茶籽多肽及其酶解制备方法、抗氧化活性测定方法与流程

本发明涉及多肽制备技术领域，特别涉及一种茶籽多肽及其酶解制备方法、抗氧化活性测定方法。

背景技术：

油茶籽是山茶科山茶属常绿小乔木(camelliaoleiferaabel)的成熟种子，在衰老茶园、有性繁殖茶园、群体品种茶园的产量可年产60万-100万吨。茶籽粕是茶籽经过榨油处理后的渣饼，在化工、农业、食品等方面利用广泛。油茶籽粕中的主要成分是多糖类、茶皂素、粗蛋白、淀粉和茶多酚等，茶籽蛋白可作为一种色氨酸营养强化剂应用到食品中。

有研究表明，蛋白质原料经水解得到的多肽混合物具有比原料蛋白及氨基酸混合物更优越的食品加工性能及营养价值，而且多肽制品通常具有一定的生理保健功能，如抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等。但目前利用油茶籽进行多肽提取和制备工艺的研究仍处于初级阶段，多肽得率较低，难以进行推广应用

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了一种茶籽多肽及其酶解制备方法、抗氧化活性测定方法，具有提高多肽得率的优点。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种茶籽多肽的酶解制备方法，包括：

预处理步骤：对油茶籽粕进行脱脂处理后，在60℃的温度条件下进行烘干、粉碎，过60目筛后，获得油茶籽粕粉；

茶籽蛋白质提取步骤：取油茶籽粕粉加水调制成浆，加入酶制剂进行酶解处理后，用沸水灭酶5min，在8000rpm的转速条件下离心处理10min，再将上清液的ph调至等电点后再次离心处理，取沉淀物冷冻干燥，获得茶籽蛋白，并测定茶籽蛋白的含量；

茶籽多肽制备步骤：取茶籽蛋白用去离子水溶解，调节ph后加入蛋白酶于恒温下进行酶解处理，用沸水灭酶5min，在8000rpm的转速条件下离心处理10min，取上清液以获得茶籽多肽液；

茶籽多肽含量测定步骤：取5.0ml茶籽多肽液，加入5.0ml10％的三氯乙酸水溶液，混匀后静置10min，在4000rpm的转速条件下离心15min，去除其中的蛋白质及大分子长链肽段，再取6.0ml上清液，以gly-gly-tyr-arg为标准品，采用双缩脲法测定上清液中的茶籽多肽含量，并按照标准公式计算多肽得率。

作为本发明的一种优选方案，所述茶籽蛋白质提取步骤中酶制剂为总加酶量300u/g的α-淀粉酶：漆酶为3：2，且料液比为1:25g/ml、ph为5.0，酶解处理过程温度为35℃，酶解处理时长为60min。

作为本发明的一种优选方案，所述茶籽蛋白质提取步骤中测定茶籽蛋白的含量具体包括：

精确称取干燥的茶籽蛋白，用去离子水溶解后，转移至250ml容量瓶中，加水定容，采用考马斯亮蓝法，以牛血清蛋白为标品，以测定茶籽蛋白浓度。

作为本发明的一种优选方案，所述茶籽多肽含量测定步骤中标准公式为：多肽得率＝水解液中的茶籽多肽量/茶籽蛋白质量×100％。

作为本发明的一种优选方案，还包括单因素影响测定步骤，所述单因素影响测定步骤包括：蛋白酶筛选步骤、加酶量对比测定步骤、反应温度对比测定步骤、ph对比测定步骤、以及反应时长对比测定步骤。

作为本发明的一种优选方案，所述蛋白酶筛选步骤具体包括：按照所述茶籽多肽制备步骤中的操作方式依次以胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶作为蛋白酶在40℃的温度下进行酶解处理，并通过测定多肽得率以确定各蛋白酶的酶解处理效果；

所述加酶量对比测定步骤具体包括：以固定料液比1：25，在温度为60℃、ph为8.0的条件下，依次加入100u/g、300u/g、500u/g、900u/g的酶量，进行3h的酶解处理，并通过测定多肽得率以确定各加酶量的酶解处理效果；

所述反应温度对比测定步骤具体包括：以固定料液比1：25，在加酶量为700u/g、ph为8.0的条件下，依次在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下进行3h的酶解处理，并通过测定多肽得率以确定各温度条件的酶解处理效果；

所述ph对比测定步骤具体包括：以固定料液比1：25，在加酶量为700u/g、温度为60℃的条件下，依次在ph为5、6、7、8、9、10的条件下进行3h的酶解处理，并通过测定多肽得率以确定各ph值的酶解处理效果；

所述反应时长对比测定步骤具体包括：以固定料液比1：25，在加酶量为700u/g、温度为60℃、ph为8.0的条件下进行连续6h的酶解处理，每间隔1h取样一次，并通过测定多肽得率以确定各反应时长下的酶解处理效果。

作为本发明的一种优选方案，所述单因素影响测定步骤之后还包括四因素三水平响应面试验，所述四因素三水平响应面试验具体包括：以温度、反应时长、ph、总加酶量为条件变量进行响应面试验，并根据试验结果以多肽得率为响应值，构建条件变量与响应值之间的数学模型并进行方差分析。

作为本发明的一种优选方案，所述四因素三水平响应面试验之后还包括：根据试验结果建立响应值与其中任意两个条件变量之间的响应曲面图和等高线图。

另一方面，本发明还提供一种茶籽多肽抗氧化活性测定方法，包括取上述任一技术方案所述的制备方法制得的茶籽多肽分别进行dpph自由基清除活性实验、羟基自由基清除活性实验和abts自由基清除活性实验。

另一方面，本发明还提供一种茶籽多肽，由上述任一技术方案所述的所述的制备方法制得。

综上所述，本发明与现有技术相比具有如下有益效果：

本发明实施例通过提供一种茶籽多肽及其酶解制备方法、抗氧化活性测定方法，以油茶籽粕为原料，首先采用复合酶辅助提取其中的蛋白质，其次采用蛋白酶水解茶籽蛋白，获取小分子茶籽多肽，并在蛋白酶筛选、单因素影响测定实验基础上，以多肽得率为指标，设计响应面试验对胰蛋白酶酶解茶籽蛋白制取茶籽多肽工艺进行了优化，选取最优工艺参数，使多肽得率达到74.99％，并通过抗氧化活性测试结果表明，通过酶水解方法制备的多肽比原茶籽蛋白抗氧化性更好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例一中不同蛋白酶对茶籽蛋白水解效果的对比图。

图2为本发明实施例一中不同加酶量对多肽得率的影响曲线图。

图3为本发明实施例一中不同酶解温度对多肽得率的影响曲线图。

图4为本发明实施例一中不同ph对多肽得率的影响曲线图。

图5为本发明实施例一中不同酶解时长对多肽得率的影响曲线图。

图6为本发明实施例一中温度与ph的响应面分析图。

图7为本发明实施例一中温度与加酶量响应面分析图。

图8为本发明实施例一中时间与ph响应面分析图。

图9为本发明实施例一中加酶量与时间响应面分析图。

图10为本发明实施例一中加酶量与ph响应面分析图。

图11为本发明实施例一中温度与时间响应面分析图。

图12为本发明实施例一中茶籽蛋白和茶籽多肽的dpph自由基清除率对比图。

图13为本发明实施例一中茶籽蛋白和茶籽多肽的羟基自由基清除率对比图。

图14为本发明实施例一中茶籽蛋白和茶籽多肽的abts自由基清除率对比图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

一种茶籽多肽的酶解制备方法，包括：

s100预处理步骤：对油茶籽粕进行脱脂处理后，使残油含量<1％，在60℃的温度条件下进行烘干、粉碎，过60目筛后，获得油茶籽粕粉，备用。

s200茶籽蛋白质提取步骤：取油茶籽粕粉加水调制成浆，加入酶制剂进行酶解处理后，用沸水灭酶5min，在8000rpm的转速条件下离心处理10min，再将上清液的ph调至等电点后，再次在8000rpm的转速条件下离心处理10min，取沉淀物冷冻干燥，获得茶籽蛋白，并测定茶籽蛋白的含量。

其中，酶制剂为总加酶量300u/g的α-淀粉酶：漆酶为3：2，且料液比为1:25g/ml、ph为5.0，酶解处理过程温度为35℃，酶解处理时长为60min，本实施例中，α-淀粉酶为2万u/g，漆酶为2万u/g。

测定茶籽蛋白的含量具体包括：精确称取干燥的茶籽蛋白，用去离子水溶解后，转移至250ml容量瓶中，加水定容，采用考马斯亮蓝法，以牛血清蛋白为标品，以测定茶籽蛋白浓度，本实施例中所得的茶籽蛋白含量为23.50％。

s300茶籽多肽制备步骤：取茶籽蛋白用去离子水溶解，调节ph后加入蛋白酶于恒温下进行酶解处理，用沸水灭酶5min，在8000rpm的转速条件下离心处理10min，取上清液以获得茶籽多肽液，ph值和恒温酶解处理温度根据选择的蛋白酶确定，本实施例中，蛋白酶可选的有中性蛋白酶(2万u/g)、木瓜蛋白酶(10万u/g)、碱性蛋白酶(10万u/g)、酸性蛋白酶(10万u/g)、胰蛋白酶(4000u/g)等。

s400茶籽多肽含量测定步骤：取5.0ml茶籽多肽液，加入5.0ml10％(w/v)的三氯乙酸水溶液(tca)，混匀后静置10min，在4000rpm的转速条件下离心15min，去除其中的蛋白质及大分子长链肽段，再取6.0ml上清液置于另一试管中，以gly-gly-tyr-arg为标准品，采用双缩脲法测定上清液中的茶籽多肽含量，并按照标准公式计算多肽得率，其中，标准公式为：多肽得率＝水解液中的茶籽多肽量/茶籽蛋白质量×100％，本实施例中，多肽含量以酸可溶性多肽计。

s500单因素影响测定步骤，包括：蛋白酶筛选步骤、加酶量对比测定步骤、反应温度对比测定步骤、ph对比测定步骤、以及反应时长对比测定步骤。

s501蛋白酶筛选步骤具体包括：按照茶籽多肽制备步骤中的操作方式依次以胰蛋白酶(trypsin)、木瓜蛋白酶(papain)、中性蛋白酶(neutralprotease)、碱性蛋白酶(alkalineprotease)和酸性蛋白酶(acidprotease)作为蛋白酶在40℃的温度下进行酶解处理，并在酶解处理时根据各蛋白酶最适条件对酸碱度进行调整，其中，中性蛋白酶的最适ph为7.0、碱性蛋白酶的最适ph为10.5、胰蛋白酶的最适ph为7.5、酸性蛋白酶的最适ph为3.0、木瓜蛋白酶的最适ph为7.0，酶解处理后通过测定多肽得率以确定各蛋白酶的酶解处理效果。

如图1所示，图1示出了不同蛋白酶对茶籽蛋白水解效果的对比图，其中表中标注的不同小写字母表示试验结果之间有显著差异(p＜0.05)；由图1可以看出，胰蛋白酶对茶籽蛋白的水解效果相对最好，其水解液的多肽得率显著高于其他几种蛋白酶，说明胰蛋白酶的肽键选择性对茶籽蛋白的肽键组成及分布有较好的适应性，因此本实施例中选择胰蛋白酶作为酶解处理的蛋白酶。

s502加酶量对比测定步骤具体包括：以固定料液比1：25，在温度为60℃、ph为8.0的条件下，依次加入100u/g、300u/g、500u/g、900u/g的酶量，进行3h的酶解处理，并通过测定多肽得率以确定各加酶量的酶解处理效果。

如图2所示，图2示出了不同加酶量对多肽得率的影响曲线图，由图2结果表明，在其他条件固定后，加酶量显著影响多肽得率。当加酶量在100u/g～700u/g之间，多肽得率随加酶量的增加而不断提高；加酶量超过700u/g后，多肽得率基本维持恒定。这可能是因为随着加酶量的提高，能与底物结合的活性中心也增加，酶催化反应的速率也相应提高，多肽得率增加；当加酶量达到700u/g时，酶与底物比达到了饱和状态，此时的多肽得率不再增加。因此，本实施例中确定酶解的适宜加酶量为700u/g。

s503反应温度对比测定步骤具体包括：以固定料液比1：25，在加酶量为700u/g、ph为8.0的条件下，依次在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下进行3h的酶解处理，并通过测定多肽得率以确定各温度条件的酶解处理效果。

如图3所示，图3示出了不同酶解温度对多肽得率的影响曲线图，由图2表明，在30～60℃温度范围内，多肽得率随温度的升高而增加，温度超过60℃后，多肽得率随之开始降低。一定范围内，温度的升高有利于酶分子催化性能的提升，而酶解温度过高时，酶的构象发生改变，逐渐变性失活，导致酶解效率降低。因此，本实施例中确定60℃为适宜酶解温度。

s504ph对比测定步骤具体包括：以固定料液比1：25，在加酶量为700u/g、温度为60℃的条件下，依次在ph为5、6、7、8、9、10的条件下进行3h的酶解处理，并通过测定多肽得率以确定各ph值的酶解处理效果。

如图4所示，图4示出了不同ph对多肽得率的影响曲线图，由图4结果表明，多肽得率随ph升高而逐渐增加，ph8.0时达到最大值，继续提高ph，多肽得率开始呈现下降趋势。ph是影响酶活力的重要因素之一，可通过改变酶的活性中心或酶与底物的解离状态，继而影响酶与底物的结合，最终影响多肽得率。因此，本实施例中确定酶解适宜的ph为8.0。

s505反应时长对比测定步骤具体包括：以固定料液比1：25，在加酶量为700u/g、温度为60℃、ph为8.0的条件下进行连续6h的酶解处理，每间隔1h取样一次，并通过测定多肽得率以确定各反应时长下的酶解处理效果。

如图5所示，图5示出了不同酶解时长对多肽得率的影响曲线图，由图5结果表明，在酶解开始阶段，多肽得率随着反应时间的延长而上升，水解时间3.5h左右，多肽得率达到最大值；随着酶解时间的进一步延长，多肽得率的增加趋于平缓。过长的酶解时间可能导致部分多肽产物进一步水解生成氨基酸，也会造成多肽得率的下降。因此，本实施例中确定酶解适宜时间为3.5h。

s600四因素三水平响应面试验，四因素三水平响应面试验具体包括：根据单因素影响测定的实验结果，确定各条件变量较优的取值水平后，以多肽得率为指标，以温度、反应时长、ph、总加酶量为条件变量进行响应面试验，并根据试验结果以多肽得率为响应值，构建条件变量与响应值之间的数学模型并进行方差分析。

本实施例中条件变量与水平设计按表1进行：

表1条件变量水平设计表

本实施例中实验安排及结果如表2所示：

表2响应面试验设计及结果

根据表2试验结果，以多肽得率为响应值，温度(a)、反应时长(b)和ph(c)和总加酶量(d)为变量进行曲线拟合，可以构建变量与响应值之间的数学模型：

y＝71.60+1.87a+2.64b+4.83c+4.55d+0.90ab-0.84ac-1.35ad+0.49bc+0.63bd+1.20cd-8.03a2-11.24b2-8.78c2-4.72d2。

接着运用designexpert10.0.4统计分析软件对数学模型及表2中数据进行方差分析，结果如表3所示：

表3回归模型方差分析表

由表3可知，模型极显著(p＜0.01)，模型的相关系数r2为0.9670，模型的失拟项不显著(p＝0.1880＞0.1)，由此说明以上模型对试验结果有非常高的拟合度，模型可用于对各因素取值范围内的试验结果进行预测及优化。对各条件变量项进行显著性分析，其结果显示ph(c)、总加酶量(d)对油茶籽粕水解工艺有极显著的影响。

s700响应面3d图和等高线图的绘制，具体包括：根据试验结果建立响应值与其中任意两个条件变量之间的响应曲面图和等高线图。

响应面分析图是指在其他条件变量水平固定的条件下，响应值与试验中两个条件变量所构成的三维曲面图，可直观地反映各条件变量的相互作用对响应值的影响。通过多元回归方程可知4个条件变量及其交互作用对水解度的影响，该影响可用响应曲面图和等高线图来表示，如图6至图11所示。

根据确立的响应面模型，酶解得到茶籽多肽的最优工艺模型为：酶解温度为63.6℃，酶解时间为3.99h，ph为10.48，总加酶量为1064u/g，在此条件下，茶籽多肽得率为73.79％。为验证本实验的最佳工艺条件，选用酶解温度为63℃、酶解时间为4h、ph为10.5、总加酶量为1064u/g，在此条件下，三次实验所测平均多肽得率为74.99％，实验结果接近预测值，说明响应面法优化提取茶籽多肽的工艺是可行的，该拟合模型适合提取工艺的优化。

本发明实施例以油茶籽粕为原料，首先采用复合酶辅助提取其中的蛋白质，其次采用蛋白酶水解茶籽蛋白，获取小分子茶籽多肽，并在蛋白酶筛选、单因素影响测定实验基础上，以多肽得率为指标，设计响应面试验对胰蛋白酶酶解茶籽蛋白制取茶籽多肽工艺进行了优化，选取最优工艺参数，使多肽得率达到74.99％。

实施例二

一种茶籽多肽抗氧化活性测定方法，包括取实施例一中所述的制备方法制得的茶籽多肽分别进行dpph自由基清除活性实验、羟基自由基清除活性实验和abts自由基清除活性实验。

dpph自由基清除活性实验、羟基自由基清除活性实验和abts自由基清除活性实验的实验步骤采用现有的步骤即可，在此不作赘述。

如图12所示，图12示出了茶籽蛋白和茶籽多肽的dpph自由基清除率对比，由图12可知，茶籽多肽的dpph自由基清除能力呈现浓度依赖性,随其浓度的升高,dpph自由基清除能力同步提高。且相同浓度下，茶籽多肽的dpph自由基清除能力显著高于未水解的茶籽蛋白。茶籽多肽浓度为100mg/l时，对dpph自由基清除率为22.39％，为相同浓度茶籽蛋白的2.3倍。说明茶籽蛋白水解后所得茶籽多肽的dpph清除率有极大提高。

如图13所示，图13示出了茶籽蛋白和茶籽多肽的羟基自由基清除率对比图，由图13可知，茶籽多肽的羟基自由基清除能力整体强于茶籽蛋白，随着质量浓度的增加，对羟基自由基清除能力逐渐提高。茶籽多肽浓度为1.0g/l时，对羟基自由基清除率为70.26％，较同浓度茶籽蛋白提高了36.7％。说明茶籽蛋白水解后的羟基自由基清除率有明显提高。

如图14所示，图14示出了茶籽蛋白和茶籽多肽的abts自由基清除率对比图，由图14可知，茶籽多肽的abts自由基清除能力整体强于茶籽蛋白，随着质量浓度的增加，对abts自由基清除能力缓慢提高。茶籽多肽的abts自由基清除能力高于同浓度下的茶籽蛋白1.2倍-1.8倍。

通过抗氧化活性测试结果表明，通过酶水解方法制备的多肽比原茶籽蛋白抗氧化性更好。

实施例三

一种茶籽多肽，由实施例一的制备方法制得。

以油茶籽粕为原料，采用胰蛋白酶水解法制备茶籽多肽。单因素实验及响应面实验结果分析表明，ph和加酶量对茶籽多肽得率的影响最为显著，其次为酶解时间、酶解温度。多肽制备的最佳工艺参数为ph＝10.5，料液比1:25(w/v)，加酶量1064u/g，酶解时间4.0h，酶解温度63℃，在此最优条件下，多肽得率达到74.99％。随着茶籽多肽浓度的增加，其对dpph自由基清除率、羟基自由基清除率、abts自由基清除率随之提高，其中羟基自由基清除能力最为明显。且整体上茶籽多肽的自由基清除能力显著高于未水解茶籽蛋白，具有优良的抗氧化活性。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。