、2.5×105cfu/ml、1.25×105cfu/ml、6.25×104cfu/ml、3.13×104cfu/ml、1.56×104cfu/ml、0.78×103cfu/ml、3.91×103cfu/ml、1.95×103cfu/ml、9.76×102cfu/ml的结核分枝杆菌为活菌，采用ezmtt法进行培养，并绘制生长曲线，比较ezmtt追踪的不同菌量的生长情况。结果如图2，从图2中可以看出，从浓度5×105cfu/ml到7.81×103cfu/ml的细菌量的信号均可以被检测到，且二者细菌量相差约100倍，因此，ezmtt法的灵敏度可检测到1％的生长率。同时，测得浓度为5×105cfu/ml、2.5×105cfu/ml、1.25×105cfu/ml、6.25×104cfu/ml的结核分枝杆菌在对数生长期的倍增时间如图3所示。从图3中可以看出，结核分枝杆菌在含有检测试剂的4ml塑料单管中培养，对数生长期增长正常，说明本发明提供的检测试剂安全无毒，可与活菌共同孵育，跟踪活菌生长状况。如图4所示，采用ezmtt法在单个试管中培养结核分枝杆菌，其z因子为0.64，数据重现性好，z因子显示优秀，能够实现在单个试管中的高通量药敏检测。z因子是用来量化筛选条件和测定方法在全高通量筛选中的适用性的指标，一般z因子大于0.5证明方法的重现性较好。实施例2本实施例提供了以微孔板为培养容器的高通量药敏检测试剂盒，由于单个试管和微孔板两者培养环境差异较大，存在的不确定因素较多。因此，本发明对微孔板和单个试管培养物进行比较，并测定了ezmtt法在微孔板中培养活菌的倍增时间和z因子。本实验采用ezmtt法(od450nm)和浊度法(od610nm)分别在4ml塑料单管和96孔板中培养结核分枝杆菌，测其生长曲线(图5)，其中，接种结核分枝杆菌的浓度为1.25×105cfu/ml。从图5中可以看出，采用ezmtt法在4ml塑料单管(tube)和96孔板(plate)中培养结核分枝杆菌，在96孔板中不如在4ml塑料单管中灵敏，但采用ezmtt法在96孔板中培养结核分枝杆菌的灵敏度仍然优于浊度法。本实验还采用ezmtt法在96孔板中测定不同浓度的结核分枝杆菌在对数生长期的倍增时间，结果如图6，可以看出，在96孔板中结核分枝杆菌倍增时间正常，本发明的检测试剂可以用于在微孔板中追踪细菌的生长情况。且z因子显示优秀(图7)，从图7中可以看出，ezmtt法z因子为0.53(大于0.5)，浊度法z因子为-0.1。可见，ezmtt法显示优秀的重现性，而浊度法不可靠。实施例3本实施例提供了一种高通量药敏检测试剂盒，包括培养容器、培养基和检测试剂。本实施例所用培养容器为：96孔板；本实施例所用培养基为：middlebrook7h9培养基；本实施例所使用检测试剂中含有0.5mm单磺酸四氮唑盐和50μm的吩嗪甲基硫酸甲酯；本实施例所用活菌菌株为：m.tuberculosish37ra，所述活菌的浓度为：2×105cfu/ml；本实施例所选待检药物为：异烟肼(inh)、利福平(rif)、乙胺丁醇(emb)、吡嗪酰胺(pza)、链霉素硫酸盐(str)、阿米卡星(amk)、左氧氟沙星(lvx)、莫西沙星盐酸盐(mvx)、丙硫异烟胺(pto)、利奈唑胺(lzo)、贝达喹啉(beda)。优选上述11种待检药物的终浓度(ug/ml)如下：异烟肼(inh)：终浓度为0.2ug/ml；利福平(rif)：终浓度为0.25ug/ml；乙胺丁醇(emb)：终浓度为10ug/ml；吡嗪酰胺(pza)：终浓度为400ug/ml；链霉素硫酸盐(str)：终浓度为1ug/ml；阿米卡星(amk)：终浓度为2ug/ml；左氧氟沙星(lvx)：终浓度为1ug/ml；莫西沙星盐酸盐(mvx)：终浓度为0.5ug/ml；丙硫异烟胺(pto)：终浓度为10ug/ml；利奈唑胺(lzo)：终浓度为2ug/ml。贝达喹啉(beda)：终浓度为0.03ug/ml进一步按照上述优选终浓度设计11种待检药物的浓度梯度：表111种待检药物的浓度梯度将上述浓度梯度的待检药物包被到96孔板中，然后按照1:0.1:20的体积比将m.tuberculosish37ra菌、检测试剂、middlebrook7h9培养基混合，加入到已包被有待检药物的96孔板中，每天检测培养液在od450nm处的吸光度，绘制各药物各浓度梯度的生长曲线，以待检药物浓度为0的生长曲线为活菌的标准生长曲线，设为对照组，其他设为加药组；并设立空白组，所述空白组与加药组的区别在于没有加活菌；培养至对照组与空白组在od450nm处的吸光度的比值为3时，培养结束，此时信号足够大，能够进行精确检测。并根据对照组的标准生长曲线和加药组的生长曲线数据计算细胞活力值，绘制药物剂量效应曲线。结果如图8，发现部分耐药的药物。从图8中可以看出，a)inh,mic＝0.05μg/ml,报道的折点是0.1μg/ml,因此完全抑制；b).rif,mic<0.008μg/ml,报道的折点是1.0μg/ml,因此完全抑制；c).emb,mic＝2.5μg/ml,报道的折点是5.0μg/ml,因此完全抑制；d).pza,mic＞400μg/ml,报道的折点是100μg/ml,因此部分抑制；e).str,mic＝0.25μg/ml,报道的折点是1.0μg/ml,因此完全抑制；f).amk,mic＝1.0μg/ml,报道的折点是1.0μg/ml,因此完全抑制；g).lvx,mic＝0.25μg/ml,报道的折点是2.0μg/ml,因此完全抑制；h).mvx,mic＝0.063μg/ml,报道的折点是0.25μg/ml,因此完全抑制；i).pto,mic＝5.0μg/ml,报道的折点是2.5μg/ml,因此部分抑制；j).lzo,mic＝0.25μg/ml,报道的折点是1.0μg/ml,因此完全抑制；beda,mic＝0.008μg/ml,报道的折点是0.12μg/ml,因此完全抑制；本发明的高通量药敏检测试剂盒基于无毒性含四氮唑盐的氧化试剂的氧化还原显色反应，可快速精准一次性筛选大量的临床药物，且价格低廉，临床相关性高；本发明一次性加入所有试剂，操作方便；除了通过利用传统计算抑制率的方法判断耐药性外，还能够根据不同浓度待检药物生长曲线的速率变化进一步确认耐药性，该方法精准、简便、经济，还发现了传统方法发现不了的异质性耐药。实施例4为了进一步确定本发明的高通量药敏检测试剂盒的灵敏度，本实验选择实施例1中的10种药物，包被到本发明提供的试剂盒中，比较ezmtt法和浊度法的灵敏度。其中，选择的10种药物及其包被浓度分别为：a)inh：0.1μg/ml，b)rif：1μg/ml，c)emb：5μg/ml，d)beda：0.12μg/ml，e)str：1μg/ml，f)amk：1μg/ml，g)lvx：2μg/ml，h)mvx：0.25μg/ml，i)pto：2.5μg/ml，j)lzo：1μg/ml。然后按照ezmtt法在包被有药物的96孔板中加入按照1:0.1:20的体积比混合的m.tuberculosish37ra菌、检测试剂和middlebrook7h9培养基的混合物，设为实验组(drug)，并设立对照(control)和空白(blank)。control组与drug组的区别仅在于control组没有包被药物；blank组与drug组的区别仅在于没有加m.tuberculosish37ra菌。同时，按照ezmtt法的实验设置浊度法的实验，二者区别在于浊度法中不加检测试剂。本实验例所用m.tuberculosish37ra菌的浓度为2×105cfu/ml；本实验例所使用检测试剂为含有0.5mm单磺酸四氮唑盐和50μm的吩嗪甲基硫酸甲酯的混合物。检测结果如图9所示，由图9可知，在96孔板中的药敏检测的灵敏度测试实验中，ezmtt法仍然优于浊度法。实施例5本实施例是利用本发明的试剂盒对多个菌株进行多个药物的药敏检测。本实施例中选取了10种临床分离的结核分枝杆菌菌株和4中抗生素进行药敏试验。其中，10种临床分离的结核分枝杆菌菌株的名称分别为：a)h37ra、b)yt180134(inh)、c)hz18085(inh)、d)hz18093(inh)、e)yt180134(str)、f)yt180126(lvx)、g)hz18090(emb)、h)hz18066(str)、i)hz18066(rif)、j)hz18094(str)；上述菌株除了h37ra菌株以外，其余9种菌株均是经过括号内的抗生素筛选所得。其中inh为抗生素异烟肼，str为抗生链霉素硫酸盐，lvx为抗生素左氧氟沙星，emb为抗生素乙胺丁醇，rif为抗生素利福平。每种菌的浓度均为2×105cfu/ml。4种抗生素为1μg/ml链霉素(s)，0.1μg/ml异烟肼(h)，1μg/ml利福平(r)，5μg/ml乙胺丁醇(e)。将4种抗生素包被到96孔板中，每一种菌对应一组抗生素，共包被10组，且每种菌设置一个对照(control)，对照组不含有抗生素。将每种菌株与检测试剂、7h9培养基按照1:0.1:20的体积比混合，接种到96孔板中，在37℃下培养，每天测其在450nm处的吸光度，记录吸光度。实验重复3次，取吸光度的平均值，绘制菌株的生长曲线，如图10所示。在图10中能够清楚的观察到每种菌株对每种抗生素的耐药情况，结果准确、清晰，方法简便、经济。本实施例还采用30天的固体法、14天的快速培养法进行药敏检测并与本发明的7天ezmtt法进行比较。比较结果如表2。表2临床分离的结核分枝杆菌菌株的抗生素耐药性检测的比较a抗菌素：str:1μg/ml；inh：0.1μg/ml；rif：1μg/ml；emb：5μg/ml；r：耐药；s：药敏；pr部分抑制；/：没有结果；c抑制率；d生长率。固体法、mgit液体法、ezmtt法所鉴定的敏感和耐药的一致性非常好；不同的是20％左右的菌，用ezmtt检测发现一些化合物显示部分耐药。而固体法、mgit液体法检测显示抑制。证明了本发明的方法具有更精确的灵敏度。实施例6本实施例使用本发明的试剂盒检测临床分离的12株m.tuberculosis菌株对10种药物的耐药性检测。实验方法同实施例1，菌株浓度均为2×105cfu/ml，不同之处是用临床m.tuberculosis菌株取代了h37ra菌。结果如表3和表4所示，从表中可以清楚的得知临床分离的12株m.tuberculosis菌株对10中抗生素的耐药性。表3对临床分离的12种m.tuberculosis菌的药敏检测max*：signalonlastday(e.g.7thday)。表4.对临床分离的12种m.tuberculosis菌的ezmtt法和mgit液体法药敏检测方法的结果进行比较max*：signalonlastday(e.g.7thday)。实施例7本实施例将实施例1中的结核分枝杆菌替换成脓肿分枝杆菌(atcc9977)进行药敏检测，检测结果如表5。表5脓肿分枝杆菌(atcc9977)药敏检测结果项目ezmtt法(mic)浊度法(mic)脓肿分枝杆菌4-5天5天异烟肼(inh)>256μg/ml>256μg/ml利福平(rfp)64μg/ml64μg/ml乙胺丁醇(emb)32μg/ml32μg/ml链霉素/链霉素硫酸盐(str)16μg/ml16μg/ml阿米卡星(amk)1μg/ml1μg/ml左氧氟沙星(lvx)1μg/ml1μg/ml莫西沙星/莫西沙星盐酸盐(mvx)1μg/ml1μg/ml利奈唑胺(lzo)4μg/ml4μg/ml氯法齐明(cfz)32μg/ml32μg/ml卡那霉素(kan)2μg/ml2μg/ml国家标准中一般以浊度法的检测结果为标准，从表5的检测结果看，本发明的试剂盒对脓肿分枝杆菌的检测结果与国家标准(浊度法)一致。由以上实施例可知，本发明提供了一种高通量的药敏检测试剂盒及其使用方法和应用。具有快速精准、经济简便、安全无毒、可以目测、临床相关性高的特点，使用方法简单，对检测结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌等分枝杆菌具有较高的精准性、灵敏性，且能够一次性筛查大量的抗菌药物。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12