基于酪氨酸酶催化的革兰氏阳性菌表面修饰方法及其应用与流程

本发明涉及一种基于酪氨酸酶催化的革兰氏阳性菌表面修饰方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术：

近年来，越来越多的研究表明细菌对于人体健康是一把“双刃剑”。一方面，每年各种致病菌及耐药菌的传播会导致大量细菌感染病例的出现，对人类的正常生活构成了严重威胁；另一方面，人体内存在数以亿万计的共生细菌，尤其是肠道微生物群，它们在维持消化系统功能和参与调控全身免疫系统等诸多方面发挥着重要的作用。为了揭示细菌的各种生物学特性，对细菌进行荧光标记是一项基本的研究手段。目前，荧光蛋白标记技术是一种普遍采用的策略，它通过对目标细菌转染经过工程化改造的质粒，使细菌在特定的位点表达荧光蛋白，从而方便研究者进行原位示踪。然而，该策略操作复杂，成本高，并且不适用于厌氧菌以及那些无法在实验室内培养的菌种。最近，基于d型氨基酸的细菌代谢标记技术得到了广泛的关注。该技术首先给细菌孵育标记有荧光基团的d型丙氨酸衍生物，然后利用细菌自身合成的代谢途径将修饰分子引入到细胞壁的肽聚糖结构中，进而实现对细菌的特异性荧光标记。此外，通过将荧光基团替换为生物正交反应基团，该技术还能够实现对细菌表面的官能团化，为后续的化学修饰提供了反应位点。不过，这种基于细胞代谢的修饰策略无法对死细菌或细菌碎片进行标记，并且其修饰效率严重依赖于细菌的生长状态或活性。因此，继续发展新型的细菌标记技术具有极为重要的研究意义。

技术实现要素：

发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种无需质粒转染或细胞代谢参与，能够直接对细菌表面进行高效化学修饰的方法。

技术方案：为了实现上述目的，本发明公开一种针对革兰氏阳性菌的化学修饰方法。

本发明所述的一种基于酪氨酸酶催化的革兰氏阳性菌表面修饰方法，所述方法使用酪氨酸酶和含苯酚基团的修饰分子。

优选的，所述酪氨酸酶为来源于菌菇的多酚氧化酶。

优选的，所述含苯酚基团的修饰分子包括生物素基酪酰胺、cy3-酪酰胺、cy5-酪酰胺和cy7-酪酰胺。

进一步的，所述修饰方法包括以下步骤：

(1)取革兰氏阳性菌菌液，离心得细菌沉淀，清洗后重悬于生理盐水中；

(2)将酪氨酸酶和含苯酚基团的修饰分子加入到步骤(1)的细菌悬液中，反应后清洗得到经修饰的革兰氏阳性菌。

步骤(2)中，所述反应是指在室温下震荡反应10～15分钟。所述酪氨酸酶和含苯酚基团的修饰分子在细菌悬液中的终浓度范围分别为10-500μg/ml和0.1-100μg/ml。

步骤(1)和步骤(2)中，所述清洗是指用生理盐水清洗细菌2～3次。

进一步的，本发明还提供了所述修饰方法在针对革兰氏阳性菌的荧光成像(革兰氏阴、阳性菌的区分)、光动力抗菌、磁珠分选以及肉眼可视化检测方面的应用。

本发明所述的修饰方法中包括酪氨酸酶和带有苯酚基团的修饰分子。该方法利用酪氨酸酶的催化特性，将修饰分子中的苯酚基团氧化为具有高度反应活性的邻苯醌式结构。邻苯醌能够与革兰氏阳性菌细胞壁的肽聚糖结构发生共价反应，从而将荧光基团或生物素基团引入到细菌表面。相比之下，革兰氏阴性菌的细胞壁由一层外膜包覆，阻碍了修饰分子与肽聚糖的结合，因此不能被该方法修饰。

技术效果：相对于现有技术，本发明具有以下优势：(1)修饰效率高：该方法基于生物酶催化，具有极高的反应效率，室温下15分钟以内即可完成修饰；(2)操作简便：本发明所述的修饰方法避免了质粒转染或复杂的有机合成，所有原料均为商品化试剂，仅需简单的一步混合即可完成修饰，具有非常强的实际应用价值；(3)特异性强：本发明发展了一种革兰氏阳性菌特异性的表面修饰方法，适用于针对革兰氏阳性菌的生化研究；(4)生物相容性好：该修饰方法不会对细菌的活性等生理指标造成影响。

附图说明

图1是本申请修饰方法原理示意图；

图2是本发明所述的修饰方法实现的金黄色葡萄球菌荧光成像图片；

图3是本发明所述的修饰方法实现的光动力抗菌结果；

图4是本发明所述的修饰方法用于对金黄色葡萄球菌进行磁珠分选的结果；

图5是本发明所述的修饰方法用于肉眼可视化检测金黄色葡萄球菌的结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实例，进一步阐明本发明。

以下实施例中的修饰方法原理过程如图1所示，实施例中涉及的原料酪氨酸酶，cy5-酪酰胺，生物素基酪酰胺，链霉亲和素修饰的磁性氧化铁，链霉亲和素-辣根过氧化物酶均可以通过市售获得。

实施例1

所述的修饰方法用于金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的荧光成像，具体步骤如下：收集1ml处于对数生长期的金黄色葡萄球菌菌液，离心处理(5000rpm，5分钟)得到细菌沉淀，用生理盐水清洗细菌3遍。将细菌重悬于985μl生理盐水中，加入10μl酪氨酸酶溶液(2mg/ml)及5μlcy5-酪酰胺溶液(1mg/ml)，室温下震荡反应10分钟。反应完成后，将菌液离心处理，生理盐水清洗2遍，得到cy5标记的金黄色葡萄球菌。

上述方法所得细菌的共聚焦照片见图2。

实验结果表明，该修饰方法能够有效标记金黄色葡萄球菌的细胞壁，实现荧光成像，从而实现革兰氏阴、阳性菌的区分。

实施例2

将实施例1中的酪氨酸酶溶液(2mg/ml)变为酪氨酸酶溶液(1mg/ml)，cy5-酪酰胺溶液(1mg/ml)变为cy3-酪酰胺溶液(20mg/ml)，其他参数与实施例1保持一致。

实施例3

将实施例1中的酪氨酸酶溶液(2mg/ml)变为酪氨酸酶溶液(50mg/ml)，cy5-酪酰胺溶液(1mg/ml)变为cy5-酪酰胺溶液(20μg/ml)，其他参数与实施例1保持一致。

实施例4

评价所述的修饰方法对金黄色葡萄球菌的光动力杀伤效果，具体步骤如下：

收集1ml处于对数生长期的金黄色葡萄球菌菌液，离心处理(5000rpm，5分钟)得到细菌沉淀，用生理盐水清洗细菌3遍。将细菌重悬于0.9ml生理盐水中，加入50μl酪氨酸酶溶液(2mg/ml)及50μl生物素基酪酰胺溶液(1mg/ml)，室温下震荡反应10分钟。反应完成后，将菌液离心处理，生理盐水清洗2遍，得到生物素标记的金黄色葡萄球菌。再向1ml菌液中加入10μl的二氢卟吩e6(ce6)标记的亲和素溶液(1mg/ml)，室温下震荡孵育10分钟。离心去除游离的ce6-亲和素后，将经修饰的金黄色葡萄球菌置于白色led灯下光照5分钟，用平板涂布法评价细菌活性。

上述方法得到的抗菌结果见图3。

实验结果表明，经过该方法修饰的金黄色葡萄球菌能够在光照下被有效杀灭。

实施例5

所述的修饰方法用于金黄色葡萄球菌的磁珠分选，具体步骤如下：

分别收集0.5ml处于对数生长期的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌液。将二者混合后，离心处理(5000rpm，5分钟)得到细菌沉淀，用生理盐水清洗细菌3遍。将细菌重悬于1ml生理盐水中，加入10μl酪氨酸酶溶液(2mg/ml)及10μl生物素基酪酰胺溶液(1mg/ml)，室温下震荡反应10分钟。反应完成后，将菌液离心处理，生理盐水清洗2遍。接下来，向1ml该菌液中加入10μl的链霉亲和素修饰的磁性氧化铁分散液(1mg/ml)，室温下震荡孵育10分钟。为了分离得到金黄色葡萄球菌，将一块普通磁铁置于离心管侧壁，静止2分钟左右，待有明显聚集物后，弃掉管内液体。向离心管内再加入0.5ml生理盐水，重悬细菌，重复上述磁场分离步骤。分离出的金黄色葡萄球菌纯度用lb琼脂平板涂布及伊红美蓝琼脂平板涂布法评价。

上述磁珠分离金黄色葡萄球菌的结果见图4。

实验结果表明，该修饰方法联合磁珠分选法能够有效地从两种细菌混合液中分离出金黄色葡萄球菌。

实施例6

所述的修饰方法用于金黄色葡萄球菌的肉眼可视化检测，具体步骤如下：

分别收集1ml处于对数生长期的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌液，离心处理(5000rpm，5分钟)得到细菌沉淀，用生理盐水清洗细菌3遍。将两种细菌分别重悬于1ml生理盐水中，并加入10μl酪氨酸酶溶液(2mg/ml)及10μl生物素基酪酰胺溶液(1mg/ml)，室温下震荡反应10分钟。反应完成后，将菌液离心处理，生理盐水清洗2遍。接下来，向两种菌液中分别加入10μl的链霉亲和素-辣根过氧化物酶溶液(1mg/ml)，室温下震荡孵育10分钟。修饰结束后，将两种菌液离心清洗2～3遍，除去游离的链霉亲和素-辣根过氧化物酶。之后，吸取少量菌液并加入到含有过氧化氢的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液中，观察颜色变化。

上述金黄色葡萄球菌肉眼可视化检测结果见图5。

实验结果表明，含有金黄色葡萄球菌的检测液变蓝，而含有大肠杆菌的检测液仍然无色透明。