来自患者的诱导性多能干细胞的心肌细胞及其使用方法与流程

联邦资助研究与开发

本发明是在国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的合同hl099776下于政府资助下完成。政府享有本发明的某些权利。

背景技术：

多种心脏病具有潜在的遗传病因。例如，扩张型心肌病(dcm)是一种特征为心室扩张和心脏收缩障碍的心脏病。dcm是排在冠状动脉疾病和高血压之后最常见的心力衰竭的病因，并且是心脏移植的主要指示。仅在美国，控制dcm的花费已被估计为40亿-100亿美元。治疗的另一种重要病症是肥大型心肌病(hcm)，其中肌节复制导致心肌细胞在尺寸上增加。另外，心肌细胞的正常排列被打乱，这种现象称为心肌混乱(myocardialdisarray)。由于9个肌节基因中有1个突变，因而hcm是最常见的。

编码肌节蛋白、细胞骨架蛋白、线粒体蛋白和核膜蛋白以及钙代谢相关蛋白质的基因中的突变与大约三分之一到一半的dcm病例相关联。心脏肌钙蛋白t(ctnt)是肌钙蛋白复合物(肌钙蛋白t、c和i)的3个亚基之一，该肌钙蛋白复合物调节心肌细胞(cm)中肌节细肌丝的活性以及肌肉收缩。ctnt对于肌节组装、收缩和力量产生是必需的。心脏肌钙蛋白t基因(tnnt2)中的突变常导致dcm，并且常常表达为关于在幼年时心脏性猝死和心力衰竭的恶性表型。体外生物化学研究已经发现导致力量产生受损的ca²⁺敏感性和/或atp酶活性降低可能是某些tnnt2-突变诱导的dcm的潜在机制。

tnnt2突变的小鼠模型涵盖了人dcm表型并且提供对于该疾病的可能机制的更广泛认识。然而，在小鼠模型和人模型之间存在几种差异。例如，小鼠静息心率比人快约10倍。小鼠cm的电特性、离子通道贡献和心脏发育也与人不同。体外生化试验中的心肌细胞内复杂细胞内互相作用的缺乏和小鼠模型的物种差异，削减了这些方法对于理解dcm的细胞和生理学过程以及药物筛选的价值。

另外，很难得到来自dcm患者的心脏组织并且该组织不能在长期培养中存活。人们对将扩张型心肌病和其它遗传心脏病症的有效细胞模型用于筛选和开发有效的治疗方法有很大兴趣。

药品发现是一个数十亿美元的产业，其包括治疗靶标的鉴定和验证，以及先导化合物的鉴定和优化。在最近几年中，由基因组学和组合化学方法产生的潜在新靶标和化学实体数量激增对筛选程序施加了很大的压力。虽然对有用药物鉴定的回报是巨大的，但是从任何筛选程序命中的百分比一般都很低。理想的化合物筛选方法同时通过如下方式解决这一问题：允许高通量，从而能够测试很多个体化合物；以及提供生物学相关的信息，使得筛选试验产生的信息与化合物的药效良好关联。

对于药效而言，一些更重要的特征是针对靶向细胞或疾病的特异性、在相关剂量下无毒，以及所述化合物对于其分子靶标的特定活性。本发明解决了这一问题。

出版物。使灵长类的分化的体细胞重编程成多能状态的方法包括分化体细胞的核转移、分化体细胞与多能干细胞的融合以及直接重编程，来产生诱导性多能干细胞(ips细胞)(takahashik等，(2007)cell131：861-872；parkih等，(2008)nature451：141-146；yuj等，(2007)science318：1917-1920；kimd等，(2009)cellstemcell4：472-476；soldnerf等，(2009)cell.136：964-977；huangfud等，(2008)naturebiotechnology26：1269-1275；liw等，(2009)cellstemcell4：16-19)。

感兴趣的其它出版物包括stadtfeld等，science322，945-949(2008)；okita等，science322，949-953(2008)；kaji等，nature458，771-775(2009)；soldner等，cell136，964-977(2009)；woltjen等，nature458，766-770(2009)；yu等，science(2009)。

发明概述

提供用于心肌细胞的疾病相关筛选的组合物和方法，供于治疗性药物和治疗方案，其中该方法采用体外细胞培养或其衍生的动物模型。特别感兴趣的疾病包括扩张型心肌病(dcm)、肥大型心肌病(hcm)、蒽环类抗生素诱导的心脏中毒、心律失常性右心室发育不良(arvd)、左心室致密化不全(lvnc)、左心室双入口(dilv)以及长qt(1型)综合征(lqt-1)，其中该疾病存在遗传基础。该方法采用诱导性人多能干细胞(ips细胞)，所述ips细胞可获自患者或载体细胞样品(例如脂肪细胞、成纤维细胞等)。

在本发明的一些实施方式中，提供了疾病相关心肌细胞的体外细胞培养，其中从诱导性人多能干细胞(ips细胞)分化心肌细胞，所述ips细胞包含编码心脏病相关突变的至少一种等位基因。感兴趣的突变包括以下基因中的突变：心脏肌钙蛋白t(tnnt2)；肌球蛋白重链(myh7)；原肌球蛋白1(tpm1)；肌球蛋白结合蛋白c(mybpc3)；5′-amp-活化的蛋白激酶亚基γ-2(prkag2)；3型肌钙蛋白i(tnni3)；肌联蛋白(ttn)；肌球蛋白，轻链2(myl2)；肌动蛋白，α心肌1(actc1)；电压门控性钾通道，kqt-样亚家族，成员1(kcnq1)；斑菲素蛋白2(plakophilin2)(pkp2)；以及心脏lim蛋白(csrp3)。感兴趣的特定突变包括但不限于myh7r663h突变、tnnt2r173w、pkp22013delc突变、pkp2q617x突变和kcnq1g269s错义突变。

在一些实施方式中，提供一组这样的心肌细胞，其中该组包含两种或更多种不同的疾病相关心肌细胞。在一些实施方式中，提供一组这样的心肌细胞，其中使所述心肌细胞接触多种候选试剂，或候选试剂的多个剂量。候选试剂包括小分子，即，增加或减少感兴趣的rna的表达、电学变化等的药物、基因构建体。在一些实施方式中，疾病相关心肌细胞被引导或诱导在体内环境中从ips细胞分化，例如作为动物模型中的外植体。在一些实施方式中，一组是指采用患者特异性心肌细胞的系统或方法，所述心肌细胞来自两种或更多种不同的心脏病症，并且可以是三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种不同的病症，其中所述病症选自：扩张型心肌病(dcm)、肥大型心肌病(hcm)、蒽环类抗生素诱导的心脏中毒、心律失常性右心室发育不良(arvd)、左心室致密化不全(lvnc)、左心室双入口(dilv)以及长qt(1型)综合征(lqt-1)。

在本发明的一些实施方式中，提供用于测定候选试剂对疾病相关心肌细胞的活性的方法，该方法包括：将所述候选试剂与一种或一组分化自诱导性人多能干细胞(ips细胞)的心肌细胞接触，所述多能干细胞包含编码心脏病相关突变的至少一种等位基因；和，测定该试剂对于形态、遗传或功能参数的影响，所述参数包括但不限于钙瞬变幅度、细胞内ca²⁺水平、细胞尺寸收缩力产生、搏动速率、肌节α-辅肌动蛋白分布和基因表达谱。人们对单细胞水平的分析方法特别感兴趣，例如原子力显微镜、微电极阵列记录、膜片钳、单细胞pcr和钙成像等。

在所述疾病是dcm的情况中，可以在与候选试剂接触前、中或后通过正性肌力压力(positiveinotropicstress)(如β-肾上腺素激动剂)来刺激心肌细胞。在一些实施方式中，所述β-肾上腺素激动剂是去甲肾上腺素。本文显示dmc心肌细胞具有响应正性肌力压力的初始正性变时作用，其之后变成以衰竭为特征的负性作用，所述衰竭特征如搏动速率减小，收缩减弱和具有异常肌节α-辅肌动蛋白分布的细胞显著增多。β-肾上腺素阻断剂处理和肌质网ca²⁺atp酶(serca2a)的过表达改善所述功能。dcm心肌细胞也可以用通路中的遗传物质来测试，所述遗传因子包括促进心脏发生的因子、整联蛋白和细胞骨架信号传导以及泛素化通路，如表8所示。相比相同家族组群中的对照健康个体，dcm心肌细胞展现出减小的钙瞬变幅度、减弱的收缩和异常肌节α-辅肌动蛋白分布。

在所述疾病是hcm的情况中，可以在与候选试剂接触前、中或后通过正性肌力压力(如β-肾上腺素激动剂)来刺激心肌细胞。在这种情况下，hcm心肌细胞展现出较高的肥大反应，这能够通过β-肾上腺素阻断剂来逆转。相比健康个体，hcm心肌细胞展现出细胞大小增大和hcm相关基因的上调，以及较不规律的收缩(以不完全搏动为特征)，包括较高频率的异常ca²⁺瞬变(以次级不完全瞬变(secondaryimmaturetransient)为特征)。这些心肌细胞的细胞内ca²⁺水平升高，并且在一些实施方式中，靶向钙依赖磷酸酶或其它钙粘附相关靶标的候选试剂。

同时提供包含编码心脏病相关突变的至少一种等位基因的多能干细胞群。感兴趣的突变包括以下基因中的突变：心脏肌钙蛋白t(tnnt2)；肌球蛋白重链(myh7)；原肌球蛋白1(tpm1)；肌球蛋白结合蛋白c(mybpc3)；5′-amp-活化的蛋白激酶亚基γ-2(prkag2)；3型肌钙蛋白i(tnni3)；肌联蛋白(ttn)；肌球蛋白，轻链2(myl2)；肌动蛋白，α心肌1(actc1)；电压门控性钾通道，kqt-样亚家族，成员1(kcnq1)；斑菲素蛋白2(pkp2)；以及心脏lim蛋白(csrp3)。感兴趣的特定突变包括但不限于：myh7r663h突变、tnnt2r173w、pkp22013delc突变、pkp2q617x突变和kcnq1g269s错义突变。所述多能干细胞群可以细胞培养物形式提供，可任选地以无饲养层细胞培养物形式提供。不同体细胞都可用作ips细胞的来源；特别感兴趣的是脂肪源性的干细胞、成纤维细胞等。由此衍生的多能细胞和心肌细胞可用于移植，用于实验性评估，作为谱系或细胞特异性产物的来源等。阅读以下更完整描述的主题方法和组合物细节，本领域技术人员将明白本发明的这些和其他目的、优点和特征。

附图简要说明

图1.患者特异性dcmipsc的产生。(a)在该研究中募集的7名dcm家族成员的谱系示意图。实心方块(男性)和圆圈(女性)代表1号染色体上的两个等位基因之一中携带特定tnnt2r173w突变的个体。(b)通过pcr和dna测序确定r173w点突变存在于dcm患者的tnnt2基因的外显子12上。con，对照。(c)从皮肤活检扩增的源自患者的皮肤成纤维细胞的代表性图像。(d)esc-样和(e)用yamanaka因子使源自患者的皮肤成纤维细胞重编程获得的tra-1-60阳性集落的代表性图像。(f)患者皮肤成纤维细胞衍生的ipsc的免疫荧光染色和碱性磷酸酶染色。(g)针对患者特异性ipsc中的oct4和nanog的启动子区域上的甲基化状态的定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序分析。在患者特异性ipsc中，nanog和oct4启动子区域都是高度去甲基化的。(h)由注射进入免疫缺陷小鼠的肾小囊的患者特异性ipsc衍生的畸胎瘤显示全部3种胚层的组织。标尺，200μm。

图2.在ne处理之后，dcmipsc-cm展现出具有异常肌节α-辅肌动蛋白分布和早期衰竭的细胞数目明显较高。(a)在分化后30天对肌节α-辅肌动蛋白和ctnt进行免疫染色。单个dcmipsc-cm展现出点状肌节α-辅肌动蛋白分布图案，这表明混乱的肌丝结构。合并的显微照片的方框区的放大图显示细胞中α-辅肌动蛋白和ctnt的详细染色图案。标尺，20μm。(b)与对照ipsc-cm(n＝368)相比，明显较高百分比的dcmipsc-cm(n＝391)在超过总细胞面积的四分之一中显示点状肌节α-辅肌动蛋白染色图案(**p＝0.008)。(c)在对照(n＝36)和dcmipsc-cm(n＝39)之间没有观察到细胞尺寸的显著差异。(d)追踪随时间变化的收缩性质的代表性的mea试验，所述收缩性质是用ne处理或不用ne处理的对照(n＝14)和dcm(n＝14)搏动eb。在双室mea探针中接种eb，一侧用ne处理，另一侧不用ne处理。在实验中同时记录电信号。使搏动频率针对不用ne处理的eb的搏动频率进行标准化。(e)通过视频成像的，在ne处理之后随时间变化的经标准化的cm簇的搏动频率(n＝10)。(f)在ne处理7天之后，对单个对照和dcmipsc-cm进行肌节α-辅肌动蛋白免疫染色的代表性图片。与对照相比，长期的ne处理显著恶化了dcm细胞的肌节组织。标尺，20μm。(g)用ne处理(对照，n＝210；dcm，n＝255)或不用ne处理(对照，n＝261；dcm，n＝277)的，具有混乱肌节染色图案的cm的百分比。ne处理显著增加了在dcm组中混乱cm的数量(**p＜0.001)，并且对于对照ipsc-cm(*p＝0.05)的效果不太显著。(h)追踪在ne处理之后ipsc-cm随时间的形态变化和收缩性变化。标尺，200μm。数据以平均值±标准误表示。

图3.dcmipsc-cm展现出较小的[ca²⁺]i瞬变。(a)在对照(左)和dcmipsc-cm(右)中的代表性线性扫描图像和(b)自发钙瞬变。(c)在对照和dcmipsc-cm中自发钙瞬变的频率。(d)在对照和dcmipsc-cm中[ca²⁺]i瞬变的整合显示相对于对照细胞，在dcm中每次瞬变释放的ca²⁺较少(对照，n＝87细胞；dcm，n＝40，**p＝0.002)。在对照和dcm细胞之间，(e)节律的不规则性(标准偏差/平均值)或(f)自发钙瞬变的幅度没有显著的差异。

图4.serca2a的过表达恢复了dcmipsc-cm的收缩性。(a)在腺病毒转导dcmipsc-cm之后serca2a表达的western印迹。在用ad.serca2a转导的细胞中serca2a蛋白水平上调，但在用ad.gfp转导的细胞中serca2a蛋白水平没有上调。(b)显示afm悬臂靠近gfp阳性的单个搏动cm的代表性图像。标尺，50μm。(c)通过afm测量的超过100-400次搏动的所有单个ipsc-cm的收缩力的直方图。serca2a的过表达明显将dcmipsc-cm的收缩力恢复至接近对照的水平。(d)由afm测量的单个cm的平均收缩力的点图。单向anova分析表明在所有组的平均值之间存在显著差异(**p＝0.002)。徒吉(tukey)多重比较检验表明相比用ad.gfp(n＝17)的转导，对照ipsc-cm(n＝13)(p＝0.001)和ad.serca2a(n＝12)(p＝0.005)转导的dcmipsc-cm展现出显著更强的收缩力。ad.serca2a转导的dcmipsc-cm显示与对照ipsc-cm相当的收缩力(p＝0.578)。(e)在分别用ad.gfp和ad.serca2a转导的单个dcmipsc-cm中的代表性自发钙瞬变。(f)与用ad.gfp转导的细胞(n＝14)相比，用ad.serca2a转导的dcmipsc-cm(n＝22)展现出增加的全钙瞬变(*p＝0.04)(双尾斯氏t检验)。(g)在ad.serca2a(n＝40)或ad.gfp(n＝40)过表达的dcmipsc-cm中，具有混乱肌节染色图案的cm的百分比。在两组之间没有观察到显著的差异(双尾斯氏t检验)。数据表示为平均值±标准误。

图5.在源自家族中dcm患者的ipsc中的r173w突变。tnnt2的基因座的基因组pcr和dna测序表明来自所有dcm患者的ipsc携带r173w(c到t)突变。

图6.通过微阵列比较人esc(h7)、皮肤成纤维细胞和患者特异性ipsc的全mrna表达模式。皮尔森相关和散点图都表明患者特异性ipsc的全基因表达图案与人esc的全基因表达图案高度相似。

图7.在扩展培养(extendedculture)之后，患者特异性ipsc保持正常的核型。显示培养20代之后的来自两种dcmipsc细胞系的代表性图像。

图8.总量相对内源性yamanaka重编程因子的相对表达水平的定量pcr。通过比较各重编程因子的总基因表达水平与内源性基因表达水平，在大多数已建立的患者特异性ipsc中，外源性转基因oct4、sox2、klf4和c-myc被沉默。在所有患者特异性ipsc中，内源性nanog表达被上调，这表明各细胞系的多能性状态。注：使nanog表达水平针对h7人esc的nanog表达水平进行标准化(未显示)。用于定量pcr的引物信息列于补充表6中。

图9.患者特异性ipsc在体外能够分化为来自3种胚层的细胞。从所有患者特异性ipsc的自发分化中检测到不同的细胞类型，如神经元、内皮细胞、血红细胞，和表达中胚层标记物平滑肌肌动蛋白(sma)的细胞、表达内胚层标记物甲胎蛋白(afp)的细胞以及表达外胚层标记物(tuj-1)的细胞。标尺，100μm。

图10.患者特异性ipsc的相对心脏分化效率。心脏分化效率表示为搏动eb的百分比(就细胞系而言n＝3，数据以平均值±标准误表示)。

图11.在衍生自对照和dcmipsc的搏动eb中ctnt阳性cm的百分比的facs分析。在搏动eb中约50-60％的细胞是ctnt阳性心肌细胞。

图12.dcm和对照ipsc-cm中野生型(wt)和突变体(r173w)tnnt2表达的等位基因特异性pcr。确定了患者iia、iib和iiia在他们各自的ipsc-衍生的cm中表达突变体tnnt2。用于等位基因pcr的引物列于补充表6中。

图13.检测ipsc-衍生的搏动eb的电生理性质的多重电极阵列(mea)。(a)mea探针和接种的4种搏动eb的代表性图像。(b)通过(a)中所示的4种搏动eb的mea反射场电位记录的电信号。(c)显示场电位时程(fpd)、最大正幅度(mpa)、最大负幅度(mna)和峰电位间隔(isi)的提取的mea场电位照片。

图14.分析在分化后30天时24个对照和24个dcmipsc-cm中基因表达水平的单细胞pcr。分析了相对于α-微管蛋白的基因表达水平的(a)心脏特异性转录因子，(b)钙操作相关蛋白，(c)离子通道，(d)肌节蛋白和(e)骨骼肌特异性蛋白的基因表达。在对照和dcmcm之间没有观察到显著的差异。数据以平均值±标准误表示。使用双尾斯氏t检验检验统计学差异。

图15.ipsc-cm表达的心脏特异性蛋白。对照和dcmipsc-cm都表达心脏特异性蛋白肌节α-辅肌动蛋白、ctnt、连接蛋白43和mlc2a。箭头表示在细胞-细胞接触处的连接蛋白43的阳性染色。标尺，20μm。

图16.图2a中所示的单个cm中肌节α-辅肌动蛋白和ctnt的免疫染色的放大图。标尺，20μm。

图17.图2f中所示的在单个cm中肌节α-辅肌动蛋白和ctnt的双免疫染色。标尺，20μm。

图18.图2f中所示的各细胞的合并照片的放大图。应注意的是在ne处理之后，一些单个dcmipsc-cm显示肌丝的完全变性，这在对照cm中未观察到。标尺，20μm。

图19a-c.单个dcmipsc-cm对比对照ipsc-cm的实时pcr显示在ne处理一周后的基因表达变化。在分化后19天时对照和dcmipsc-cm接种在培养盘上，并且在48小时后用或不用10μmne处理，持续7天。挑取来自对照(用ne处理，n＝8；不用ne处理，n＝8)和dcm(用ne处理，n＝8；不用ne处理，n＝8)ipsc的单个cm，并且如方法部分所述来实施pcr。第一次计算在用ne处理和不用ne处理的细胞之间的净循环阈值(ct)。然后数据表示为相对于对照组净ct值的dcm组的净ct值。在ne处理之后，基因被分为上调基因(ct中＞1的循环差异)，下调基因(ct中＞1的循环差异)和没有表达变化的基因(ct中＜1的循环差异)。

图20.通过膜片钳测量的ipsc-cm的电生理特征。(a)在对照和dcmipsc-cm中都观察到3种类型的自发ap(左：心室样；中：心房样；右：节点样)。估计70-80％的细胞是心室样cm，而其它是心房样细胞和/或节点样细胞。对照和dcmipsc之间的心脏命运没有显著差异(数据未显示)。(b)通过电流钳记录对照和dcm心室肌细胞的自发ap。与对照细胞相比，dcm心室细胞具有稍短的ap(p＝0.112)(c)。在测量的时点上(分化后19天-25天)，对照和dcm细胞之间在频率(d)，ap的峰幅度(e)或静息膜电位(f)上没有显著差异(对照，n＝18；dcm，n＝17)。使用双尾斯氏t检验检验统计学差异。

图21.ipsc-cm的收缩力的原子力显微镜(afm)测量。(a)在单个心肌细胞水平上，afm的力测量的方法示意图。(b)显示afm悬臂探测单个心肌细胞的代表性图像。标尺，20μm。(c)显示通过afm得到的信号和检测的参数(力、频率和搏动时程)的代表性照片。

图22.通过afm测量的，单个ipsc-cm的搏动频率和时程。(a)通过afm测量的平均搏动频率的点图。在对照ipsc-cm(n＝13)、ad.serca2a(n＝12)和ad.gfp(n＝17)转导的dcmipsc-cm之间没有观察到搏动频率和节奏中的显著差异。(b)通过afm测量的平均搏动时程的点图。serca2a的过表达显著缩短了搏动时程(*p＝0.029)。使用单向anova然后使用徒吉多重比较检验来检验统计学差异。通过afm所测量的，所有单个ipsc-cm的超过100-400次搏动的(c)搏动频率和(d)搏动时程的直方图。

图23.通过afm所测量的，各个单细胞的相对细胞大小对比收缩力的点图。在(a)对照(r²＝0.006)、(b)dcm/dcm-ad.gfp(r²＝0.105)和(c)dcm-ad.serca2a(r²＝0.061)组中细胞大小和收缩力之间没有明显的线性关系。

图24.在serca2a和gfp过表达之后，在培养盘中搏动点(beatingfocus)的经标准化的百分比。数据表示实验的3次独立重复的平均数(平均值±标准误)。

图25.对于用ad.serca2a或ad.gfp腺病毒转导的ipsc-cm，使用红色荧光ca²⁺指示物rhod-2am进行ca²⁺成像。(a)合并的共焦图像显示gfp阳性cm摄入rhod-2染料。(b)对于(a)中的相同细胞沿图中所示的箭头线扫描。(c)记录在(a)和(b)中所示的特定cm的线扫描图像。标尺，20μm。

图26.通过afm测量的，用ad.serca2a或ad.gfp转导的对照ipsc-cm的收缩性。ad.serca2a(n＝10)或ad.gfp(n＝10)转导的对照ipsc-cm的(a)收缩力、(b)搏动频率和(c)搏动时程的点图。在每组的平均值之间没有观察到统计学显著差异。使用双尾斯氏t检验检验统计学差异。通过afm测量的所有单个对照ipsc-cm的100-400次搏动的(d)收缩力、(e)搏动频率和(f)搏动时程的直方图。

图27.具有serca2a过表达特征的富集通路的dcmipsc-cm的基因表达谱，所述富集通路可能在拯救dcm表型中发挥作用。(a)与没有用serca2a处理的dcmipsc-cm相比，在对照ipsc-cm和用serca2a-处理的dcmipsc-cm的生物学重复中，表达水平上超过1.5倍差异的191个基因的热图。(b)可能涉及通过serca2a过表达来拯救dcm表型的富集通路的热图。

图28.美托洛尔处理改善了dcmipsc-cm的肌节组织并且减轻ne处理的恶化效果。(a)10μm美托洛尔处理增加了具有完好的肌节完整性的dcmipsc-cm的数量(未处理的，n＝100；处理的，n＝86，*p＝0.023)。(b)美托洛尔处理防止由ne处理诱导的dcmipsc-cm的恶化。与没有美托洛尔处理的细胞(n＝108)相比，1μm(n＝107，**p＝0.008)和10μm(n＝101，**p＝0.001)美托洛尔都能显著减少混乱细胞的数量。(c)10μm美托洛尔处理对于对照ipsc-cm的肌节完整性没有显著的效果(未处理的，n＝88；处理的，n＝75)。数据以平均值±标准误表示。使用双尾斯氏t检验检验统计学差异。

图29.dcmipsc-ec和对照ipsc-ec的相似功能性质。(a)facs分析表明dcm和对照ipsc向cd31⁺ec的分化的效率是相似的。(b)来自分化的dcm和对照ipsc的facs分离的cd31⁺细胞都表达内皮细胞标记物cd31和cd144。(c)dcm和对照ipsc-衍生的ec展现出低密度脂蛋白(ldl)的摄入能力(红色荧光)。(d)对照和dcmipsc-衍生的ec都能够在基质胶表面上形成网状管。标尺，100μm。

图30.在dcmipsc-cm中通过serca2a基因治疗的潜在机制的示意图。在心脏肌钙蛋白t中的突变负面影响收缩性、肌节形成和钙信号传导，这造成该钙相关基因(如肌集钙蛋白、nfat和tric通道)中的变化。然而，在tnnt2r173wdcmipsc-cm中，电激发是正常的。serca2a、sr/er膜钙泵的递送恢复了钙操作分子的水平，逆转了减小的钙瞬变和收缩性，从而改善dcmipsc-cm的整体功能。ctnt，心脏肌钙蛋白t；ltc，l-型钙通道；ryr，雷诺定(ryanodine)受体钙释放通道；csq，肌集钙蛋白；pm，质膜。

图31a-m.患者特异性hcmipsc-cm的产生和表征。(a)先征者和对照匹配家族成员在收缩末期和舒张末期的代表性长轴mri图像，证明下壁的不对称肥大。(b)通过pcr和序列分析对hcm患者(ii-1、iii-1、iii-2、iii-3和iii-8)中myh7基因的外显子18上的arg663his错义突变进行确证。(c)本研究募集的在myh7中携带arg663his突变的先征者(ii-1)及其丈夫(ii-2)以及8个孩子(iii-1到iii-8)的谱系示意图。圆圈代表女性家族成员而方块代表男性。实心标志表示hcm表型的临床表现，而空心标志代表没有表现。在家族成员之下的“+”和“-”符号分别表示arg663his突变的存在和不存在。发现2个个体(iii-3和iii-8)携带arg663his突变，但是由于年龄年轻，所以还没有表现出hcm表型。(d)心脏肌钙蛋白t和f-肌动蛋白的代表性免疫染色证明与对照ipsc-cm相比，在hcmipsc-cm中增加的细胞大小和多核化现象。(e)在心脏分化诱导之后40天，对4种对照ipsc-cm细胞系(ii-2，iii-4，iii-6，iii-7)(每名患者细胞系n＝55)和4种hcmipsc-cm细胞系(ii-1，iii-1，iii-2，iii-8)(每名患者细胞系n＝59)的的细胞大小定量。(f)对对照(n＝55，4名患者细胞系)和hcmipsc-cm(n＝59，4名患者细胞系)中多核化的定量。(g)代表性的免疫荧光染色揭示了与对照相比，hcmipsc-cm中anf的表达升高。(h)在心脏分化诱导之后20天、30天和40天时，由单细胞定量pcr所测量的，对照和hcmipsc-cm中anf基因表达的变化(每个时间点n＝32，5名患者细胞系)。(i)在hcmipsc-cm和对照中myh7/myh6表达比率的定量(每个时间点n＝32，5名患者细胞系)。(j)代表性的免疫荧光染色图像揭示了hcmipsc-cm中的nfatc4的核移位。(k)在对照(n＝187，5名患者细胞系)和hcmipsc-cm(n＝169，5名患者细胞系)中展现出阳性nfatc4染色的心肌细胞的百分比。(l)在用钙依赖磷酸酶抑制剂cs-a和fk506的连续5天处理之后，对对照和hcmipsc-cm的细胞大小的定量(n＝50，每组5名患者细胞系)。(m)在心脏分化诱导后20天、30天和40天，对单个对照和hcmipsc-cm中与心脏肥大相关基因的基因表达的代表性热图。*表示hcm对比对照，p＜0.05；**表示hcm对比对照，p＜0.0001。

图32a-n.对hcmipsc-cm中心律失常和不规则ca²⁺调节的评估。(a)由电流钳模式中的膜片钳所测量的，对对照和hcmipsc-cm中的自发动作电位的电生理测量。方框中表示在延长的时间尺度下hcmipsc-cm波形的划线部分，显示有dad-样心律失常。(b)对对照(n＝144，5名患者细胞系)和hcmipsc-cm(n＝131，5名患者细胞系)中dad出现的定量。dad比率被定义为总dad/总搏动。(c)展现出有推定dad的对照(n＝144，5名患者细胞系)和hcmipsc-cm(n＝131，5名患者细胞系)的百分比的定量。(d)在对照和hcmipsc-cm中的代表性线扫描图像和自发ca²⁺瞬变。红色箭头表明在hcm细胞中而不是在对照中观察到的快速心律失常样的波形。(e)在心脏分化诱导后20天、30天和40天时，展现出不规则ca²⁺瞬变的对照和hcmipsc-cm的百分比的定量(n＝50，每个时间点5名患者细胞系)。(f)用驱动表达野生型myh7或携带arg663his的突变体myh7的慢病毒进行稳定诱导的h9hesc-cm和hesc-cm的代表性线扫描图像和自发ca²⁺瞬变。红色箭头表示不规则的ca²⁺波形。(g)在wa09hesc-cm、过表达野生型myh7的hesc-cm和过表达携带arg663his突变的myh7的hesc-cm中，展现出不规则ca²⁺瞬变的细胞的定量(n＝40，每组5名患者细胞系)。(h)对于hesc-cm、过表达野生型myh7的hesc-cm和过表达携带arg663his突变的myh7的hesc-cm，由电流钳模式记录的自发动作电位。红色箭头表示dad-样波形。(i)在hesc-cm、由驱动表达野生型myh7或携带arg663his突变的突变体myh7的慢病毒进行稳定转导的hesc-cm中，展现出dad-样波形的细胞的定量(n＝20，每组5名患者细胞系)。(j)对于对照(n＝122，4名患者细胞系)和hcmipsc-cm(n＝105，4名患者细胞系)，基线fluo-4ca²⁺染料强度的定量。(k)使用indo-1比率计的ca²⁺染料的、对照和hcmipsc-cm的代表性ca²⁺瞬变。(l)通过对对照(n＝17，4名患者细胞系)和hcmipsc-cm(n＝26，4名患者细胞系)中indo-1比率的测量进行静息ca²⁺水平的定量。(m)来自对照和hcmipsc-cm然后通过咖啡因暴露的代表性ca²⁺瞬变踪迹。(n)在给予咖啡因之后，δf/f0比率的平均峰幅度，代表了对照(n＝23，3个细胞系)和hcmipsc-cm(n＝35，3个细胞系)的srca²⁺负荷的释放。*表示hcm对比对照，p＜0.05；**表示hcm对比对照，p＜0.01。

图33a-e.由正性肌力压力所致的hcm表型的恶化。(a)通过β-激动剂异丙基肾上腺素对对照(n＝50，5名患者细胞系)和hcmipsc-cm(n＝50，5名患者细胞系)进行肌力刺激，与对照对应物相比，这加速了hcmipsc-cm中的细胞肥大的出现。共同给予β-阻断剂普萘洛尔防止了在hcmipsc-cm中由20邻苯二酚胺诱导的肥大。(b)在通过异丙基肾上腺素的正性肌力刺激之后，在对照和hcmipsc-cm中的代表性ca²⁺线扫描和波形。黑色箭头表示异常的ca²⁺波形。(c)对于通过异丙基肾上腺素处理和普萘洛尔共同给药的处理展现出不规则ca²⁺瞬变的对照(n＝50，5名患者细胞系)和hcmipsc-cm(n＝50，5名患者细胞系)的定量。(d)在对照和hcmipsc-cm中在基线上的自发动作电位和心律失常的电生理测量，然后是通过异丙基肾上腺素的正性肌力刺激。红色箭头表示dad-样波形。(e)在给予异丙基肾上腺素之后，对照和hcmipsc-cm中dad比率的定量(总dad/总搏动)。*表示hcm对比对照，p＜0.05；**表示hcm对比对照，p＜0.001；##表示异丙基肾上腺素+普萘洛尔对比异丙基肾上腺素，p＜0.01。

图34.通过维拉帕米处理hcmipsc-cm显著减轻了hcm表型的发展。(a)从心脏分化诱导后25天开始，用0nm、50nm和100nm的l-型ca²⁺通道阻断剂维拉帕米连续5天处理的hcmipsc-cm的代表性免疫染色图像。用维拉帕米处理的hcmipsc-cm的相对细胞大小的定量(n＝50，每个处理组5名患者细胞系)。(b)用0nm、50nm和100nm的维拉帕米连续5天处理的hcmipsc-cm的代表性ca²⁺线扫描图像和波形。hcmipsc-cm的百分比的定量展现出在用维拉帕米处理之后，ca²⁺瞬变不规则(n＝40，每个处理组5名患者细胞系)。(c)用0nm、50nm和100nm的维拉帕米连续5天处理的hcmipsc-cm中，自发动作电位的代表性电生理记录。在用维拉帕米处理之后，对hcmipsc-cm21中dad频率的定量(n＝25，每个处理组5名患者细胞系)。(d)由myh7中hcm突变引起的hcm表型的发展的示意图。红色框表示减轻疾病发展的潜在方法。*表示未处理对比50nm维拉帕米处理对比100nm维拉帕米处理，p＜0.01。

结合附图，通过以下详述更好地理解本发明。

具体实施方式

在描述本发明组合物和方法之前，应理解，本发明不限于所述的具体组合物和方法，因为它们当然可能变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方式，不用来构成限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。

提供数值范围时，也应视作具体公开了该范围的上限和下限之间以下限单位十分之一为间隔的各中间数值，除非上下文另有明确说明。本发明还包括设定范围内任何设定数值或中间数值和该设定范围内任何其它设定数值或中间数值之间的较小范围。取决于设定范围内任何明确排除的限值，所述范围可独立地包含或排除这些较小范围的上下限，本发明也包括这些较小范围不包含限值、包含任一或两个限值的各范围。设定范围包含一个或两个限值时，本发明也包括排除所述限值之一个或两个的范围。

除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然也可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但在此描述一些潜在和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用纳入本文，以公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。应理解，出现抵触时，用本发明公开内容代替任何本文所纳出版物的公开内容。

必须注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提到“重编程因子多肽”包括多种这类多肽，提到“诱导的多能干细胞”包括本领域技术人员已知的一种或多种多能干细胞及其等同物，等等。

提供本文讨论的出版物仅针对其在本申请提交日之前的公开。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际公开日期不同，这可能需要单独确认。

定义

扩张型心肌病(dcm)是心肌症的一种，心肌症是主要影响心肌膜的一组疾病。在dcm中，心肌膜的部分扩张，通常没有任何明显的病因。心脏的左心室或右心室收缩泵功能被破坏，导致进行性心脏扩大和肥大，这一过程称为重塑。虽然在很多情况中没有明显病因，但是扩张型心肌病能够由多种毒性试剂、代谢试剂或感染试剂引起。大约25-35％的患者以家族形式患有疾病，其中大多数的突变影响编码细胞骨架蛋白的基因，同时一些突变影响参与收缩的其它蛋白质。该疾病具有遗传异质性，但是其传递的最常见形式是常染色体显性模式。涉及dcm的细胞骨架蛋白包括心脏肌钙蛋白t(tnnt2)、α-心脏肌动蛋白、结蛋白以及核纤层蛋白a和c和各种其它收缩蛋白。

肥大型心肌病(hcm)是这样一种病症，其中肌节复制造成心肌细胞的大小增加，这导致心肌细胞的增厚。另外，肌肉细胞的正常排列被打乱，这种现象称为心肌混乱(myocardialdisarray)。hcm也造成心脏电学功能的破坏。hcm最常见地归因于9个肌节基因之一发生突变，该突变导致肌节中的蛋白质突变。肌球蛋白重链突变与家族性肥大型心肌病的发展相关联。肥大型心肌病通常以常染色体显性特征遗传，有关于其在以下基因中突变的报道：心脏肌钙蛋白t(tnnt2)；肌球蛋白重链(myh7)；原肌球蛋白1(tpm1)；肌球蛋白结合蛋白c(mybpc3)；5′-amp-活化的蛋白激酶亚基γ-2(prkag2)；3型肌钙蛋白i(tnni3)；肌联蛋白(ttn)；肌球蛋白，轻链2(myl2)；肌动蛋白，α心肌1(actc1)；以及心脏lim蛋白(csrp3)。在编码血管紧张素转化酶(ace)的基因中的插入/缺失多态性改变了该疾病的临床表型。ace的d/d(缺失/缺失)基因型与更显著的左心室肥大相关联，并且可能与不良结果的较高风险相关联。

蒽环类抗生素诱导的心脏中毒(和对蒽环类抗生素诱导的毒性的耐受性)。蒽环类抗生素(如多柔比星)是用于治疗白血病、霍奇金淋巴瘤以及乳腺、膀胱、胃、肺、卵巢、甲状腺和肌肉以及其它器官的实体瘤的一线化疗剂。蒽环类抗生素的主要副作用是心脏中毒，对于很多接受采用这种化疗剂的方案的受者而言，其导致严重的心力衰竭。

心律失常性右心室发育不良(arvd)。arvd是心脏桥粒的常染色体显性疾病，其会导致右心室心律失常以及心脏性猝死。这是仅仅排在肥大型心肌病之后的造成年轻人心脏性猝死的第二大主要原因。

左心室致密化不全(lvnc，又名非致密化心肌病)。lvnc是遗传性心脏病，其由在胚胎发生期间心肌膜(心肌)发育损伤引起。带有导致lvnc的突变的患者在生命的早期发生心力衰竭和有不正常的心脏电生理特性。

左心室双入口(dilv)。dilv是先天性心脏缺陷，其中左右心房都输送进入左心室。结果是，天生带有这种缺陷的儿童仅仅有一个有功能的心室，并且难于将氧合的血泵送进入全身循环。

长qt(1型)综合征(lqt-1，kcnq1突变)。长qt综合征(lqt)是遗传性心律失常疾病，其中心电图的qt阶段被延长，导致对心律失常和心脏性猝死的易感性增加。有13种已知的基因与lqt相关。

“多能性”和多能干细胞表示这样的细胞具有分化成生物体中所有类型细胞的能力。术语“诱导的多能干细胞”包括多能细胞，像胚胎干细胞(es)，所述多能细胞能够长时间培养，并且同时保持分化成生物体中所有类型细胞的能力，但是与es细胞(es细胞衍生自胚泡的内细胞群)不同的是，所述多能细胞衍生自经分化的体细胞，即所述多能细胞具有更缩小、更限定的潜力，并且在没有实验操作的情况下不能产生生物体中所有类型的细胞。ips细胞具有hesc-样的形态，以具有更高细胞核-胞质比、确定的边界和显著细胞核的平板群落生长。另外，ips细胞能够表达本领域普通技术人员已知的一种或多种关键的多能性标记物，包括但不限于碱性磷酸酶、ssea3、ssea4、sox2、oct3/4、nanog、tra160、tra181、tdgf1、dnmt3b、foxd3、gdf3、cyp26a1、tert和zfp42。另外，ips细胞能够形成畸胎瘤。另外，它们能够形成活生物体中的外胚层、中胚层或内胚层组织，或对于形成活生物体中的外胚层、中胚层或内胚层组织起作用。

本文使用“重编程因子”是指一种或多种生物活性因子(例如生物活性因子混合物)，其作用在细胞上以改变转录，从而使细胞重编程为多潜能性(multipotency)或多能性(pluripotency)细胞。可以向细胞提供重编程因子，所述细胞例如来自具有感兴趣心脏病的家族史或遗传组成的个体的细胞，例如成纤维细胞、脂肪细胞等，该因子能够单独提供或以重编程因子的单一组合物(即预先混合的组合物)来提供。可以相同的摩尔比或不同的摩尔比来提供该因子。可以在培养本发明的细胞的过程中一次或多次提供该因子。在一些实施方式中，重编程因子是转录因子，包括但不限于oct3/4、sox2、klf4、c-myc、nanog和lin-28。

如上所述使体细胞与重编程因子接触，所述重编程因子以组合形式提供，并且其量足以使所述细胞重编程为多能性细胞。可向体细胞提供单独的或单一组合物(即重编程因子的预混组合物)形式的重编程因子。在一些实施方式中，以载体上的多种编码序列的形式提供重编程因子。

可以为了多种目的向体细胞或体细胞衍生的ips细胞中导入基因，例如为了取代具有功能缺失突变的基因、提供标记基因等。或者，可引入表达反义mrna或核酶的载体，从而阻断不需要的基因的表达。基因治疗的其他方法是引入药物抗性基因以使正常祖细胞具有优势并经受选择压力，所述药物抗性基因例如多重耐药基因(mdr)或抗凋亡基因如bcl-2。本领域已知的各种技术可用于将核酸引入靶细胞，所述技术例如上述的电穿孔、钙沉淀dna、融合、转染、脂质体转染、感染等。dna引入的具体方法对实施本发明不重要。

ips细胞分化为心肌细胞。对骨形态发生蛋白(bmp)信号传导的抑制可能导致心脏肌细胞(或心肌细胞)的产生，例如，参见yuasa等，(2005)，nat.biotechnol.，23(5)：607-11。因此，在一个示例性实施方式中，在允许形成胚体之前，在头蛋白存在的情况下培养诱导的细胞约2天-约6天，例如约2天、约3天、约4天、约5天或约6天，并且培养胚体约1周-约4周，例如，约1周、约2周、约3周或约4周。

能够通过在培养基中包含心性剂(cardiotropicagent)来促进心肌细胞分化，所述心性剂如活化素a和/或骨形态发生蛋白-4(参见本文实施例，xu等，regenmed.2011年1月；6(1)：53-66；mignone等，circj.201074(12)：2517-26；takei等，amjphysiolheartcircphysiol.2009296(6)：h1793-803，所述各文献皆通过引用明确纳入本文)。此类方案的例子还包括，例如可任选地在细胞因子(如bmp4、vegf和活化素a)存在的情况下加入wnt激动剂，如wnt3a；然后在wnt拮抗剂(如可溶的卷曲蛋白)存在的情况下培养。然而，可以使用任意合适的诱导心肌细胞分化的方法，例如fujiwara等，plosone.20116(2)：e16734；dambrot等，biochemj.2011434(1)：25-35所述的环孢菌素a；foldes等，jmolcellcardiol.201150(2)：367-76所述的等轴周期性拉伸(equiaxialcyclicstretch)、血管紧张素ii和苯肾上腺素(pe)；wang等，scichinalifesci.201053(5)：581-9所述的抗坏血酸、二甲亚砜和5-氮杂-2′-脱氧胞苷，chen等，jcellbiochem.2010111(1)：29-39所述的内皮细胞等，所述各文献皆通过引用明确纳入本文。

在合适的发育阶段收获细胞，这可以根据标记物的表达和需要的细胞类型的表型特征来确定，例如约1-4周。可以通过对感兴趣的标志物的存在进行染色、通过形态学测定来实验性地测试培养物。可任选地在通过药物选择、淘选、密度梯度离心等的正选择步骤之前或之后富集细胞。在另一个实施方式中，实施负选择，其中所述选择基于es细胞、成纤维细胞、表皮细胞等上发现的一种或多种标志物的表达。选择可以采用淘选方法、磁性颗粒选择、颗粒分选选择等。

心肌细胞。在哺乳动物心脏发育中出现的心肌细胞的表型能够分为：原代心肌细胞、节点心肌细胞(nodalcardiomyocyte)、传导心肌细胞(conductingcardiomyocyte)和工作心肌细胞。使所有具有肌节和肌浆网(sr)的心肌细胞通过间隙连接偶联并且展现出自律性。原始心管(hearttube)的细胞的特征为高度自律性、低传导速度、低收缩性和低sr活性。这种表型主要在节点细胞中持续存在。相反，心房和心室的工作心肌细胞实际上没有展现出自律性，并且在细胞间良好偶联，具有良好发育的肌节并且具有高sr活性。来自房室束、束支和外周心室传导系统的传导细胞具有发育不良的肌节、低sr活性，但是细胞良好偶联并且展现出高自律性。

对于α-mhc、β-mhc和心脏肌钙蛋白i以及慢骨骼肌肌钙蛋白i，在分化的es细胞培养中已经观察到发育转变。通常使用mlc2v和anf的表达来分别划分es细胞培养中的心室样细胞和心房样细胞，虽然在esdc中，anf表达并不能排他性地鉴定心房心肌细胞，并且可以用作工作心肌细胞的通用标记物。

“心肌细胞前体”被定义为能够产生后代的细胞，所述后代包含心肌细胞。

除了用作在体外培养的细胞的各种用途以外，可以在合适的动物模型中测试心肌细胞。在一个水平上，评估细胞在体内存活和维持它们的表型的能力。向免疫缺陷的动物(如裸小鼠，或化学产生或通过辐射产生的免疫缺陷动物)给予细胞组合物。在一段时间的再生长之后收获组织，并且评估经给予的细胞或其后代是否还存在，并且可以根据对于感兴趣处理的反应来进行表型分析。也能够通过评估用本发明分化细胞处理之后的心脏恢复程度来确定在动物模型中的适宜性。能够得到多种动物模型以用于此类测试。例如，能够通过将预先冷却的铝棒与前左心室壁的表面接触来冷冻损伤心脏(murry等，j.clin.invest.98：2209，1996；reinecke等，circulation100：193，1999；美国专利号6,099,832)。在大型动物中，能够通过将液体n2中冷却的30-50mm铜盘探针放置在左心室前壁上约20分钟来施加冷冻损伤(chiu等，ann.thorac.surg.60：12，1995)。能够通过绑扎左冠状动脉主干来诱导梗塞(li等，j.clin.invest.100：1991，1997)。用本发明的细胞制剂来处理受伤处，并且通过在损伤区域中细胞的存在的组织学分析来检测心脏组织。能够通过测定参数(如左心室末端舒张压、发展压、压力升高速率、压力降低速率等)来监测心脏功能。

本文所用术语“疗法”、“治疗”、“处理”等通常指获得所需的药理学和/或生理学作用。从完全或部分防止疾病或其症状方面来说，这种作用可以是预防性的，和/或从部分或完全稳定或治愈疾病和/或由该疾病产生的不良影响来说，这种作用可以是治疗性的。本文所用术语“治疗”包括在哺乳动物(特别是人)中进行的任何疾病治疗，包括：(a)在可能易患该疾病或症状但尚未诊断患有的对象中防止该疾病或症状的发生；(b)抑制所述疾病症状，即阻滞其发展；或(c)缓解所述疾病症状，即引起该疾病或症状消退。

术语“个体”、“对象”、“宿主”和“患者”在本文中互换使用，指任何需要诊断、处理或治疗的哺乳动物对象，尤其是人。

发明方法

提供了获得和应用疾病相关心肌细胞的体外细胞培养物的方法，其中如上所述，从包含编码心脏病相关突变的至少一种等位基因的诱导性人多能干细胞(ips细胞)分化心肌细胞。感兴趣的特定突变包括但不限于：myh7r663h突变，tnnt2r173w；pkp22013delc突变；pkp2q617x突变；和kcnq1g269s错义突变。在一些实施方式中，提供了一组这样的心肌细胞，其中该组包括两种或更多种不同的疾病相关性心肌细胞。在一些实施方式中，提供了一组这样的心肌细胞，其中该心肌细胞经受多种候选试剂，或候选试剂的多个剂量。候选试剂包括小分子，例如增加或减少感兴趣的rna表达、电学变化等的药物、基因构建体。

提供了用于测定候选试剂对疾病相关心肌细胞的活性的方法，该方法包括：使候选试剂与一种或一组分化自诱导性人多能干细胞(ips细胞)的心肌细胞接触，所述多能干细胞包含编码心脏病相关突变的至少一种等位基因；和测定该试剂对于形态学参数、遗传参数或功能参数的影响，所述参数包括但不限于：钙瞬变幅度、细胞内ca²⁺水平、细胞尺寸收缩力的产生、搏动速率、肌节α-辅肌动蛋白分布和基因表达谱。

在所述疾病是dcm的情况中，可以在与候选试剂接触之前、之中或之后通过正性肌力压力(如β-肾上腺素激动剂)来刺激心肌细胞。在一些实施方式中，所述β-肾上腺素激动剂是去甲肾上腺素。本文显示dmc心肌细胞具有响应正性肌力压力的初始正性变时作用，其之后变成以衰竭为特征的负性作用，所述衰竭特征如搏动速率减小，收缩减弱和具有异常肌节α-辅肌动蛋白分布的细胞显著增多。β-肾上腺素阻断剂处理和肌浆网ca²⁺atp酶(serca2a)的过表达改善所述功能。dcm心肌细胞也可以用通路中的遗传物质来测试，所述遗传物质包括促进心脏发生的因子、整联蛋白和细胞骨架信号传导以及泛素化通路，如表8所示。相比相同家族组群中的对照健康个体，dcm心肌细胞展现出减小的钙瞬变幅度、减弱的收缩和异常肌节α-辅肌动蛋白分布。

在所述疾病是hcm的情况中，可以在与候选试剂接触前、中或后通过正性肌力压力(如β-肾上腺素激动剂)来刺激心肌细胞。在种情况下，hcm心肌细胞展现出较高的肥大反应，这能够通过β-肾上腺素阻断剂来逆转。相比健康个体，hcm心肌细胞展现出细胞大小增大和hcm相关基因的上调，以及较不规律的收缩(以不完全搏动为特征)，包括较高频率的异常ca²⁺瞬变(以次级不完全瞬变(secondaryimmaturetransient)为特征)。这些心肌细胞的细胞内ca²⁺水平升高，并且在一些实施方式中，靶向钙依赖磷酸酶或其它与钙粘附相关靶标的候选试剂。

在用于小分子的筛选试验中，用一组细胞和细胞环境来测试向培养中的细胞添加候选试剂的效果，其中所述细胞环境包括以下的一种或多种：包括电离度改变的电刺激、药物刺激等，并且其中细胞组可以在基因型方面、在预先暴露于感兴趣环境方面、在提供的试剂剂量方面不同，其中通常包含至少一个对照，例如阴性对照和阳性对照。通常在无菌环境中实施细胞的培养，例如，在37℃下在含有92-95％湿润空气/5-8％co2气氛的培养箱中。可以在含有非限定生物液体(如胎牛血清)的营养混合物中，或在完全限定且不含血清的培养基中进行细胞培养。环境变化的影响通过监测多个输出参数(包括形态学变化、功能变化和遗传变化)来评估。

在遗传物质的筛选试验中，向组中的一种或多种细胞添加多核苷酸来改变所述细胞的遗传组成。监测输出参数来确定表型是否变化。通过这种方式，鉴定编码感兴趣通路中的蛋白质或影响所述蛋白质表达的遗传序列。可将所得结果输入数据处理器中一得到筛选结果数据库。使用算法来比较和分析在不同条件下得到的筛选结果。

用于分析的方法包括钙成像法，其中用合适染料处理细胞，并且在感兴趣的条件下使细胞暴露于钙，并用例如共焦显微镜来成像。可以对ca²⁺反应定量，并且然后针对连续ca²⁺瞬变节律的不规则性和每次瞬变中总ca²⁺流入来分析时间依赖性的ca²⁺反应。通过对各波之下相对于基线的面积进行积分来测定每次瞬变中的总ca²⁺释放。

能够使用原子力显微镜(afm)来测量收缩力。通过afm使用悬臂来研究搏动细胞。为了测量力，用悬臂尖端轻触细胞，然后使悬臂尖端保持在位置上供于间隔，同时收集偏离数据。能够计算力、搏动之间的间隔和各细胞每次收缩的时程的统计数据。

还能够通过微电极阵列(mea)来分析细胞，其中将搏动心肌细胞置于mea探针上，并且测量和确定场电位时程(fpd)来提供电生理参数。

人们对单细胞水平的分析方法特别感兴趣，例如上述的：原子力显微镜、微电极阵列记录、膜片钳、单细胞pcr、钙成像和流式细胞术等。

参数是高通量系统中细胞的可理想地定量的组分，尤其是可精确测量的组分。参数也能够是任何细胞组分或细胞产物，包括细胞表面决定簇、受体、蛋白质或者其构象或翻译后修饰、脂质、碳水化合物、有机或无机分子、核酸(如mrna、dna等)、或源自此类细胞组分的部分或其组合。虽然大多数参数会提供定量读数，在一些情况中可接受半定量或定性结果。读数可包括单一确定值，或可包括均值、中值或方差等。预期会有差异，因而使用用于提供单一值的常见统计方法的标准统计方法获得各组测试参数的数值范围。

感兴趣的参数包括胞质、细胞表面或分泌的生物分子、常见生物聚合物例如多肽、多糖、多核苷酸、脂质等的检测。细胞表面和分泌的分子是优选的参数类型，这是因为这些分子介导细胞通讯和细胞效应物反应并且能够更易于测定。在一个实施方式中，参数包括特定表位。通常使用特异性单克隆抗体或受体探针来鉴定表位。在一些情况下，包含表位的分子实体来自两种或更多种物质并且包含确定的结构；例子包括与异二聚体整联蛋白相关的组合决定表位。参数可以是对特定修饰的蛋白质或寡糖的检测。可以通过特异性单克隆抗体或配体或受体结合决定簇来限定参数。

感兴趣的候选试剂是生物活性试剂，其涵盖许多化学种类，主要是有机分子，其可包括有机金属分子、无机分子、遗传序列等。本发明的一个重要方面是以优选的生物反应功能来评价候选药物、选择治疗性抗体和基于蛋白质的疗法。候选试剂包含与蛋白质发生结构相互作用(特别是形成氢键)的必要官能团，且通常至少包含至少一个胺、羰基、羟基或羧基基团，常常包含至少两种化学官能团。所述候选试剂常包含环状碳或杂环结构，和/或用一个或多个上述官能团取代的芳香结构或多芳香结构。候选试剂也可以选自生物分子，包括肽、多核苷酸、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶，其衍生物、结构类似物或组合。

包括药学上的活性药物、遗传活性分子等。感兴趣的化合物包括化疗剂、消炎剂、激素或激素拮抗剂、离子通道改性剂和神经活性剂。适于本发明的药剂示例是在“《治疗的药理学基础》(thepharmacologicalbasisoftherapeutics)”(goodman和gilman，麦格劳希尔公司(mcgraw-hill)，纽约州纽约，(1996)第9版)中，以下章节中所述的那些：在突触和神经效应器连接位点的药物作用；心血管药物；维生素，皮肤病学；以及毒理学，其全文通过引用纳入本文。

测试的化合物包括上述分子的所述类型，并且可能还包含未知含量的样品。感兴趣的是源自天然来源(如植物)的天然产生的化合物的复杂混合物。虽然很多样品会包含溶液中的化合物，但是也可以测试能够在合适溶剂中溶解的固体样品。感兴趣的样品包括环境样品，例如地下水、海水、采矿废水等；生物样品，例如来自作物、组织样品的裂解物等；制造样品，例如在药品制备中的时程；以及制备以供分析的化合物文库等。感兴趣的样品包括评估潜在治疗价值的化合物，例如药物候选物。

术语样品也包括上述的已经添加额外组分的流体，所述组分例如影响离子强度、ph、总蛋白浓度等的组分。另外，可以处理样品来实现至少部分分馏或浓缩。如果要减少(如在氮气下、冷冻或其组合条件下)的化合物降解，可以保存生物样品。使用的样品的体积足够允许进行可测量的检测，通常约0.1∶1-1ml的生物样品是足够的。

可从多种来源(包括合成或天然化合物文库)来获得化合物，包括候选试剂。例如，可用许多方法随机和定向合成包括生物分子在内的各种有机化合物，所述方法包括表达随机寡核苷酸和寡肽。或者，在氮气下、冷冻或其组合条件下细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库。此外，天然或合成产生的文库和化合物容易通过常规的化学、物理和生化方法修饰，且可用于生产组合文库。已知的药剂可进行定向或随机的化学修饰如酰化、烷化、酯化、胺化等以产生结构类似物。

本文使用的术语“遗传物质”是指多核苷酸或其类似物，通过向细胞加入遗传物质以在本发明的筛选试验中测试该试剂。遗传物质的引入导致细胞的总遗传组成的变化。遗传物质(诸如dna)可导致在细胞的基因组中实验性引入变化，所述变化通常通过将序列整合进入染色体中而发生。遗传变化也可以是暂时的，其中外源序列未被整合而是保持为附加体。遗传物质(如反义寡核苷酸)也能够通过mrna的转录或反义来干扰蛋白质的表达而不改变细胞的基因型。遗传物质的影响是增加或减少细胞中一种或多种基因产物的表达。

能够采用引入编码多肽的表达载体以在缺少该序列的细胞中表达编码的产物，或过表达该产物。能够使用组成型或受外部调节的各种启动子，在受外部调节的情况中，能够打开或关闭基因的转录。这些编码序列可以全长的cdna或基因组克隆、其衍生的片段或使天然产生序列与其它编码序列的功能性或结构性结构域结合的嵌合体。另外，引入的序列可以编码反义序列；可以是反义寡核苷酸；rnai，编码天然序列的显性阴性突变，或显性或组成性活性突变；改变的调节序列等。

能够通过本领域已知的方法化学合成反义和rnai寡核苷酸。优选的寡核苷酸从天然磷酸二酯结构中化学修饰，从而增加其细胞内稳定性和结合亲和性。已在文献中描述了一些此类修饰，所述修饰改变主链、糖或杂环碱基的化学性质。主链化学性质中的有用改变为硫代磷酸酯；两个非桥连氧都用硫取代的二硫代磷酸酯；亚磷酰胺；烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯。非手性磷酸酯衍生物包括3′-o′-5′-s-硫代磷酸酯、3′-s-5′-o-硫代磷酸酯、3′-ch2-5′-o-膦酸酯和3′-nh-5′-o-氨基磷酸酯。肽核酸用肽键替代完整核糖磷酸二酯主链。还使用糖修饰来增强稳定性和亲和性，例如吗啉代寡核苷酸类似物。可使用脱氧核醣的-端基异构体，其中碱基相对天然的-端基异构体倒转。可改变核糖的2′-oh以形成2′-o-甲基或2′-o-烯丙基糖，其提供对降解的抗性而不影响亲和性。

在一种或多种环境条件下，通过向至少一种细胞并且通常向多种细胞中添加试剂，从而根据生物活性来筛选试剂，所述条件例如在用β-肾上腺素激动剂刺激之后、在电学刺激或机械刺激之后等。对响应试剂的参数读出值的变化进行测量，依照所需进行标准化，并且然后通过与参比筛选结果比较来评估所得的筛选结果，所述参比筛选结果例如具有感兴趣的其它突变的细胞、正常心肌细胞、源自其它家族成员的心肌细胞等。所述参比筛选结果可以包括在不同环境变化存在或不存在下的读出值、用其它试剂得到的筛选结果，其可以包括或不包括已知的药物等。

所述试剂可在溶液中或以易溶解的形式方便地添加到培养的细胞培养基中。所述试剂可作为间歇或连续的流加入到流通式系统中，或者将一团化合物单一或递增地加入静态溶液中。在流通式系统中，使用两种流体，其中一种是生理中性溶液，另一种是与添加测试化合物相同的溶液。第一种流体通过细胞，然后是第二种。在单一溶液方法中，向细胞周围的培养基体积中添加测试化合物团。所述团块添加后或流通式方法中的两种溶液之间，培养基组分的总浓度不应发生显著变化。

优选的试剂制剂不包含可能对整体制剂有显著影响的其他组分，如防腐剂。因此优选的制剂基本由生物活性化合物和生理学上可接受的运载体(如水、乙醇、dmso等)组成。然而，如果化合物是不含溶剂的液体，制剂可以基本由化合物本身组成。

用不同的试剂浓度平行进行多种试验，以获得对不同浓度的差异反应。如本领域所知，测定试剂的有效浓度通常使用的浓度范围来自1∶10或其它对数级别的稀释液。如需要，所述浓度还可用第二稀释系列来细化。通常，这些浓度之一用作阴性对照，如零浓度或低于试剂检测水平或者处于或低于不产生可检测的表型变化的试剂浓度。

能够采用各种方法来对除上述功能性参数以外的所选的参数的存在定量。对于存在的分子的量的检测而言，方便的方法是用可检测部分来标记分子，所述可检测部分可以是荧光的、发光的、放射性的、酶活性的部分等，尤其是以高亲和力结合所述参数的特异性分子。荧光部分易于标记几乎任意的生物分子、结构或细胞类型。免疫荧光部分不仅能导向性地结合特定蛋白质，还能导向性地结合特定构象、切割产物或位点修饰(诸如磷酸化)。可将单独的肽和蛋白质工程改造为自发荧光，例如通过在细胞内将它们表达为绿色荧光蛋白嵌合体(综述可参见jones等，(1999)trendsbiotechnol.17(12)：477-81)。因此，能够遗传修饰抗体来提供作为其结构的部分的荧光染料。

根据选择的标签，可以使用除了荧光标签以外的方式来测量参数，所述方式例如免疫试验技术如放射性免疫试验(ria)或酶联免疫吸附试验(elisa)、均相酶免疫试验和相关的非酶技术。这些技术采用特异性抗体作为报告分子，由于其与单个分子靶标连接的高度特异性，它们特别有用。美国专利号4,568,649描述了采用闪烁计数的配体检测系统。这些技术对蛋白质或修饰的蛋白质参数或表位或糖决定簇特别有用。能够使用荧光或另外加标签的报告分子来得到蛋白质和其它细胞决定子的细胞读出值。基于细胞的elisa或相关的非酶促方法或基于荧光的方法使得能够测量细胞表面参数和分泌参数。捕获elisa和相关非酶促方法通常采用两种特异性抗体或报告分子，并且可用于测量溶液中的参数。流式细胞术方法可用于测量细胞表面和细胞内的参数，以及形状变化和粒度，并且可用于分析用作抗体连接试剂或探针连接试剂的珠。来自此类试验的读出值可以是与单一荧光抗体检测的细胞表面分子或细胞因子相关的平均荧光，或平均荧光强度、中值荧光强度、荧光强度的方差或其之间的一些关系。

在本领域中使用单细胞多参数和多细胞多参数的多重试验，其中通过对定量的成像、荧光和共聚焦显微镜来鉴定输入的细胞类型并读取参数，见《共聚焦显微镜方法和方案》(confocalmicroscopymethodsandprotocols)，(分子生物学方法第122卷)，paddock编，胡马纳(humana)出版公司，1998。这些方法在1999年11月23日授予的美国专利号5,989,833中描述。

核酸(尤其是信使rna)的定量也是人们感兴趣的参数。这些可以通过根据核酸核苷酸的序列的杂交技术来测量。技术包括聚合酶链反应方法和基因阵列技术。参见例如，ausubel等编的《分子生物学试验指南》(currentprotocolsinmolecularbiology)，约翰韦利森公司(johnwiley&sons)，纽约州纽约，2000；freeman等，(1999)biotechniques26(1)：112-225；kawamoto等，(1999)genomeres9(12)：1305-12；和chen等，(1998)genomics51(3)：313-24。

通过使用合适的推断方法(deductionprotocol)、ai系统、统计学比较等完成从测试化合物得到的筛选结果与参比筛选结果的比较。优选地，使筛选结果与参比筛选结果的数据库作比较。能够汇编参比筛选结果的数据库。这些数据库可以包括来自含有已知试剂或试剂组合的组的参比结果，以及来自对在环境条件下处理的细胞进行分析的参比，在该环境条件下，去除或特定改变了单一或多重环境条件或参数。参比结果也可以产生自含有基因构建物的细胞的组，所述基因构建物特异性靶向或调控特定细胞通路。

读出值可以是平均、均值、中值或方差或其他与测量相关的统计学或数学数值。参数读出值信息还可以通过与相应的参比读出值的直接比较来改善。在相同条件下得带的各参数的绝对值会展现出活生物系统中固有的差异并且也反映了个体细胞差异和个体之间的固有差异。

方便起见，本发明的系统可以试剂盒形式提供。该试剂盒可以包括待使用的细胞，用于测量参数的试剂和用于制得筛选结果的软件，所述细胞可以经冷冻、经冷藏或以一些其它方式处理以维持活性。所述软件会接收结果并进行分析，并且能够包括参比数据。所述软件还能使结果针对来自对照培养物的结果进行标准化。所述组合物可任选地被包装在合适容器中，所述容器具有针对所需目的(如筛选方法等)的书面说明书。

为了进一步详述本发明的实践中有用的一般技术，操作人员能够参考标准教科书并且回顾细胞生物学、组织培养、胚胎学和心血管生理学。对于组织培养和胚胎干细胞，读者可以希望参考《畸胎癌和胚胎干细胞：实践方法》(teratocarcinomasandembryonicstemcells：apracticalapproach)(e.j.robertson编，irl出版有限公司，1987)；《小鼠发育技术指南》(guidetotechniquesinmousedevelopment)(p.m.wasserman等编，学术出版社，1993)；胚胎干细胞体外分化(embryonicstemcelldifferentiationinvitro)(m.v.wiles，meth.enzymol.225：900，1993)；胚胎干细胞的性质和应用：应用于人生物学和基因治疗的前景(propertiesandusesofembryonicstemcells：prospectsforapplicationtohumanbiologyandgenetherapy)(p.d.rathjen等，reprod.fertil.dev.10：31，1998)。对于心脏细胞培养，标准参考文献包括《培养中的心脏细胞》(theheartcellinculture)(a.pinson编，crc出版社，1987)，《分离的成人心肌细胞》(isolatedadultcardiomyocytes)(卷i和ii，piper和isenberg编，crc出版社，1989)，《心脏发育》(heartdevelopment)(harvey和rosenthal，学术出版社，1998)。

分子和细胞生物化学中的一般方法可在下列标准教科书中找到：如《分子克隆：实验室手册》(molecularcloning：alaboratorymanual)第三版(sambrook等，港实验室出版社，2001)；《分子生物学简明实验方案》(shortprotocolsinmolecularbiology)，第4版(ausubel等编，约翰韦利森公司，1999)；《蛋白方法》(proteinmethods)(bollag等，约翰韦利森公司，1996)；《基因治疗的非病毒载体》(nonviralvectorsforgenetherapy)(wagner等编，学术出版社，1999)；《病毒载体》(viralvectors)(kaplift和loewy编，学术出版社，1995)；《免疫学方法手册》(immunologymethodsmanual)(i.lefkovits编，学术出版社，1997)；和《细胞和组织培养：生物技术中的实验室方法》(cellandtissueculture：laboratoryproceduresinbiotechnology)(doyle和griffiths，约翰韦利森公司，1998)。本公开中提及的用于遗传操作的试剂、克隆载体和试剂盒可购自商品供应商，如伯乐公司(biorad)、斯查塔基公司(stratagene)、英杰公司(invitrogen)、西格玛-奥德里奇公司(sigma-aldrich)和克隆泰克公司(clontech)。

在说明书中引用的各出版物在此通过引用全文纳入本文用于全部目的。

应理解本发明不限于所述特定方法、方案、细胞系、动物种或属以及试剂，因为这些可能会有变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是为了描述具体实施方式，不意在限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。

如本文中所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代形式，除非文中另有明确说明。因此，例如，提到“一个细胞”包括多个这样的细胞，提到“培养”包括本领域技术人员已知的一种或多种培养及其等同物，等等。除非另有明确说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。

提供以下实施例的目的是向本领域普通技术人员完整地公开和描述如何制备和使用本发明，这些实施例不意在限制发明人认为的发明范围，也不代表下述实验是所进行的所有或仅有的实验。努力保证所用数值(如量、温度等)的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重量均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。

实施例

实施例1

扩张型心肌病(dcm)是最常见的心肌病，其特征为心室扩张、收缩障碍和进行性心力衰竭。dcm是导致心脏移植的最常见诊断结论，并且对全世界的健康护理施加大量负担。在此我们从源自dcm家族患者的ipsc产生心肌细胞(cm)，所述dcm家族患者在编码肌节蛋白心脏肌钙蛋白t的基因中携带点突变(r173w)。相比在相同家族组中的对照健康个体，dcmipsc-cm展现出钙瞬变幅度减小、收缩减弱和异常肌节α-辅肌动蛋白分布。当用β-肾上腺素激动剂刺激时，dcmipsc-cm显示出衰竭的特征，如搏动速率减小、收缩减弱和具有异常肌节α-辅肌动蛋白分布的细胞明显增多。β-肾上腺素阻断剂处理和肌浆网ca²⁺atp酶(serca2a)的过表达改善了dcmipsc-cm的功能。我们的研究证明人dcmipsc-cm概括了疾病的形态和功能上的表型，因此作为探索分子和细胞机制以及优化该特定疾病的治疗的有用平台。

我们募集了来自dcm先证者的7个个体的组群，所述dcm先证者在tnnt2基因的外显子12上携带常染色体显性点突变，这导致在蛋白ctnt中氨基酸位置173处的精氨酸(r)突变成色氨酸(w)。通过对17种原发性dcm相关基因的组进行遗传筛选(表1)和遗传共分离研究(表2)确证该特定点突变的dcm致病作用。据报道，在完全独立的比利时家族中也有这个突变。这7个募集的个体涵盖了3代人(i、ii和iii)(图1a)。通过pcr扩增tnnt2的基因组基因座和dna测序证明了4名患者(ia、iia、iib和iiia)在两个等位基因中的一个上携带tnnt2r173w突变，而确证其他3个个体(ib、iic和iiib)为正常个体并且用作后续研究的对照(图1b)。所有4名携带特定r173w突变的患者显示左心室扩张和射血分数降低的临床dcm症状，并且被医学治疗(表2)。一名14岁的疾病患者(iiia)由于具有严重的临床症状而接受了原位心脏移植。通过对该特定患者iiia采用32种最新dcm相关基因的组的外显子组测序的进一步遗传筛选没有发现与所述疾病相关联的任何其它额外的变体(表3)。

为了产生所述7个个体的患者特异性ipsc，从取自每个个体的皮肤活检中扩增皮肤成纤维细胞(图1c)，并且在无饲养层条件下用慢病毒yamanaka4因子(oct4、sox2、klf4和c-myc)使所述细胞重编程。挑取tra-1-60⁺染色且具有人胚胎干细胞(hesc)样形态的集落(图1d和1e)，对其扩增并建立成个体ipsc细胞系。对于每个个体，建立3-4个ipsc细胞系用于后续分析。通过基因组pcr和dna测序确证所有的dcmipsc细胞系都含有特定的r173w突变(图5)。所有建立的ipsc细胞系都表达多能性标志物oct4、nanog、tra-1-81和ssea-4，并且呈碱性磷酸酶阳性(图1f)。微阵列分析表明这些ipsc细胞系与亲本皮肤成纤维细胞不同，其表达与hesc更相似的全基因模式(图6)。定量亚硫酸氢盐测序显示在所有测试的ipsc细胞系中，oct4和nanog的启动子区域被低甲基化，这表明多能基因的活性转录(图1g)。在扩增传代之后，已经建立的ipsc细胞系维持正常的核型(图7)，并且它们中的大多数显示外源转基因的沉默和内源nanog的再表达(图8)。后续研究除去了具有不完全转基因沉默的ipsc细胞系。这些患者特异性ipsc能够在体外分化成所有三种胚层的细胞(图9)，并且在注射进入免疫缺陷小鼠的肾小囊之后形成畸胎瘤(图1h)。

我们之后用成熟建立的3d分化方案使dcmipsc分化成心血管谱系，该方案由yang，l.等开发，发育自kdr+胚胎干细胞源性群的人心血管祖细胞(humancardiovascularprogenitorcellsdevelopfromakdr+embryonic-stem-cell-derivedpopulation).nature453，524-528(2008)。选择来自每个个体的两种ipsc细胞系来分化成自发搏动拟胚体(eb)。早在分化后第8天就观察到自发搏动。向心脏谱系分化的效率在不同细胞系之间不同(图10)。衍生自对照和患者ipsc的搏动eb含有约50-60％ctnt阳性cm(图11)。衍生自3名dcm患者的3个ipsc克隆的搏动eb的等位基因特异性pcr表明野生型和突变体(r173w)tnnt2基因的双等位表达(图12)。将来自对照ipsc和dcmipsc的搏动eb接种在多重电极阵列(mea)探针上(图13a)，并且记录它们的电生理学性质(图13b)。对照(n＝45)和dcm(n＝57)ipsc-衍生的搏动eb都显示在基线上搏动频率、场电位、峰电位间隔和场电位时程(fpd)相当(表4和图13c)。

我们之后将搏动eb分离为小搏动簇(beatingcluster)以及单个搏动cm，以供进一步分析。对对照(n＝24)和dcm(n＝24)ipsc-cm采用微流体技术进行的单细胞pcr分析表明所选心脏相关转录因子、肌节蛋白和离子通道的基因表达没有显著差异(图14)。我们下一步通过免疫细胞化学法来评估ipsc-cm中肌原纤维的组织。对照和dcmipsc-cm都表达肌节蛋白ctnt、肌节α-辅肌动蛋白和肌球蛋白轻链2a(mlc2a)，以及心脏标志物间隙连接蛋白43(图15)。然而，相比在分化后第30天的对照ipsc-cm(n＝368)，明显较高百分比的dcmipsc-cm(n＝391)显示出在多于四分之一的总细胞面积上有肌节α-辅肌动蛋白的点状分布(p＝0.008)(图2a、2b和图16)。在这一阶段，对照和dcmipsc-cm之间没有显著的细胞尺寸差异(图2c)。在各来自4名dcm患者的两种不同的dcmipsc细胞系中一致观察到该现象，表明与疾病致病r173w突变的同质相关性。显然，具有点状肌节α-辅肌动蛋白分布的cm的大多数是在搏动簇周围的单个或多个细胞。肌节α-辅肌动蛋白是肌节完整性和肌节变性的极好标志物。这些结果也表明个体dcmipsc-cm具有在维持肌节完整性中发生故障的较高倾向。

正性肌力压力能够在dcm的转基因小鼠模型中诱导dcm表型，并且使临床患者疾病恶化。我们之后检测采用正性肌力压力试剂(如β-肾上腺素激动剂)的处理是否能够加快dcmipsc-cm的表型反应。实际上，如mea记录所显示，采用10μm的去甲肾上腺素(ne)处理诱导了正性变时作用，其之后变为负性作用，最终导致dcmipsc-衍生的搏动eb(n＝14)中自发收缩的失败。相反，对照ipsc-衍生的搏动eb(n＝14)展现出延长的正性变时活性(图2d)。一周的ne处理显著增加了来自dcmipsc克隆的，具有肌节α-辅肌动蛋白分布的cm的数量，并且发现几乎90％的dcmipsc-cm具有混乱的肌节图案(图2f、2g、图17和图18)。在延长的ne处理之后，一些单个dcmipsc-cm显示肌丝的完全变性，而在对照细胞中没有观察到这种情况。追踪用由ne处理的对照和dcmipsc-cm的单个搏动簇随时间的视频成像显示出不同的结果。在dcmipsc-cm中而不是在对照ipsc-cm中观察到降低的肌力活性和变时活性(图2e，图2h)。单细胞pcr分析也揭示了在ne处理之后，在dcm(n＝16)与对照ipsc-cm(n＝16)中不同的基因表达变化(图19)。这些结果表明β-肾上腺素刺激加剧了dcmipsc-cm表型。

如膜动作电位(ap)所显示，cm收缩从肌细胞的电激发开始。为了研究dcm的可能的潜在机制，我们评估了在ctnt中dcm-相连的r173w突变是否影响cm的电激发。我们通过膜片钳检测了分离的单个搏动ipsc-cm的电活性。在对照和dcmipsc-cm中观察到三种类型的自发ap(心室样、心房样和节点样)(图20a)。dcm心室肌细胞(n＝17)展示出与对照(n＝18)相当的正常ap(图20b)。dcmipsc-cm的90％复极化(apd90)的平均动作电位持续时间与对照ipsc-cm中看到的没有显著差异(图20c)。两组之间的平均ap频率、峰幅度和静息电位也非常相似(图20d、20e和20f)。这些结果表明对照和dcmipsc-cm在基线的电激发活性是正常的。

为了进一步研究潜在的dcm发病机理，我们通过荧光ca²⁺成像检测了在激发-收缩偶联水平上的ca²⁺处理性能。dcmipsc-cm(n＝40)展示出与对照ipsc-cm(n＝87)相当的全[ca²⁺]i瞬变的节律性频率、节律和幅度(图3a、3b、3c、3e和3f)。然而，与对照ipsc-cm(p＝0.002)相比，dcmipsc-cm展现出明显较小的[ca²⁺]i瞬变幅度(图3d)，表明对于dcmipsc-cm的每次收缩可用的[ca²⁺]i明显较低。在所有检测的衍生自4名dcm患者的dcmipsc细胞系中，一致观察到cm的较小的[ca²⁺]i瞬变，表明在dcmipsc-cm中产生较弱的力。

收缩力产生中的缺陷是诱导dcm和心力衰竭的最重要的机制之一。为了进一步研究，我们下一步使用原子力显微镜(afm)来测量ipsc-cm的收缩力，所述原子力显微镜已经用于检测培养的鸡胚胎cm。afm允许我们在单细胞水平上探测收缩性质(图21)。与单一对照ipsc-cm(n＝13)相比，dcmipsc-cm(n＝17)显示出相似的搏动频率和持续时间，但是收缩力明显较弱(图4c、4d、图22和表5)。经afm检测，在来自每个单一细胞的细胞尺寸和收缩力之间没有相关性(图23)。

先前一种在临床前试验中研究的治疗方法已显示serca2a过表达在衰竭的人心脏中移动细胞内ca²⁺并恢复心肌细胞的收缩性，并且在动物模型中改善衰竭的心脏功能。考虑到我们的结果显示在dcmipsc-cm中有较低ca²⁺瞬变和减弱的收缩性，我们假设serca2a的过表达能够拯救dcmipsc-cm的表型。以100计的感染复数(moi)，用携带共表达gfp的serca2a的腺病毒(ad.seca2a)转导dcmipsc-cm(参见方法部分)，导致在这些细胞中serca2a的过表达(图4a)。相比仅仅采用携带gfp的腺病毒(ad.gfp)(moi100)转导的dcmipsc-cm，serca2a的过表达造成随时间的较大数量的体外自发收缩点(图24)。gfp与serca2a的共表达使我们能够识别转导的细胞并且通过afm检测收缩力(图4b)。serca2a(n＝12)的过表达使单一dcmipsc-cm的收缩力恢复至在对照ipsc-cm中观察到的相似水平(图4c、4d和表5)，但是没有改善肌节的组织性(图4g)。使用红色荧光ca²⁺指示剂rhod-2am的钙成像(图25)显示相比仅仅用ad.gfp转导的细胞(n＝14)，用共表达gfp的ad.serca2a转导的dcmipsc-cm(n＝22)具有显著增加的全[ca²⁺]i瞬变(图4e和图4f)(p＝0.04)，这与恢复的力的产生相一致。相反，在对照ipsc-cm中serca2a的过表达无法产生收缩性的统计学上的显著增加(图26)，表明对照和dcmipsc-cm之间在钙处理中的天然差异。总之，这些结果表明serca2a的过表达增加了[ca²⁺]i瞬变以及dcmipsc-cm的收缩力，并且改善了它们的功能。

虽然serca2a基因治疗现在出于临床试验阶段，但在serca2a基因治疗之后个体cm细胞反应的整体机制在先前还未被广泛研究。因此，我们开始研究该机制，其中serca2a递送恢复了dcmipsc-cm中的缺陷。在serca2a过表达之后dcmipsc-cm的基因表达谱显示191个基因(65个上调，126个下调)的表达变化超过1.5倍，并且被拯救至与对照ipsc-cm中相似的表达水平(图27a)。富集通路分析表明几种先前已知的通路(如钙信号传导、蛋白激酶a信号传导和g-蛋白偶联受体信号传导)明显参与了通过serca2a过表达来拯救dcm表型的过程。有趣的是，发现几种先前与dcm没有联系的通路(包括促心脏发生的因子、整联蛋白和细胞骨架信号传导、以及泛素化通路)也参与拯救dcmcm功能的过程(图27b和表7)。

临床研究已经表明美托洛尔，一种β1-选择性β-肾上腺素阻断剂，对于dcm患者的临床症状和血液动力学状态具有有益作用。如肌节α-辅肌动蛋白染色所示(图28a)，当用10μm美托洛尔治疗时，dcmipsc-cm显示肌节组织有所改善。美托洛尔治疗也防止由于ne处理所诱导的dcmipsc-cm的恶化(图28b)。我们在用美托洛尔处理的对照ipsc-cm中没有观察到对肌节α-辅肌动蛋白分布的显著影响(图28c)。这些结果表明β-肾上腺素通路有助于dcmipsc-cm抵抗机械恶化。

总之，我们已经从肌节蛋白ctnt中携带单点突变的dcm家族产生了患者特异性ipsc，并且从这些ipcs中衍生出cm。这已经使我们能够产生大量的dcm-特异性cm并且分析它们的功能性质、探索潜在发病机理并测试有效的治疗方法(表8)。尽管dcmipsc-cm的基线电生理学活性与对照没有明显不同，但dcmipsc-cm展现出明显较小的[ca²⁺]i瞬变和降低的收缩力。较弱的抵抗机械刺激的能力也与dcmipsc-cm相关。如肌节α-辅肌动蛋白染色所示，ne刺激诱导它们的自发收缩的停止，并且显著恶化肌节的组织性。这个tnnt2r173w突变看似仅仅影响cm的功能，而不影响来自心血管谱系的其它细胞(图29)。总之，我们的数据表明tnnt2r173w突变造成cm的力产生中的破坏，这可能是患者dcm临床表型的最终表现的主要病因(图30)。显示β-阻断剂美托洛尔能够拯救dcmipsc-cm表型。另外，serca2a的过表达，一种当前在临床试验中用于治疗心力衰竭的新型基因治疗方法，能够显著改善dcmipsc-cm的功能。基因表达概况还鉴定了几条参与serca2a拯救的新通路，包括泛素化和整联蛋白信号传导通路。总之，我们的发现证明ipsc平台打开了研究针对dcm的发病机理和治疗靶标的新的、令人激动的研究领域。

方法

患者特异性ipsc衍生、培养和表征。用于该研究的所有方案由斯坦福大学人对象研究机构审查委员会(humansubjectsresearchinstitutionalreviewboard)批准。如前述实施患者特异性ipsc细胞系的产生、维持和表征。

免疫荧光和碱性磷酸酶染色。按照生产商的说明书使用定量碱性磷酸酶es表征试剂盒(开米康公司(chemicon))实施碱性磷酸酶(ap)染色。如前所述使用合适的一抗以及alexafluor偶联的二抗(英杰公司(invitrogen))来实施免疫荧光法。在本研究中使用针对oct3/4(圣克鲁兹生物技术公司(santacruz))、sox2(白乐津公司(biolegend))、ssea-3(密理博(millipore))、ssea-4(密理博)、tra-1-60(密理博)、tra-1-81(密理博)、nanog(圣克鲁兹生物技术公司)、afp(圣克鲁兹生物技术公司)、平滑肌肌动蛋白(sma)(西格玛公司(sigma))、tui-1(科文斯公司(covance))、ctnt(热科学公司(thermoscientific))、肌节α-辅肌动蛋白(克隆ea-53，西格玛公司)、连接蛋白-43(密理博)和肌球蛋白轻链(mlc-2a)(突触系统公司(synapticsystems))的一抗。

亚硫酸氢盐焦磷酸测序。按照生产商的说明书使用zymodna甲基化试剂盒(zymo研究公司)用硫酸氢盐处理1μg的样品dna。然后将pcr产物转化为单链dna模板并且用焦磷酸测序psq96hs系统(biotage)测序。使用qcpg软件(biotage)以t/csnp单独分析各基因座的甲基化状态。

人esc和ipsc的心脏分化。使用由yang等所述的成熟建立的方案使h7esc和衍生的ipsc细胞系分化成心脏谱系。采用i型胶原酶(西格玛公司(sigma))分离搏动eb，并将其接种于明胶被覆的培养皿、腔式载玻片或盖玻片上供于功能分析。

钙成像。将解离的ipsc-cm接种在明胶被覆的4孔lab-ii腔(耐洁纽恩克国际公司(nalgene-nuncinternational)，腔#1.5德国盖玻片系统)供于钙成像。在37℃下，用内含5μmfluo-4am或rhod-2am(针对表达gfp的细胞)和0.02％普流罗尼克(pluronic)f-127(皆来自分子探针公司(molecularprobes))的tyrodes溶液(140mmnacl，5.4mmkcl，1mmmgcl2，10mm葡萄糖，1.8mmcacl2和10mmhepes，在25℃下用naoh调至ph7.4)处理细胞15分钟。然后用tyrodes溶液洗涤细胞3次。用具有63×透镜(na＝1.4)的共聚焦显微镜(卡尔蔡司公司(carlzeiss)lsm510meta)，使用zen软件进行钙成像。采用线扫描模式以1.92ms/线的取样速率在室温下获得自发ca²⁺瞬变。对于19.2s的记录总共获得10000条线。

钙成像痕迹分析。使用fiji，一种使每条线的荧光强度平均化的imagej的派生物(国立卫生研究院)来定量分析ca²⁺反应。然后使用matlab针对连续ca²⁺瞬变节律的不规则性和每次瞬变中总ca²⁺流入来分析时间依赖性的ca²⁺反应。瞬变之间的时间(节律)被定义为两个连续尖峰的峰之间的时间。通过使用matlab的信号处理工具箱计算二阶倒数的零交点来确定尖峰。通过对在每个波之下的面积相对于基线进行积分来测定在每次瞬变中的总ca²⁺释放。基线被定义为所有最小值的中值。尖峰周期和幅度的不规则性被定义为一组测量值的标准偏差(s.d.)与均值的比。

原子力显微镜(afm)。在各实验之前，将ipsc-cm接种在玻璃底的皮氏培养皿上，将培养基替换成温热tyrode溶液。使细胞在整个实验过程中维持在36℃。通过afm(mfp-3dbio，asylumresearch公司)使用氮化硅悬臂(弹簧常数约0.04n/m，budgetsensors公司)来研究搏动细胞。为了测量力，由悬臂尖端用100pn的力轻触细胞，具有100-200nm左右的典型细胞缺痕，然后悬臂尖端在没有z-压电反馈的情况下在该位置上保留多个序贯2分钟间隔，同时以2khz的取样速率收集偏移数据。在这些检测中的一般噪音约为20pn。偏移数据通过乘以弹簧常数转化为力。通常各单一细胞收集100-400次搏动，并且计算力、搏动间的间隔和各细胞每次收缩的时程的统计数据。使用双尾斯氏t检验来比较细胞间的力。

ipsc-cm的腺病毒转导。使用了携带巨细胞病毒(cmv)启动子(驱动serca2a)加单独cmv启动子(驱动gfp)的第一代5型重组腺病毒(ad.serca2a)以及仅作为对照的携带cmv启动子(驱动gfp)的腺病毒(ad.gfp)。从搏动eb分离的ipsc-cm以moi100过夜转导，然后更换培养基(补充有10％fbs的dmem)。细胞在转导后48小时用于后续实验。

统计学分析。使用excel或r来分析数据。使用双尾斯氏t检验来检验两组之间的统计学差异。使用单向anova检验和随后的徒吉(tukey)多重比较检验来分析超过两组之间的统计学差异。当p值小于0.05时，确定为显著差异。

遗传测试。将来自患者的外周血分入edta并且被送至genedx实验室(马里兰州盖瑟斯堡(gaithersburg，md))用于基因组dna分离和商业遗传测试。对dna扩增并且用通过合成方法的“下一代(nextgeneration)”固态序列(亿明达公司(illumina))来测序。dcm基因的组包括对以下基因的完全编码区域和剪接点的测序：lmna、myh7、tnnt2、actc1、des、mybpc3、tpm1、tnni3、ldb3、taz、pln、ttr、lamp2、sgcd、mttl1、mttq、mtth、mttk、mtts1、mtts2、mtnd1、mtnd5和mtnd6。用人参比序列(cdnanm_00108005)与结果相比较。通过双脱氧dna测序来确定可能的疾病相关序列。还在混合种族的335个假定健康对照中确定候选疾病相关变体的存在。在tnnt2基因中鉴定变体(p.argl73trp)。这是用疏水性、中性的酪氨酸来取代亲水性、带正电的精氨酸的非保守氨基酸取代。在几种物种之间，该精氨酸在173位上高度保守。计算机分析(polyphen)预测该氨基酸取代破坏心脏肌钙蛋白t2蛋白的结构和功能。在混合祖先335个的对照个体中未发现该变体。

外显子组测序和数据分析。对来自个体iiia的基因组dna进行使用nimblegenseqcapezexomelibraryv2.0(罗氏分子生化制品公司(rochemolecularbiochemicals)的外显子组测序。检测潜在dcm的32个最新常染色体基因(补充表3)的突变。在外显子组捕获中靶向所有的这些基因并且总共覆盖190kb。用hiseq(亿明达公司)的一条通道来测序产生217x的中值覆盖(四分位距152x至243x)。通过使用由novoalign、picard、samtools、gatk和annovar组成的分析管道(analysispipeline)发现单核甘酸变体(snv)。通过比较snp数据库dhsnp132来确定snp。通过sift算法来鉴定有害的snv。

微阵列杂交和数据分析。使源自对照和dcmipsc的未分化ipsc或4周龄cm的(用或不用serca2a过表达处理)的生物复制品的na样品与艾菲美特(affymetrix)基因芯片人基因1.0st阵列杂交，然后用艾菲美特(affymetrix)表达控制台软件来进行标准化和标注。使用显示在所有样品之间标准偏差大于0.2的转录物的表达水平计算每对样品的皮尔森相关系数。对于分级聚类，我们使用针对平均连锁聚类的皮尔森相关。使用新式通路分析(ingenuitypathwayanalysis)(ipa)工具来鉴定富集的通路。仅选择基因数＞5的那些通路。

人esc和ipsc的心脏分化。在基质胶(bd生物科学公司(bdbiosciences))被覆的表面上采用mtesr-1多能干细胞培养基(干细胞技术有限公司(stemcelltechnologies))来培养人esc和ipsc至80％融合。在第0天，用accutase(西格玛公司)将细胞解离成含有10-20个细胞的小簇并且在2ml的基础培养基(stempro34，英杰公司，含有2mm谷胺酰胺，英杰公司，0.4mm硫代甘油，西格玛公司，50μg/ml抗坏血酸，西格玛公司，以及0.5ng/ml-bmp4，r&d系统公司(r&dsystems))中重悬以形成拟胚体(eb)。在第1-4天，向用于心脏特定分化的基础培养基添加bmp4(10ng/ml)、人bfgf(5ng/ml)和活化素a(3ng/ml)。在第4-8天，对eb更换含有人dkk1(50ng/ml)和人vegf(10ng/ml)的基础培养基，然后从第8天开始更换含有人bfgf(5ng/ml)和人vegf(10ng/ml)的基础培养基。所有的因子都获自r&d系统公司。在5％co2/空气环境中维持培养。

微电极阵列(mea)记录。在分化后第19-47天的实验之前1-3天，将1-6个搏动ipsc-cmeb置于明胶被覆的mea探针(α-医学科学公司(alphamedscientific))上。用med64放大器(α医学科学公司)在20khz下获得信号并且用国家设备公司a/d卡和装有med64mobiusqt软件的pc将信号数码化。如上所述测量和确定场电位时程(fpd)并且使用igorpro(lakeoswego)和msexcel进行离线校正。使用bazzet校正公式：cfpd＝fpd/√脉冲间隔使fpd针对搏动频率进行标准化。使用双尾斯氏t检验来进行比较dcm和对照ipsc-cm电生理学参数的统计学分析。

膜片钳。将分离的ipsc-cm接种在24孔平板中的明胶被覆的15mm的圆盖玻片上供于实验。使用epc-10膜片钳放大器(heka)和倒置显微镜(尼康公司(nikon)，te2000-u)对由盖玻片上的对照和dcmipsc产生的cm中的全细胞进行膜片钳记录。使用细丝(萨特仪器公司(sutterinstrument)，#bf150-110-10)采用硼硅酸盐玻璃按照以下参数(热，速度，时间)：1)740，20，250；2)730，20，250；3)730，20，250；4)710，47，250，使用微量移液管(萨特仪器公司，modelp-87)来制备玻璃吸管。采用以下的吸移溶液执行记录：在tyrodes溶液(140mmnacl，5.4mmkcl，1mmmgcl2，10mm葡萄糖，1.8mmcacl2和10mmhepes，在25℃下用naoh调至ph7.4)中的120mmkd-葡萄糖酸，25mmkcl，4mmmgatp，2mmnagtp，4mmna2-磷酸-肌氨酸，10mmegta，1mmcacl2和10mmhepes(在25℃下用kcl调至ph7.4)。使用双尾斯氏t检验进行统计学分析。

单细胞微流体pcr。在显微镜下人工挑选单个搏动cm。将各细胞引入含有10μl反应缓冲液(cellsdirect试剂盒，英杰公司)、te缓冲液(安碧公司(ambion))、感兴趣的引物(应用生物系统公司(appliedbiosystems))和superscriptiii逆转录酶/白金taq酶混合物(英杰公司)的混合物的pcr管中。在热循环仪(abiveriti)上如下实施逆转录和特定转录物的扩增：50℃15分钟，70℃2分钟，94℃2分钟，然后94℃15秒，60℃30秒，和68℃45秒，进行18次循环，然后68℃7分钟。使用nanoflexifc控制器(福路德姆(fluidigm))将扩增的cdna加载至biomark48.48动态阵列芯片上。作为相对荧光强度的测量值的阈值循环(ct)通过biomark实时pcr分析软件(fluidigm)来提取。

内皮细胞分化。使用1mg/ml胶原酶iv(英杰公司)将ipsc分散为含有约500-1000个细胞的细胞聚集体。将细胞聚集体悬浮培养于超低粘附细胞培养皿内的含有20％es-qualifiedfbs(英杰公司)并补充有如下诱导细胞因子的敲除dmem中：0-7天：20ng/mlbmp4；1-4天：10ng/ml活化素a；2-14天：8ng/mlfgf-2；4-14天：25ng/mlvegf-a。内皮祖细胞使用小鼠抗人cd31抗体(bd生物科学公司)磁力分离，并且在egm-2内皮细胞培养基(龙沙公司(lonza))中扩增。

表1.通过下一代测序(亿明达公司)遗传筛选dcm基因的组

表2.r173wdcm家族的临床特征

lvedd，左心室末端舒张末期内径

正常lvedd范围(成人)，＜5.5cm

正常射血分数(ef)，＞55％

wnl＝在正常限制以内

正常右心室(rv)舒张尺寸＝＜3.8cm

正常左心房(la)收缩尺寸＝＜4.2cm

表3.对导致患者iiia的dcm的32个最新基因列表的外显子组测序和筛选没有揭示其它可能潜在导致该疾病表型的单核甘酸变体

*使用默认gatk过滤参数供于pass

snv，单核甘酸变体

表4.通过mea记录得到的ipsc-衍生的搏动eb的基线电生理参数

平均数±标准误

表5.通过afm检测的单一dcmipsc-cm的参数

平均数±标准误

表6.用于实时定量-pcr和等位基因-pcr的引物

表7.在dcmipsc-cm中的serca2a过表达后拯救的基因的选择富集通路

表8.通过各试验分析的ipsc细胞系的扩散

实施例2

来自肥大型心肌病的患者的心肌细胞

肥大型心肌病(hcm)是心脏肌节的常染色体显性疾病，并且被估计为世界上最常见的遗传性心脏病症。hcm的患者展现出左心室(lv)肌膜的不正常增厚但没有增加的动力学负担，并且针对临床并发症如进行性心力衰竭、心率失常和心脏性猝死(scd)的的风险升高。过去二十年的分子遗传研究已经证明hcm是由在编码心脏肌节中的蛋白质的基因中的突变造成的。虽然特定突变的鉴定已经限定了hcm的遗传原因，但肌节突变导致肌细胞肥大和室性心律失常所经通路还未被完全认识。对于说明hcm发展潜在机理的努力已经产生了互相冲突的结果，以及解释疾病发展的肌球蛋白功能丢失和肌球蛋白功能获得的自相矛盾的支持模型。解决这些矛盾的尝试受阻于人心脏组织获取困难和无法在培养中增殖心脏模型。

为了克服这些障碍，我们从一个10个体的家族中产生诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞(ipsc-cm)，这些个体有半数在β肌球蛋白重链基因(myh7)的外显子18上携带常染色体显性错义突变，该突变是氨基酸位置663上的精氨酸编码为取代的组氨酸(arg663his)。患者特异性ipsc-cm的产生允许hcm在单细胞水平上再现，从而hcmipsc-cm的临床前建模能够说明所述疾病发展潜在机理。这些发现验证ipsc技术是一种理解肌节突变如何导致hcm发展并且鉴定该疾病的新治疗靶标的新方法。

hcm家族组群的募集以及疾病基因型和表型的评价。募集了一个跨越两代(ii和iii)的10成员家族组群供于皮肤成纤维细胞的分离。先证者是一名53岁的非洲裔美国女性患者(ii-1)，其在医院中存在心悸、呼吸急促和劳力型胸痛。来自全面检查的结果显示具有下隔膜和下壁显著增厚的同轴左心室肥大(lvh)(图31a)。为了确定hcm致病突变的存在，用hcm相关的18个基因的组筛选先证者的基因组dna的突变。核苷酸序列分析证明了在β-肌球蛋白重链基因的外显子18上的家族性hcm错义突变，其导致在氨基酸位置663上精氨酸变成取代的组氨酸(arg663his；图31b)。先证者家族的后续遗传评估揭示她的8个孩子中的4个(iii-1、iii-2、iii-3、iii-8；年龄21、18、14、10)携带arg663his突变(图31c)。先证者家族经过相同的综合临床评估，其由超声波心动描记术和mri揭示两个最年长的携带者中的轻微lvh，并由走动监测显示偶发的心室早发性收缩。两个较年轻的携带者(iii-3和iii-8；年龄14和10)还没有完全发展出表型，但通过超声波心动描记术确实展示出高动力性(hyperdynamic)功能。先证者的丈夫(ii-2；年龄55)和其它4个孩子(iii-4、iii-5、iii-6、iii-7；年龄为20、16、14、13)

表9.筛选的基因

患者特异性ipsc的产生和多能性的确认。患者特异性ipsc通过采用重编程因子oct-4、sox-2、klf-4和c-myc的慢病毒感染从所有10个个体的初级成纤维细胞中产生。每名患者产生最少3个不同细胞系，并且通过一连串的测试来测定多能性。建立的ipsc展现出对于esc标志物ssea-4、tra-1-60、tra-1-81、oct4、sox2、nanog和碱性磷酸酶，以及转录因子oct4、sox2和nanog的蛋白质表达的阳性免疫染色。定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序和定量rt-pcr证明nanog和oct-4启动子的低甲基化、内源性多能性转录因子的激活以及慢病毒转基因的沉默。比较皮肤成纤维细胞、ipsc和人esc(wa09细胞系)的全基因组表达谱的微阵列分析进一步证实所有细胞系的成功重编程。核型分析证明在贯穿30代的所有ipsc细胞系中具有稳定的染色体完整性。自发拟胚体(eb)和畸胎瘤形成试验在体外和体内产生所有3种胚层的细胞衍生物，证明了所产生的ipsc的多能性质。限制酶消化和测序分别验证了在hcm和对照ipsc的myh7基因座中arg663his的存在与缺失。

患者特异性ipsc分化为心肌细胞。使用标准3deb分化方案将来自所有对象的已建立的ipsc细胞系分化为心肌细胞谱系(ipsc-cm)。在分化起始之后10-20天，在光学显微镜下观察到自发性收缩eb的出现。心脏肌钙蛋白t的免疫染色表明来自对照和hcmipsc细胞系的搏动eb都含有60-80％纯度的心肌细胞。在多重电极阵列(mea)探针上接种搏动eb来评估电生理学性质。对照和hcmipsc-衍生的eb展现出的搏动频率、场电位和在基线上的上升速度相当。随后将eb解离成单个ipsc-cm并且将其涂在明胶被覆的腔式载玻片上用于进一步分析。来自hcm和对照家族成员的单个分离的ipsc-cm都维持自发收缩并且展示出针对肌节蛋白如心脏肌钙蛋白t和肌球蛋白轻链的阳性染色(图31d)。

携带arg663his突变的ipsc-cm在体外再现hcm表型。在心脏分化和解离成单个搏动细胞之后，体外表征患病的和对照匹配ipsc-cm的hcm表型的再现。肥大型ipsc-cm展现出hcm的特征如细胞扩大和在心脏分化诱导之后的第六周内开始的多核化(arad等，2002)。在诱导后第40天，hcmipsc-cm(1859+517像素；n＝236，4名患者细胞系)明显大于对照匹配的ipsc-cm(1175+328像素；n＝220，4名患者细胞系)并且展现出显著较高的多核化发生率(hcm：49.7+8.5％；n＝236，4细胞系相比对照：23.0+3.7％；n＝220，4细胞系)(图31d-f)。通过免疫染色检测，突变体ipsc-cm还证明hcm的其它特点，包括心房利钠因子(anf)的表达、β-肌球蛋白/α-肌球蛋白比率升高、钙依赖磷酸酶激活和活化的t-细胞的核因子(nfat)的核转位(图31g-k)。由于钙依赖磷酸酶-nfat信号传导是诱导成人心肌细胞肥大的关键转录活化剂，我们打算测试这条通路对于hcmipsc-cm肥大发展的重要性。通过环孢菌素a(csa)和fk506阻断hcmipsc-cm中钙依赖磷酸酶-nfat互相作用使肥大降低超过40％(图31l)。在没有抑制的情况下，发现nfat-活化的肥大介导物(如gata4和mef2c)在诱导心脏分化后第40天开始(但不早于该点)在hcmipsc-cm中显著上调。总之，这些结果表明钙依赖磷酸酶-nfat信号传导在由arg663his突变引起的hcm表型的发展中起核心作用。

单细胞基因表达谱证明hcm相关基因的激活。在感染的个体中hcm的临床表现通常发生在数十年的过程中。为了在细胞水平上研究arg663his突变对于hcm发展的即刻效果，我们评估了来自hcm患者和对照研究对象的单个纯化的ipsc-cm中的肥大相关基因的表达。在距离分化开始20、30和40天时将单个紧缩心肌细胞手动从培养盘上挑起并且采用32个心肌细胞-相关转录物的组进行单细胞定量pcr分析。从第40天开始，发现肥大相关基因(如gata4、tnnt2、myl2和myh7)在hcmipsc-cm中上调(图31m)。在这个时间点之前没有发现hcm相关基因表达的显著增加。

携带arg663his突变的ipsc-cm在单细胞水平上展现出电生理学和收缩性心律失常。心律失常是hcm的临床标志，并且导致所述疾病相关的大部分发病和死亡(包括心脏性猝死)。因此我们接着通过全细胞膜片钳检测携带arg663his突变的ipsc-cm的电生理学性质。hcm和对照ipsc-cm都含有以节点样、心室样和心房样电波形为特征的肌细胞群。在分化诱导后的前四周，来自两组的细胞都显示出相似的动作电位频率、峰振幅和静息电位。然而，从第30天开始，与对照(5.1+7.1％；n＝144，5名患者细胞系)相比，观察到hcm肌细胞的大量亚组分(40.4+12.9％；n＝131，5名患者细胞系)展现出心律失常波形(包括类似于延迟后去极化(dad)的频繁的小去极化)，其无法触发动作电位和集中搏动(图32a1、32a2、32b-c)。在光学显微镜下单个搏动ipsc-cm的延时视频证实电生理学缺陷导致收缩性心律失常。与具有规则的搏动间隔的对照ipsc-cm(1.4+1.9％；n＝68，5名患者细胞系)相比，hcmipsc-cm含有大量以不规则频率搏动的细胞(12.4+5.0％；n＝64，5名患者细胞系)。通过像素定量软件的单细胞视频记录的分析证实hcmipsc-cm收缩的心律失常特性。总之，这些发现证明了肌节突变能够在单细胞水平上诱导电生理学和收缩性心律失常。

在正常hesc-cm中arg663his突变的过表达再现了hcmipsc-cm的钙处理异常。钙(ca²⁺)对于心脏中的激发-收缩偶联和电生理信号传导的调节中起基础作用。为了研究携带arg663his突变的肌细胞中心律失常潜在的可能机理，我们之后使用荧光ca²⁺染料fluo-4乙酰氧基甲基酯(am)分析了来自对照和hcm患者的ipsc-cm的ca²⁺处理性质。与源自健康个体的ipsc-cm相比，hcmipsc-cm显示显著的ca²⁺瞬变不规律性(如可能与触发的心律失常样电压波形相关的多重事件)，这些不规律性实际不存在于对照细胞中(图32d-e)。有趣的是，在细胞肥大开始之前，观察到hcmipsc-cm中发生不规律的ca²⁺瞬变，这表明异常的ca²⁺处理可能是诱导肥大表型的引发因素。因为自发收缩的固有变化可能使ca²⁺瞬变混乱，因此在线扫描期间，我们对hcm和对照ipsc-cm施加1hz起搏。与自发收缩的数据相一致，发现hcmipsc-cm中的异常ca²⁺瞬变是常见的(12.5+4.9％；n＝19，5名患者细胞系)并且在对照ipsc-cm(n＝20，5名患者细胞系)中不存在。为了进一步确定在电生理学和ca²⁺调节中观察到的缺陷归因于arg663his突变，我们之后使人胚胎细胞衍生的心肌细胞(hesc-cm；wa09细胞系)中过表达肌细胞的突变体形式。发现过表达arg663his突变体myh7转录物的hesc-cm展现出相似的心律失常和异常的ca²⁺瞬变(图32f-i)。

之前的报告已经将胞内ca²⁺([ca²⁺]i)升高关联为心律失常和细胞肥大的触发因素。因此我们进一步比较对照和疾病ipsc-cm中的[ca²⁺]i。通过fluo-4基线强度的[ca²⁺]i的初步定量表明在诱导后第30天时，与对照对应物(n＝122，4名患者细胞系)相比，hcmipsc-cm(n＝105，4名患者细胞系)中的[ca²⁺]i高出约30％(图32j)。为了确定舒张[ca²⁺]i差异，我们还在对照和hcmipsc-cm中采用的比率输出的ca²⁺染料indo-1。indo-1成像证明与对照细胞(n＝17，4患者细胞系)相比，携带arg663his突变的ipsc-cm中的舒张[ca²⁺]i更高(indo-1比率增加25.1％)，并且心律失常活性仅仅在arg663his肌细胞中是明显的。这些发现强调了不规律ca²⁺循环在hcm发病机理中所起的作用(图32k-l)。

肌质网(sr)ca²⁺储存的检测进一步支持了患病的ipsc-cm中[ca²⁺]i升高的发现，由于ca²⁺胞质保留时间已经显示通过阻止srca²⁺摄取来减少srca²⁺负荷。用fluo-4处理hcm和对照ipsc-cm，并且暴露于咖啡因中，这诱导srca²⁺储存释放进入胞质中。携带arg663his突变的肌细胞的特征在于与对照ipsc-cm(平均峰δf/f0比率＝3.96+0.18，n＝23，3名患者细胞系)相比明显较小的ca²⁺释放(平均峰δf/f0比率＝3.05+0.20，n＝35，3名患者细胞系)(图32m-n)。这些发现证明了ca²⁺循环功能障碍和[ca²⁺]i升高在arg663his突变所致的hcm的发病机制中起到核心作用。

肌力刺激使患病的ipsc-cm中的hcm表型加重。因为携带arg663his突变的ipsc-cm在体外再现hcm表型的多个方面，所以假设我们的平台也能用作评估在单细胞水平上药物对于hcm影响的筛选工具。为了测试hcmipsc-cm准确模拟药品反应的能力，我们首先使单个对照和患病的ipsc-cm受到正性肌力刺激(一种已知的针对肌细胞肥大和室性心动过速的触发方式)。在分化诱导开始30天后，每天用β-肾上腺素激动剂(200μm异丙肾上腺素)孵育患者特异性心肌细胞维持5天。起先hcmipsc-cm一般不显示细胞肥大直到诱导后第40天(图31e)，但是发现当用异丙肾上腺素处理时，与对照对应物相比，在第30和35天之间细胞尺寸增加1.7倍(图33a)。也发现β-肾上腺素刺激在hcmipsc-cm中严重加剧了不规律ca²⁺瞬变和心律失常的存在(图33b-c)。重要的是，β-肾上腺素阻断剂(400μm普萘洛尔)与异丙肾上腺素的共同给药显著改善了邻苯二酚胺-诱导的肥大、ca²⁺处理缺陷和心律失常的恶化。

ca²⁺调节异常的治疗防止hcm表型的发展。因此，我们通过用l-型ca²⁺通道阻断剂维拉帕米处理对照和突变体ipsc-cm评估了对于ca²⁺进入的药物抑制是否能够有助于防止hcm表型的发展。与对照细胞相比，根据mea剂量响应试验(hcmic50＝930.61+80.0nm，对照ic50＝103.0+6.0nm)检测，在hcmipsc-cm中的自发搏动速率相对耐受维拉帕米，这与在携带arg663his突变的ipsc-cm中的[ca²⁺]i升高一致。显然，连续10-20天以治疗性剂量(50-100μm)向单一患病的ipsc-cm连续添加维拉帕米显著改善了包括肌细胞肥大、ca²⁺处理异常和心律失常的hcm表型的各个方面(图34a-c)。

能够在单细胞水平筛选心律失常ipsc-cm以供潜在药物治疗。由于现有的hcm药物治疗方法除了ca²⁺通道阻断剂以外还包括使用β-阻断剂和抗心律失常药，我们在单细胞水平上根据改善hcm表型的潜力来进一步筛选临床上用于来治疗hcm的药物的12种其它药物的组。虽然维拉帕米是仅有的发现能够防止细胞肥大的药剂，但是抑制na+流入的抗心律失常药物如利多卡因、美西律和雷诺嗪也显示恢复hcmipsc-cm中正常搏动频率的潜力，这可能是通过na⁺/ca²⁺交换体限制ca²⁺进入来实现的。在没有肌力刺激下给予的其它靶向k⁺通道的抗心律失常药剂和β-阻断剂在单个细胞中没有任何治疗效果。总之，这些结果指示ca²⁺调节中的不平衡是细胞水平上hcm发展的潜在核心机理，并且证明患者特异性ipsc-cm作为鉴定治疗hcm的新药剂的有力工具的潜力。

表10.筛选的药物

*维拉帕米是在向培养基连续添加5天或更多天之后观察到对hcmipsc-cm具有治疗效果的唯一药物。没有观察到低于5天时间的处理对于ca²⁺处理或心律失常(arrhythmogenicity)有任何治疗效果。通过在所列的浓度下用相应的药物化合物孵育细胞10分钟然后清洗来进行所有其它的药物筛选测试。

在几十年前初步鉴定了hcm的遗传原因。然而，编码心脏肌节的基因中的突变能够造成hcm发展的机理还未清楚。患者特异性ipsc-cm的产生允许对遗传性心血管疾病(包括扩张型心肌病、leopard和长qt综合征)的深度建模。为了说明hcm发展潜在的信号转导通路，我们采用ipsc技术来从一个10名成员家族组群的皮肤成纤维细胞产生功能性心肌细胞，该组中的半数在myh7基因中具有hcmarg663his突变。患者特异性ipsc-cm再现了hcm的几个特征，包括细胞肥大、钙依赖磷酸酶-nfat活化、肥大转录因子的上调和收缩性心律失常。观察到不规律的ca²⁺瞬变以及舒张[ca²⁺]i的升高先于其它症状异常的出现，强烈表明ca²⁺循环调节异常是该疾病发病的核心机理。ca²⁺内稳态中的不平衡已在各种报告中被描述为hcm的关键特征。然而，几乎没有说明这些异常是否是hcm的症状或致病因素的证据存在。

在本研究中，我们展示了ca²⁺在由arg663his突变引起的hcm发展中起到关键作用的多条证据。具体地，我们的发现显示在由arg663his突变介导的[ca²⁺]i升高能够诱导细胞肥大和收缩性心律失常。[ca²⁺]i的持续升高是钙依赖磷酸酶的激活的触发因素，所述钙依赖磷酸酶是一种ca²⁺依赖性磷酸酶，其是在压力条件下肌细胞中肥大的重要效应物。激活的钙依赖磷酸酶使nfat3转录因子脱磷酸，使其能够移位至核以直接与肥大的经典介导物(如gata4和mef2)直接相互作用。在心脏分化的诱导之后单个ipsc-cm的基于时间的基因表达谱证实了该模型，因为观察到肥大的下游效应物的表达依赖于[ca²⁺]i升高和nfat的核移位。通过csa和fk506对钙依赖磷酸酶活性的抑制以及通过维拉帕米介导的对细胞肥大的ca²⁺流入的减少，证实了ca²⁺功能障碍和钙依赖磷酸酶-nfat信号传导在hcm发病机制中的作用(图34d)。ca²⁺循环的变化是心脏心律失常的常见触发因素，由于其诱导中风和心脏性猝死的潜力，其是hcm的严重临床并发症。

hcm的患者中心律失常的潜在机理还未被认识，尽管报道已经表明间质纤维化、异常的心脏解剖结构、肌细胞混乱、增加的细胞尺寸和ca²⁺内稳态中的功能障碍是可能的介导因素。我们的发现第一次证明myh7基因中的arg663his突变能够在单细胞水平上甚至在没有细胞肥大的情况下直接导致电生理学和收缩性心律失常。个体hcmipsc-cm中心律失常发展的最可能机理是[ca2+]i积累，其诱导延迟后除极(dad)，其中在动作电位复极之后肌质网ca²⁺释放触发瞬时内向电流。dad的连续存在能够反过来导致室性心动过速和心脏性猝死，如在患有复发心律失常的患者中。

hcmipsc-cm的全细胞电流钳实验通过证明患病肌细胞中频繁的自发dad样波形支持了这个假设。我们相信这些结果是证明特异性hcm突变的第一个报告，如arg663his能够作为在细胞水平上直接触发心律失常的因素。

肌细胞ca²⁺负荷升高的机制似乎对于肥大和心律失常起重要作用。突变体ipsc-cm的药物筛选也支持了[ca²⁺]i升高作为心律失常发展的核心机理。在我们使用的13种试剂中，只有ca²⁺和na⁺进入的药物阻断剂减轻了hcmipsc-cm中的收缩性心律失常。na⁺流入的减少通过允许na⁺/ca²⁺交换以更容易去除ca²⁺来限制[ca²⁺]i。我们的结果证明基于ipsc的技术对于模拟hcm和相关触发的心律失常的发展，以及鉴定该疾病的潜在治疗剂的功用。这些结果是ca²⁺内稳态的不平衡在单细胞水平上作为hcm发展的起始因子的首次提供的直接证据。

实验步骤

患者募集。先征者和家族的临床评估包括身体检查、ecg、心脏磁共振成像和24小时holter监测。结果揭示了在先征者(ii-1)和最年长的两个携带者(iii-1和iii-2)中在舒张末期具有顶壁接近完全闭合的高动力心室收缩功能。相反，在先征者或携带者中没有发现延迟的增强。走动监测揭示了偶发心室早发性收缩。最年轻的两个携带者(iii-3和iii-8；年龄14和10岁)展现出高动力心脏功能但无其它hcm临床特征，这极可能归因于其较低的年龄。

成纤维细胞的分离和维持。新鲜分离的皮肤活检物用pbs清洗并且转移至1.5ml管中。在胶原酶i(在dulbecco改良eagle培养基(dmem)中含1mg/ml，加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)中碾碎组织并且使其在37℃下消化6小时。将解离的皮肤成纤维细胞铺板并保持在37℃下，95％空气和5％co2的潮湿培养箱中的含有10％fbs(英杰公司)、glutamax(英杰公司)、4.5g/l葡萄糖(英杰公司)、110mg/l丙酮酸钠(英杰公司)、50u/ml青霉素(英杰公司)和50g/ml链霉素(英杰公司)的dmem中。所有的细胞在五次传代之内用于重编程。

慢病毒产生和转导。293ft细胞(英杰公司)以80％融合度铺板在100-mm皿上并且根据生产商的说明书使用lipofectamine2000(英杰公司)采用12μg的慢病毒载体(oct4、sox2、klf4和c-myc)加8μg的包装ppax2和4μg的vsvg质粒来转染。在转染后48小时收集上清，通过0.45-μm孔径的醋酸纤维素过滤器(马萨诸塞州比莱瑞卡的密理博公司)过滤，并在4℃下与peg-it病毒浓缩溶液(加利福尼亚州山景市的系统生物科学公司(systembiosciences))混合过夜。第二天以1,500g沉淀病毒，并且用opti-mem培养基(英杰公司)重悬。

患者特异性ipsc的衍生。如前所述使用上述产生的慢病毒在基质胶被覆的组织培养皿上(加利福尼亚州圣何塞的bd生物科学公司(bdbiosciences))用mtesr-1hesc生长培养基(加拿大温哥华的干细胞技术公司(stemcelltechnology))实施患者特异性ipsc细胞系的产生、维持和表征。

碱性磷酸酶染色。如之前的研究，按照生产商的说明书使用定量碱性磷酸酶es表征试剂盒(密理博公司)实施碱性磷酸酶(ap)染色。

免疫荧光染色。如之前所述，使用如下的一抗来实施免疫荧光染色：ssea-3、ssea-4、tra-1-60、tra-1-81、anf、tuj-1(密理博公司)、oct3/4、nanog、afp(加利福尼亚州圣克鲁斯公司)、sox2(加利福尼亚州圣迭戈市白乐津公司(biolegend))、平滑肌肌动蛋白(白乐津公司)、肌节α-辅肌动蛋白(密苏里州圣路易斯市的西格玛公司(sigma))、ctnt(伊利诺斯州巴灵顿的热科学公司(thermoscientific))、alexafluor488鬼笔环肽(英杰公司)、肌球蛋白轻链2a(mlc2a)、肌球蛋白轻链2v(mlc2v)(德国哥庭根的突触系统公司(synapticsystems)和alexafluor偶联的二抗(英杰公司)。

亚硫酸氢盐焦磷酸测序。使用zymodna甲基化试剂盒(加利福尼亚州爱尔文的zymo研究公司)来按照生产商的说明书用亚硫酸氢盐处理1μg的样品dna。然后进行pcr，cdna被转化为单链dna模板并且用焦磷酸测序psq96hs系统(北卡罗来纳州夏洛特市的拜泰齐公司(biotage))测序。使用qcpg软件(拜泰齐公司)以t/csnp来分析各单独的基因座。

微阵列杂交和数据分析。从ipsc分离rna并且使之与艾菲美特基因芯片人基因1.0st阵列(加州圣克拉拉的艾菲美特(affymetrix，santaclara，ca))杂交。通过艾菲美特表达控制台软件(艾菲美特)来对表达进行标准化和标注。使用显示在所有样品之间标准偏差大于0.2的转录物的表达水平计算每对样品的皮尔森相关系数。

体外自发分化。对于拟胚体(eb)形成，在基质胶被覆的平板上用胶原酶iv(英杰公司)解离ipsc集落，并且将其接种在低粘附6孔平板中的敲除dmem(英杰公司)中来形成拟胚体(eb)，敲除dmem含有15％ksr(英杰公司)、glutamax(英杰公司)、4.5g/l葡萄糖(英杰公司)、110mg/l丙酮酸钠(英杰公司)、50u/ml青霉素(英杰公司)和50g/ml链霉素(英杰公司)。在5天后，eb被转移到粘附的、明胶被覆的腔式载玻片上并且在相同的培养基中另培养8天。

畸胎瘤形成。使1x10⁶个未分化的ipsc在10μl基质胶(bd生物科学公司)中悬浮并且通过28.5规格注射器递送至8周龄scidbeige小鼠的肾包膜下。在细胞递送后8周，移植肿瘤用于苏木精和伊红染色。

western印迹。使用ripa缓冲液分离全细胞提取物并且使用针对oct4、c-myc、klf4、肌动蛋白(圣克鲁兹)、sox2(白乐津公司)的特异性抗体通过western印迹分析10μg蛋白。

人esc和ipsc的心脏分化。如上所述使人h9esc和ipsc分化为心肌细胞。简言之，在80％融合下用accutase酶(西格玛公司)将多能干细胞解离为10-20个细胞的小簇。在含有stempro34(英杰公司)、2mm谷氨酰胺(英杰公司)、0.4mm硫代甘油(西格玛公司)、50μg/ml抗坏血酸(西格玛公司)和0.5ng/mlbmp4(明尼苏达州明尼阿波利斯的r&d系统公司(r&dsystems，minneapolis，mn))的2ml基础培养基中重悬细胞以形成eb。对于心脏分化的第1-4天，用向基本培养基添加10ng/mlbmp4、5ng/ml人bfgf(r&d系统公司)和3ng/ml活化素a(r&d系统公司)来处理细胞。从第4天到第8天，对eb换用含有人50ng/mldkk1(r&d系统公司)和10ng/ml人vegf(r&d系统公司)的基础培养基。从第8天开始，用含有5ng/ml人bfgf和10ng/ml人vegf的基础培养基处理细胞。在5％co2/空气环境中维持培养。

心肌细胞尺寸的测量。对于单细胞洗剂细胞分析，将搏动eb铺在明胶被覆的皿上。在涂板后3天，用胰蛋白酶消化细胞，用40-mm孔径大小的过滤器过滤，并且以低密度在明胶被覆的腔式载玻片上重新铺板(纽约州罗切斯特的耐洁纽恩克国际公司(nalgenenuncinternational，rochester，ny))。在重新铺板后3天，用4％多聚甲醛(西格玛公司)来混合细胞，在0.3％曲通(西格玛公司)中透化，用5％bsa封闭并且在4℃下针对心脏肌钙蛋白t(1∶200，塞摩费舍尔公司(thermofisher))染色过夜。用pbs洗涤染色的细胞3次，然后用alexafluor488鬼笔环肽(英杰公司)、alexafluor594驴抗小鼠抗体(英杰公司)和dapi(英杰公司)孵育1小时。用imagej软件包(马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院)分析正常和hcmipsc-cm的细胞面积。

单细胞微流体pcr。在光学显微镜下人工挑取单个搏动ipsc-cm并且置于分开的pcr管中以供采用前述的特定引物进行逆转录和cdna扩增。将扩增的cdna加载至biomark48.48动态阵列芯片(加利福尼亚州南旧金山的福路德姆(fluidigm，southsanfrancisco，ca))供于通过biomark实时pcr分析软件(福路德姆)分析。

钙(ca²⁺)成像。ipsc-cm在明胶被覆的8孔lab-ii反应室(耐洁纽恩克国际公司)中分离并接种用于钙成像。在37℃下，用在tyrodes溶液(140mmnacl，5.4mmkcl，1mmmgcl2，10mm葡萄糖，1.8mmcacl2和10mmhepes，在25℃下用naoh调至ph7.4)中的5μmfluo-4am(英杰公司)和0.02％普流罗尼克f-127(英杰公司)处理细胞15分钟。在fluo-4处理之后，用tyrodes溶液洗涤细胞3次。通过具有63×透镜的共聚焦显微镜(德国哥廷根的卡尔蔡司公司，lsm510meta)使用zen软件(卡尔蔡司公司)进行成像。对于起搏钙染料成像，在495+20nm激发和515±20nm发射下检测荧光。在10s的记录时程内以20fps记录视频。以1hz和2hz刺激细胞。在装备了lambdadg-4300w氙光源(加利福尼亚州诺瓦托的萨特仪器公司(sutterinstruments，novato，ca))、orca-erccd照相机(新泽西州布里奇沃特的滨松公司(hamamatsu，bridgewater，nj))和axiovison4.7软件(卡尔蔡司公司)的axioobserverz1(卡尔蔡司公司)倒置显微镜上进行检测。在每个视频图像中，分析感兴趣的区域(roi)的染料强度f/f0中的变化，在每个视频的第一个图像中确定静息荧光值f0。从所有的数值中扣去背景强度，并且使曲线针对0进行标准化。

使用indo-1-am的基底[ca²⁺]i测量。在37℃下，在含有5μmindo-1am(英杰公司)和0.02％普流罗尼克f-127(英杰公司)的培养基中处理心肌细胞20分钟。在indo-1处理之后，用2mmca²⁺林格液(ringer)(155mmnacl，4.5mmkcl，2mmcacl2，1mmmgcl2，10mmd-葡萄糖和5mmna-hepes，ph7.4)洗涤细胞3次并在室温下孵育20分钟以允许indo-1去酯化作用。在32℃下，在ca²⁺林格液中使用zeissaxiovert200m落射荧光显微镜对心肌细胞成像。使用0.6uvnd滤波器(减弱激发强度)和400dclp在350±10nm下激发indo-1。使用cairnoptosplitii(425二向色，488/22带通滤波器，英国肯特郡)分离发射的光。通过metamorph软件(加利福尼亚州萨尼维尔的分子装置公司(moleculardevices))在100ms曝光下用以流捕获模式采用4x4像素组合收集自发ca²⁺瞬变。对于图像分析，使用cairnimagesplitterimagej插件来排列短波长发射通道和长波长发射通道。

ipsc-cm的咖啡因处理。用含有1.8mmca²⁺和1mm镁的pbs灌注细胞并且在1hz下起搏以观察规律的瞬变。两个第二批(twosecondpuff)的20mm的咖啡因母液通过灌注设备递送。在咖啡因到达细胞之前关闭起搏以精确测量ca²⁺释放。

钙成像线扫描分析。使用fiji(国立卫生研究院)定量分析ca²⁺线扫描的平均荧光强度。瞬变之间的周期被定义为两个连续尖峰的峰之间的时间。ca²⁺基线被定义为瞬变的所有最小值的中值。尖峰周期的不规律性被定义为标准偏差(s.d.)与平均值的比率。

微电极阵列(mea)记录。对照和hcmipsc被分化为60-80％纯度范围cm的搏动eb并且接种在多重电极40阵列上用于记录场电位时程(fpd)和搏动频率(每分钟搏动次数，bpm)和脉冲间隔(isi)。在分化后20-40天的实验之前，将搏动ipsc-cmeb铺在明胶被覆的mea探针(日本大阪市的α-医学科学公司(alphamedscientific))上。在20khz下用med64放大器(α-医学科学公司)获取信号，并且用具有pci-6071a/d卡(德克萨斯州奥斯汀市国家仪器公司(nationalinstruments，austin，tx))的pc运行med64mobiusqt软件(加利福尼亚州塔斯廷的witwerx公司(witwerx，inc.，tustin，ca))将信号数字化。所有的实验在35.8-37.5℃下于不含血清或抗生素的dmem中实施。在双蒸水中以50mm浓度制备维拉帕米母液。通过以各剂量向mea探针中1-2ml体积添加0.4-2μl的dmem中的1000x维拉帕米浓度维持10分钟来进行剂量反应实验。使用mobiusqt离线获取搏动频率和场电位波形数据并且储存为csv文件。向igorpro(俄勒冈州波特兰的wavemetrics公司)中输入波形数据用于fpd和vmax测量。对于维拉帕米剂量反应实验，使搏动频率针对基线进行标准化，并且使用bazzet校正公式：cfpd＝fpd/√脉冲间隔将fpd调节为搏动频率。

膜片钳。使用epc-10膜片钳放大器(德国兰布雷希特的heka公司)进行全细胞膜片钳记录。收缩的eb被机械分离，通过酶分散为单细胞并且粘附在明胶被覆的盖玻片(cs-22/40，(康涅狄格州哈姆登的warner公司)warner，hamden，ct)上。记录时，含有铺有的心肌细胞或herg-hek293细胞的盖玻片被转移到安置在倒置显微镜(日本东京的尼康公司)的平台上的rc-26c记录室(warner公司)中。使用薄壁硼硅酸盐玻璃(warner公司)微量移液管(加利福尼亚州诺瓦托的萨特仪器公司)制备玻璃吸管，用显微拉制仪(日本东京的成茂公司(narishige，tokyo，japan))磨光并且采用2-4mω的电阻。使用需要1分钟溶液交换的快速溶液交换器(法国格勒诺布尔的bio-logic公司)，细胞外溶液灌注是连续的。使用patchmaster软件(heka，德国)获得数据并且在1.0khz下数字化。使用pulsefit(heka)、igorpro(俄勒冈州波特兰的wavemetrics公司)、origin6.1(萨诸塞州诺汉普顿的麦克卡尔公司(microcal))和prism(加利福尼亚州拉由拉市的格拉夫派得软件公司(graphpad))分析数据。对于产生自ipsc的人心肌细胞的全细胞膜片钳记录，通过tc-324b加热系统(warner公司)将温度保持恒定在36-37℃。在含有140mmnacl，5.4mmkcl，1mmmgcl2，10mm葡萄糖，1.8mmcacl2和10mmhepes的正常tyrode溶液(在25℃下用naoh调至ph7.4)中进行电流钳记录。吸移溶液含有120mmkcl，1mmmgcl2，10mmhepes，3mmmg-atp，10mmegta(在25℃下用koh调至ph7.2)。在h2o中溶解维拉帕米(西格玛公司)并且将其在玻璃瓶中制备成10mm母液。在室温下剧烈混合母液10分钟。就测试而言，在玻璃瓶中使用外部溶液将化合物稀释；该稀释物在使用前不超过30分钟时制备。在终稀释物中存在等量的dmso(0.1％)。

定量rt-pcr。使用trizol分离总mrna并且使用1μg通过superscriptiicdna合成试剂盒(英杰公司)来合成cdna。使用0.25μl的反应混合物通过使用greenmastermix(英杰公司)的qpcr来对基因表达进行定量。使表达值针对gapdh的平均表达进行标准化。

药物处理。用药剂处理单个收缩ipsc-cm维持10分钟以供中间分析，随后洗出。对于肌力刺激实验，连续5天向细胞培养基添加200μm异丙基肾上腺素和400μm普萘洛尔。通过连续10-20天每天向ipsc-cm的培养基添加50μm和100μm维拉帕米来进行维拉帕米处理。

实施例3

来自蒽环类抗生素中毒患者的心肌细胞

蒽环类抗生素诱导的心脏中毒(和对蒽环类抗生素诱导的毒性的耐受性)。蒽环类抗生素(如多柔比星)是用于治疗白血病、霍奇金淋巴瘤以及乳腺、胃、肺、卵巢、甲状腺和肌肉以及其它器官的实体瘤的一线化疗剂。蒽环类抗生素的主要副作用是心脏中毒，对于很多接受采用这种化疗剂的方案的接受者而言，其导致严重的心脏衰竭。患者特异性ipsc-心肌细胞(ipsc-cm)源自易受蒽环类抗生素-诱导的心脏中毒影响的个体和不易受蒽环类抗生素-诱导的心脏中毒影响的个体。

这些细胞可用于检测和滴定测量心脏毒性化疗药物，并且鉴定负责蒽环类抗生素-诱导的心脏中毒的易感性/耐受性的基因。募集接受基于蒽环类抗生素的化疗方案的年龄相符的患者，并且评估这些患者是否发展出蒽环类抗生素诱导的心力衰竭。从患者中收集皮肤样品并且从成纤维细胞产生ipsc-cm。

在实施例1或实施例2中描述了用于分离和维持成纤维细胞的方法；用于患者特异性ipsc细胞系衍生的方法；以及用于细胞的心脏分化的方法。

实施例4

来自arvd患者的心肌细胞

心律失常性右心室发育不良(arvd)。arvd是心脏桥粒的常染色体显性疾病，其导致右心室心律失常以及心脏性猝死。这是仅仅排在肥大型心肌病之后的造成年轻人心脏性猝死的第二大主要原因。患者特异性ipsc-心肌细胞(ipsc-cm)源自携带arvd的遗传性突变的患者的组群以及家族匹配对照。这些细胞系可以用于药物筛选并且鉴定影响疾病表型的分子靶标。

在实施例1或实施例2中描述了用于分离和维持成纤维细胞的方法；用于患者特异性ipsc细胞系衍生的方法；以及用于细胞的心脏分化的方法。

ipsc-cm从6名患者的血液中制得。2名患者的pkp2基因中有p672fsx7402013delc突变，2名患者的pkp2基因中有q617x1849c＞t突变，而2名患者是家族匹配的对照对象。

实施例5

来自lvnc患者的心肌细胞

左心室致密化不全(lvnc，又名非压缩型心肌病)。lvnc是遗传性心脏病，其由在胚胎发生期间破坏的心肌膜(心肌)发育引起。带有导致lvnc突变的患者在生命的早期显示心脏衰竭和异常的心脏电生理学。

患者特异性ipsc-心肌细胞(ipsc-cm)源自lvnc患者的组群和家族匹配对照对象。这些细胞系可以用于药物筛选并且鉴定影响疾病表型的分子靶标。

在实施例1或实施例2中描述了用于分离和维持成纤维细胞的方法；用于患者特异性ipsc细胞系衍生的方法；以及用于细胞的心脏分化的方法。

实施例6

来自dilv患者的心肌细胞

左心室双入口(dilv)。dilv是先天性心脏缺陷，其中左右心房都输送进入左心室。结果是，天生带有这种缺陷的儿童仅仅具有一个发挥功能的心室，并且在将氧合的血泵入全身循环方面存在问题。

患者特异性ipsc-心肌细胞(ipsc-cm)源自患有该疾病的一个个体。这些细胞系可以用于药物筛选并且鉴定影响疾病表型的分子靶标。

在实施例1或实施例2中描述了用于分离和维持成纤维细胞的方法；用于患者特异性ipsc细胞系衍生的方法；以及用于细胞的心脏分化的方法。

实施例7

来自长qt患者的心肌细胞

长qt(1型)综合征(lqt-1，kcnq1突变)。长qt综合征(lqt)是遗传性心律失常疾病，其中心电图的qt阶段延长，导致心律失常和心脏性猝死的易感性的增加。有13种已知的基因与lqt相关。

患者特异性ipsc-心肌细胞(ipsc-cm)源自kcnq1基因中携带突变的lqt患者组群，所述基因是最常见的突变的lqt基因并且导致该疾病全部病例的30-35％。该基因具有g269s错义突变。这些细胞系可以用于药物筛选并且鉴定影响疾病表型的分子靶标。

在实施例1或实施例2中描述了用于分离和维持成纤维细胞方法；用于患者特异性ipsc细胞系衍生的方法；以及用于细胞的心脏分化的方法。

前述内容只是说明本发明的原理。应理解，本领域技术人员能够设计各种安排，虽然本文没有明确描述或显示这些安排，但它们均体现本发明的原理并包含在本发明构思和范围内。而且，本文所述的所有实施例和条件语言主要旨在辅助读者理解本发明的原理和本发明对发展现有技术作出的贡献，且不对这些具体引用的实施例和条件构成限制。而且，本文有关本发明原理、方面、实施方式以及具体实施例的所有陈述都应包括其结构和功能等同物。此外，这些等同物应包括目前已知的等同物和将来开发的等同物，即新开发的具有相同功能的任何元件，无论其是何种结构。因此，本发明的范围不应仅限于本文所示和所述的示范性实施方式。适当的是，本发明的范围和构思由所附权利要求书限定。

序列表

<110>n·孙(sun,ning)

m·t·隆盖克(longaker,michael)

r·c·罗宾斯(robbins,robert)

j·吴(wu,joseph)

f·蓝(lan,feng)

a·李(lee,andrew)

p·伯里奇(burridge,paul)

<120>来自患者的诱导性多能干细胞的心肌细胞及其使用方法

<130>stan-847wo

<140>pct/us12/47726

<141>2012-07-20

<150>61/510,422

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