一种同时制备L-鼠李糖和异槲皮素的方法与流程

本发明一种同时制备l-鼠李糖和异槲皮素的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

l-鼠李糖是一种稀有糖，可用于生产香精香料，可食用，可以作为药物的中间体、合成强心药物；可与其他物质反应形成风味物质、用作甜味剂；可用于农作物疾病的防治；还可作为肠道渗透测试剂使用，并具有明显的抗癌作用。

异槲皮素(isoquercitrin)又称异槲皮苷，比芦丁少一个鼠李糖苷基，在水中的溶解性极低(95mg/l)。广泛存在于植物的花、叶、果实等中，但是从中提取量极少。该化合物具有抗炎、抗氧化、抗病毒、降血压、降血糖等多种生物学活性，已成为近年来天然活性成分的研究热点之一。

目前生产l-鼠李糖的方法主要是酸水解黄酮类物质制备，公开号为cn102952108a的专利中公布了一种利用槐米制备槲皮素和鼠李糖的方法，异槲皮素水解去掉末端的葡萄糖基获得的物质为槲皮素，它是采用如下步骤完成的：a、取槐米适量，粉碎，利用饱和澄清的石灰水提取芦丁；b、利用步骤a中提取的芦丁用盐酸水解制备槲皮素；c、将步骤b中的废弃液发酵制取鼠李糖粗品；d、利用甲醇分离步骤c中鼠李糖粗品中的葡萄糖，制得鼠李糖精品。该过程中使用了大量的酸，会产生大量废液，同时易腐蚀设备，而且水解过程中会产生葡萄糖，需要将葡萄糖消耗掉之后再提取鼠李糖，增加了提取工艺。

目前生产异槲皮素的方法主要是鼠李糖苷酶水解芦丁制备，酸水解芦丁制备异槲皮素时会产生多余的槲皮素，增加异槲皮素与槲皮素分离步骤的成本。公开号为cn1483825a的专利中公布了一种酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法，反应步骤如下：取能水解芦丁糖基的酶；将酶、芦丁、缓冲液及乙醇混合反应2-24小时，反应条件为温度15-70℃、ph值4-8，芦丁浓度为0.1-10％，乙醇浓度为0-35％；提取获得异槲皮素和槲皮素的混合物，经过硅胶柱层析分离异槲皮素和槲皮素。此方法反应时间长，芦丁浓度较低，而且获得的产物时异槲皮素和槲皮素的混合物，需要进一步纯化才能获得异槲皮素纯品，增加了生产成本。

生产l-鼠李糖过程中会用到大量的酸，会腐蚀设备，而且增加了生产操作的危险性，同时水解过程中会产生葡萄糖，需要将葡萄糖消耗掉之后再提取鼠李糖，增加了提取工艺。生产异槲皮素过程中，芦丁在水中溶解度非常低，导致酶水解时的芦丁浓度较低，需要大体积转化芦丁才能大量制备异槲皮素，会进一步增加生产成本。

技术实现要素：

本发明的主要目的是为了解决目前生产鼠李糖和异槲皮素存在的技术缺陷，提供一种新型的无污染、易控制的利用鼠李糖苷酶水解芦丁制备鼠李糖和异槲皮素的方法。本发明选择以低共熔溶剂(des)为介质，水解芦丁，并且同时制备异槲皮素和l-鼠李糖。

本发明提供一种制备des的方法，所述方法是将一定量的氢键受体和氢键供体按(1～3):(1～3)摩尔比混合，在60～80℃搅拌至形成均一透明的液体，透明液体即为des。

在本发明的一种实施方式中，所述氢键受体为氯化胆碱、甜菜碱；所述氢键供体为尿素、甘油、乙二醇、1，2-丙二醇、柠檬酸、d，l-苹果酸、乳酸、甲酸、醋酸、乙酰胺、硫。

在本发明的一种实施方式中，所述氢键受体优选为氯化胆碱，所述氢键供体优选为尿素。

本发明提供一种同时制备l-鼠李糖和异槲皮素的方法，其特征在于，所述方法为：

(1)以des为溶剂，溶解芦丁，将溶解的芦丁在α-l-鼠李糖苷酶的作用下进行反应；

(2)反应后向反应液中加入去离子水，然后对反应液进行抽滤，分别收集滤液及抽滤时的不溶物；

(3)将所述不溶物经去离子水洗涤后进行抽滤，将抽滤得到的不溶物进行真空干燥，制得异槲皮素粗品；

(4)向步骤(2)中的滤液脱色后，加入无机盐形成双水相，分别收集上相和下相溶液；

(5)下相溶液经旋转蒸发浓缩后，加入乙醇后收集沉淀，沉淀经真空干燥，制得l-鼠李糖粗品。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中的des浓度为30～50％(w/w)；α-l-鼠李糖苷酶在反应体系中的量为4～12u/ml。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中的反应时间为至少为45min。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中去离子水的添加量为所述反应液的2倍。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中所述无机盐为k2hpo4。

本发明提供一种提高l-鼠李糖和异槲皮素转化率的方法，所述方法是以制备得到的des为溶剂，溶解芦丁，在α-l-鼠李糖苷酶的作用下进行反应。

在本发明的一种实施方式中，所述α-l-鼠李糖苷酶的添加量为5～7u/ml。

在本发明的一种实施方式中，所述des的浓度为30～50％(w/w)。

在本发明的一种实施方式中，反应时间至少为45min。

本发明提供一种重复利用des的方法，所述方法为把制备异槲皮素获得的滤液利用活性炭进行脱色得到脱色液，将脱色液浓缩，加入k2hpo4形成双水相，上相中的des重复用于芦丁转化，下相溶液用于制备鼠李糖。

在本发明的一种实施方式中，向上相中的des中添加新的des溶液，使得des浓度为30～50％(w/w)，将其应用于所述制备l-鼠李糖和异槲皮素的方法；或将上相中的des应用于所述制备l-鼠李糖和异槲皮素的方法，延长步骤(1)中的反应时间，延长的时间为0.5h～2h。

在本发明的一种实施方式中，所述脱色条件为：用5～7mhcl将滤液调节ph为1.5～2.5，加入终浓度为1.0～2.0％(w/v)的活性炭，60～80℃、100～140r/min脱色30～50min，用滤纸过滤去除活性炭获得脱色液。

本发明提供了所述提高l-鼠李糖和异槲皮素转化率的方法在医药、食品、农业领域制备l-鼠李糖和异槲皮素中的应用。

本发明提供了所述同时制备l-鼠李糖和异槲皮素的方法在医药、食品、农业领域制备l-鼠李糖和异槲皮素中的应用。

本发明提供了所述重复利用des的方法在医药、食品、农业领域制备l-鼠李糖和异槲皮素中的应用。

本发明的有益效果：发明采用一种利用低共熔溶剂(des)介质制备l-鼠李糖和异槲皮素的方法。该方法以des为介质转化芦丁同时制备l-鼠李糖和异槲皮素。在优化的条件下，130g/l芦丁能够完全转化；并利用双水相体系提取，获得了高纯度的异槲皮素和l-鼠李糖；des可以重复利用。经过4次回用，获得的异槲皮素纯度仍有92.28％。

附图说明

图1为低共熔溶剂介质同时制备l-鼠李糖和异槲皮素图。

图2为双水相成相盐选择图。

图3为制备获得的产物：异槲皮素；(a)为异槲皮素标准品和(b)为获得的异槲皮素产物的hplc图谱。

图4为制备获得的产物：l-鼠李糖；(a)为l-鼠李糖标准品(b)为获得的l-鼠李糖产物的hplc图谱。

具体实施方式

酶活测定方法：在400μl柠檬酸缓冲液(50mm，ph5.0)中，加入50μlpnpr和50μl酶液，50℃恒温水浴1min，立即加入1ml1mna2co3溶液终止反应并显色，400nm下测定吸光值。

酶活定义：上述条件下每分钟反应产生1μmol对硝基苯酚所需要的酶量定义为一个酶活单位。

实施例中所使用的α-l-鼠李糖苷酶由α-l-鼠李糖苷酶重组菌发酵得到，所述α-l-鼠李糖苷酶重组菌及其发酵产酶方法，记载于公布号为cn108587926a的专利文献中。

异槲皮素hplc测定方法：色谱条件：waters高效液相色谱，2487检测器，c18(250×4.6mm，5μm)色谱柱，波长360nm，流动相：乙腈：0.02％磷酸＝20：80(v/v)，流速1.0ml/min，进样量10μl，温度35℃。

l-鼠李糖hplc测定方法：色谱条件：waters高效液相色谱，waters2414refractiveindexdetector，采用sepaxhp-amino(4.6×250mm，5μm)色谱柱，流动相乙腈：水＝75:25(v/v)流速1.2ml/min，进样量10μl，内部温度与柱温都为35℃。

l-鼠李糖dns测定方法：取0.5ml稀释后的转化液于5ml离心管中，加入1mldns试剂，沸水浴5min，冷却到室温后，用去离子水补至5ml，540nm波长下测定吸光度，计算鼠李糖含量。

相关计算公式：

l-鼠李糖萃取率(e)定义如下：des相中鼠李糖与初始转化液中鼠李糖的质量之比。

l-鼠李糖的萃取率(e)可由以下公式计算得到：

ct和cb分别代表萃取后鼠李糖在上相和下相中的浓度；vt和vb分别表示双水相上相和下相的体积(上相为富des相，下相为盐相)；e为萃取率。

实施例1：dess制备

将一定量的氢键受体(氯化胆碱、甜菜碱)和氢键供体(尿素、甘油、乙二醇、1，2-丙二醇、柠檬酸、d，l-苹果酸、乳酸、甲酸、醋酸、乙酰胺、硫)，按一定的摩尔比混合，70-80℃加热搅拌10-240min，直至形成均一透明的液体，所形成的透明液体即为合成的des，共得到24种des：chcl-u、chcl-g、chcl-eg、chcl-p、chcl-ca、chcl-ma、chcl-la、chcl-fa、chcl-aa、chcl-u-g、chcl-u-eg、chcl-u-a、chcl-u-t、chcl-eg-a、chcl-eg-t、chcl-p-g、chcl-p-a、chcl-p-t、chcl-p-u、chcl-fa-aa、chcl-aa-g、chcl-aa-u、bet-la、bet-eg。des具体制备条件见表1。

表1不同的des成分组成

实施例2：不同的des对芦丁的转化

将上述24种des，分别与0.1m、ph4.0的柠檬酸缓冲液配制成20％(v/v)的des溶液，同时用4m的naoh溶液调节ph为4.0，作为芦丁转化的反应介质。加入α-l-鼠李糖苷酶，使得酶浓度为8u/ml，底物芦丁浓度为120g/l，50℃，120r/min反应2h。使用dns试剂测定生成的鼠李糖的量，计算芦丁转化率于表2。

表2des对芦丁转化率的影响

结果，6种des，chcl-u、chcl-fa、chcl-aa、chcl-u-t、chcl-p-t、bet-la，对转化有较好的促进作用，将转化率从以ph4.0-5.0的柠檬酸缓冲液为介质的62.32％分别提高到了67.44％、69.93％、67.85％、69.61％、69.01％、68.60％。选取这6种des配制成不同浓度的溶液转化芦丁，确定最佳的des及浓度。

实施例3：不同浓度的des在提高芦丁转化率中的应用

将实施例2中的6种des与0.1m、ph4.0的柠檬酸缓冲液配制成ph4.0、10-50％(w/w)的des缓冲液，按实施例2的方法进行芦丁转化，计算芦丁转化率(摩尔转化率，消耗1mol芦丁可产生1mol鼠李糖，鼠李糖的摩尔生成量＝芦丁的摩尔转化率)。

表3des浓度对芦丁转化率的影响

结果如表3所示，chcl-u和chcl-u-t为40％(w/w)时，芦丁转化率都能达到79.95％；bet-la的转化率能达到78.21％。

实施例4：不同酶浓度在提高芦丁转化率中的应用

以ph4.0、0.1m柠檬酸溶液为反应介质，加入芦丁使其终浓度为120g/l，加入粗酶液，使得酶终浓度分别为2-14u/ml，50℃、120r/min反应2h，取样在沸水中灭活5min，冷却到室温后用dns试剂测定鼠李糖的生成量。

以chcl-u溶液为反应介质，如实施例2与3的芦丁转化条件，其中加入粗酶液，使得酶终浓度分别为1-8u/ml，50℃、120r/min反应2h，取样在沸水中灭活5min，冷却到室温后用dns试剂测定鼠李糖的生成量。结果如表4。

表4不同酶浓度对芦丁转化率的影响

结果如表4所示，在柠檬酸缓冲液中，酶浓度为8u/ml时，转化率为64.08％，继续提高酶浓度，转化率变化不大；chcl-u溶液中，酶浓度为6u/ml时，转化率最高为91.86％。

实施例5：反应时间及反应介质在提高芦丁转化率中的应用

分别在a和b条件下对芦丁进行转化。

a：ph4.0的柠檬酸溶液为反应介质，底物芦丁浓度130g/l，酶终浓度8u/ml，55℃、120r/min反应15-150min；和b：ph5.0、40％(w/w)chcl-u为反应介质，底物芦丁浓度130g/l，酶终浓度6u/ml，50℃、120r/min反应15-150min。

表5反应时间及反应介质对芦丁转化率的影响

结果显示：在柠檬酸缓冲液中，反应时间为45min时，转化率达到平衡为67.18％；在chcl-u中，反应时间为60min时，转化率为100％。

实施例6：成相盐的选择

取3ml50％(w/w)chcl-u于试管中，加入不同的无机盐至形成双水相或饱和，加入的无机盐为na3c6h5o7、k2hpo4、kh2po4、nah2po4、naco3、naac、(nh4)2so4。如图2所示，最终k2hpo4能够与chcl-u形成双水相，双水相的制备根据des浓度与k2hpo4浓度换算得到(如表6所示)。

表6双水相形成过程中des浓度与k2hpo4浓度对应关系

实施例7：制备异槲皮素

以浓度为40％(w/w)的chcl-u溶液为反应介质，底物芦丁浓度130g/l，终浓度为6u/ml的α-l-鼠李糖苷酶，55℃、120r/min反应60min，转化结束后加入2倍体积的去离子水，在4℃条件下放置3h，然后进行抽滤，收集滤液用于制备鼠李糖，将抽滤获得的不溶物用去离子水洗涤3次，洗涤后的溶液重新进行抽滤，获得的不溶物进行50℃真空干燥，获得异槲皮素粗品，如图3。

将上述抽滤获得的滤液用活性炭进行脱色，脱色条件为：用6mhcl将滤液调节ph为2，加入终浓度为1.5％(w/v)的活性炭，70℃、120r/min脱色40min，用滤纸过滤去除活性炭获得脱色液，将脱色液浓缩，然后按实施例6的方法加入k2hpo4形成双水相，上相中的des重复用于芦丁转化，下相溶液用于制备鼠李糖。

实施例8：制备l-鼠李糖

将实施例7双水相萃取的下相溶液混合用于制备l-鼠李糖，在65℃条件下旋转蒸发浓缩，浓缩液鼠李糖浓度为200g/l以上，在浓缩液中加入1.5倍体积的乙醇，离心去除盐，剩余的溶液在4℃放置12-24h，将溶液倾去获得沉淀，将沉淀在50℃下真空干燥烘干，获得l-鼠李糖粗品，如图4。

实施例9：重复利用des制备异槲皮素

按实施例7的方法，芦丁转化后的上清液，用双水相萃取des，在得到的des中添加少量新的des，使得des浓度为40％(w/w)(若不添加新的des，则可适当延长反应时间)，用于芦丁转化，重复进行4次。所制备的异槲皮素粗产物溶于甲醇，使用0.45μm滤膜过滤后，使用hplc测定异槲皮素含量，结果如表7，最终获得异槲皮素的纯度分别为96.59％、96.25％、95.71％、92.28％。

表7des重复次数对获得的异槲皮素纯度的影响

实施例10

分别将chcl-u、chcl-u-t和bet-la替代chcl-u应用于实施例4～8的反应过程中，结果显示，chcl-u、chcl-u-t和bet-la具有与chcl-u趋同或类似的效果。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。